苗強 夏雨凝 蒙萌 張征宇 馬楚凡

經(jīng)皮鈦種植體在臨床上應用廣泛，如骨錨式助聽器、牙科植入物、頜面贗復體、心室輔助裝置等等，但由于皮膚結(jié)構(gòu)和組成特殊性，如皮脂腺和毛囊的存在，同時體表為有菌環(huán)境，使經(jīng)皮種植體在皮膚整合過程中有著遠高于口內(nèi)種植體的感染率與失敗率［1－2］。

為了解決經(jīng)皮種植體感染率高的問題，許多學者嘗試改變植入物的表面形貌、增大表面積從而增強植入物與經(jīng)皮部位的整合，維持表皮屏障，以減少細菌的侵入、定植，降低感染風險［3－4］。

研究表明，微米級表面可以在植入物與皮膚結(jié)合處形成機械鎖扣結(jié)構(gòu)，阻止上皮下行，從而促進皮膚整合［3］；而納米管結(jié)構(gòu)有助于植入物與皮膚的整合，而且可以裝載藥物，納米管結(jié)構(gòu)本身也有一定的抗菌性能［5］。但是，增大植入物表面積的同時也增加了病原體粘附幾率，不利于感染控制。因此即使經(jīng)過嚴格的消毒與感染控制，經(jīng)皮種植手術之后細菌侵襲仍然常有發(fā)生，經(jīng)皮部位感染主要由金黃色葡萄球菌，凝固酶陰性葡萄球菌引起［6－7］，且種植體經(jīng)皮部位在愈合過程中處于有菌狀態(tài)，因此僅僅依靠改變種植體經(jīng)皮段或經(jīng)皮基臺的表面形貌不足以滿足抗菌需求。

在種植體穿皮膚段進行藥物裝載，提高抗感染能力的同時促進與皮膚的整合，是一種非常有前景的方法。但目前常用的銀離子、化學藥物、抗生素等還存在細胞毒性、耐藥性等問題［8－11］。抗菌肽是一類生物機體產(chǎn)生的自我防御性的小分子多肽，具有高效、廣譜的抗菌性能，且具有較好的生物安全性以及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢［12］；其中抗細菌肽HHC-36具有良好的應用前景。直接在植入體表面加載藥物雖然可以提高抗菌能力，但由于藥物會在很短時間流失、代謝掉，難以在術后的高危感染期保持最小的抑菌濃度，使用效果不佳。因此需要使用高分子聚合物、高分子微球如聚（乳酸-乙醇酸）（PLGA）、聚乳酸乙醇酸酯（PGLA）、聚蘋果酸、石墨烯微膠囊等等作為緩釋劑，來抑制藥物突釋，實現(xiàn)藥物的持續(xù)釋放。其中PDLLA生物相容性好，可降解為對機體無毒、無刺激性的物質(zhì)，是目前最常用的一類緩釋劑［13］。

因此，為解決目前經(jīng)皮鈦種植體感染率高的問題，本試驗使用鈦納米管為載體，研究在其表面構(gòu)筑PDLLA緩釋的HHC-36抗菌涂層的方法，并測試涂層的體外藥物緩釋效果和抗菌性能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

所有試劑均為分析純，購自西安飛揚生物科技有限公司，抗菌肽由上海生工生物工程股份有限公司合成，金黃色葡萄球菌由第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院微生物實驗室提供，穩(wěn)壓電源 （TPR6010S，深圳市安泰信科技有限公司），紫外分光光度計 （UV-1600，上海美譜達儀器有限公司）。

1.1.1 TiO2納米管的制備及抗菌肽裝載 采用陽極氧化法制備二氧化鈦納米管。直徑10 mm、厚1 mm純鈦片，在400ml去離子水中加入5ml HF，一定速度磁力攪拌下，陽極放入鈦片，陰極為碳棒，20 V電壓下陽極氧化處理4 h。

采用溶劑澆鑄法在制備好的二氧化鈦納米管表面加載藥物。精確秤取2.0 g PDLLA，充分溶解于乙酸乙酯中，加入0.1 g抗菌肽，超聲振蕩，形成5%分散均勻的懸濁液，將試件載藥面浸沒在濁液中2 min，取出靜置晾干后再次浸入，重復3次，室溫下過夜干燥，乙酸乙酯揮發(fā)后獲得載藥試件。

1.1.2 緩釋性能的測定 將載藥試件放入1×PBS中，37℃水浴，在不同時間點取出2 ml PBS并補充，第1天0～5 h共取6次，第2～15天每日11：00 AM取樣，通過回歸方程測定取出液中抗菌肽濃度，記錄釋放量。

1.1.3 抗菌性能測試 試件抑菌圈測定：選用金黃色葡萄球菌為指示菌，試驗前將冷凍保存的菌種劃線接種至平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h；挑單菌落接種至100 ml液體培養(yǎng)基，37℃、200 r／min搖床培養(yǎng)過夜，菌液備用。使用預加菌液傾注平板法制備試驗平板，往已冷卻至50℃左右的瓊脂平板培養(yǎng)基中注入一定量的菌液，混合均勻，傾注平板 （約20 ml／平板），水平靜置凝固后備用。

抗菌試驗的試件分為3組，1組為PDLLA復合抗菌肽涂層的試驗組，2組為只加載PDLLA的對照組，3組為未載藥的空白對照組。，以環(huán)氧乙烷消毒，置入含金黃色葡萄菌的MH瓊脂平板中心位置，載藥面對培養(yǎng)基。37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，取出，觀察抑菌效果，并用游標卡尺測量抑菌圈大小。

2 結(jié) 果

2.1 TiO2納米管表面形貌觀察

樣品掃描電鏡觀察結(jié)果（圖1A），可見有序排列的納米管陣列，20 V管徑約為80～120 nm。

載藥后電鏡結(jié)果（圖1B），可見管口藥物覆蓋。

圖1 TiO2納米管表面形貌（掃描電鏡，×50 000）Fig 1 Surface form of the TiO2 nanotube（SEM，×50 000）

2.2 緩釋性能的測定

按實驗方法中所述取樣，結(jié)果見表1。

2.3 抗菌性能測試

在金黃色葡萄球菌平板上裝載試件，獲得了清晰明顯的抑菌圈，且10 d后再次測定，抑菌圈大小基本沒有變化且無細菌長入，抑菌圈大小約15 mm（圖2）。

3 討 論

TiO2納米管制備設備和工藝簡單，適宜于在形狀復雜的物體如種植體表面形成涂層［14］。表面的納米管結(jié)構(gòu)可以提高細胞粘附與增殖［15］，從而更好的與皮膚整合，促進經(jīng)皮封閉［16－17］，納米管結(jié)構(gòu)本身具有一定的藥物裝載能力，同時也具有一定的抗菌性能。

表1 緩釋實驗吸光度及累計釋放百分比Tab 1 Absorbance and cumulated release percent

圖2 抑菌實驗結(jié)果Fig 2 Diameter of the inhibition zone

術后植入物表面不可避免的會有細菌定植并形成細菌生物膜，由于菌膜的存在，生物膜中的細菌耐藥性更高，常規(guī)抗生素治療通常無法減少術后種植體周圍感染率［18－19］。理想的方式是在植入體表面構(gòu)建載藥涂層，使藥物從生物膜內(nèi)部緩釋并持續(xù)作用一段時間，植入體本身雖然有一定的載藥能力，然而其一般沒有控釋能力，難以在術后一定時間的高危感染期保持最小抑菌濃度。HHC-36是一種具有廣譜抗菌能力的抗菌肽，已有實驗證明可以有效殺死經(jīng)皮感染中常見的金黃色葡萄球菌及革蘭氏陽性菌［20］。PDLLA作為植入物涂層的緩釋材料，不僅有良好的生物相容性，且機械穩(wěn)定性良好，具有良好的抗血栓能力［13］。

經(jīng)皮種植體所處皮膚環(huán)境易于細菌附著，有證據(jù)表明即使經(jīng)過嚴格的消毒與感染控制，經(jīng)皮種植手術之后細菌侵襲仍然常有發(fā)生，經(jīng)皮部位感染主要由金黃色葡萄球菌，凝固酶陰性葡萄球菌引起［6－7］?？咕氖且活惙浅Ｓ星熬暗纳锘钚钥咕鷦?，通常為兩親性陽離子肽，抗菌譜廣，其抗菌機制主要為使細菌細胞膜紊亂、抑制其生物大分子合成與表達［21］。Menghan等［22］使用真空輔助的物理吸附方法在80 nm管徑的納米管表面構(gòu)建了HHC-36抗菌肽涂層，HHC-36抗菌活性測試表明其可以有效殺死金黃色葡萄球菌與格蘭氏陽性菌，加載于TiO2納米管表面后周圍細菌滅殺率達到99.9%，且可以有效降低4 h后附著與表面的細菌總數(shù)，抗菌肽還有著幾乎不產(chǎn)生耐藥性的特點［23］。

本實驗在20 V電壓下陽極氧化獲得了管徑為80～120 nm的TiO2納米管試件，并使用了PDLLA作為緩釋劑在TiO2納米管試件表面成功構(gòu)筑了載HHC-36抗菌肽的緩釋涂層，測定了載藥試件15 d的藥物釋放，獲得表1結(jié)果，除第1～2天有一個小幅度突釋，后測試的連續(xù)14 d均有持續(xù)穩(wěn)定的藥物釋放，且15 d藥物釋放比達到了46%，可以認為載藥試件具有良好的緩釋性能。在抑菌圈實驗中可見試件周圍約15 mm左右抑菌圈，且10 d之后測定抑菌圈大小基本沒有變化，抑菌圈內(nèi)也無細菌長入，表明所構(gòu)建載藥試件有持續(xù)有效的抗菌作用。

4 結(jié) 論

在100 nm管徑TiO2納米管試件表面成功構(gòu)建了以PDLLA為緩釋劑的HHC-36抗菌肽涂層，并測定了載藥量與緩釋曲線。對所構(gòu)建載藥試件的抗菌性能做了相關研究，證明了試件具有良好抗菌性能。

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