岑偉明，梁寶環(huán)，黃明蘭，黃媛萍，梁越媚，方鳳媚，隋　洪

(東莞康華醫(yī)院，廣東東莞　523080)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)因具有價格低廉、對儀器要求較低、操作相對簡便等優(yōu)點，目前是臨床實驗室篩選輸血前八項，包括乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)、乙型肝炎核心抗體(HBcAb)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、梅毒螺旋體特異性抗體(TP)和丙型肝炎病毒抗體(HCV)的常規(guī)方法。在三級醫(yī)院評審及ISO15189：2012實驗室質(zhì)量體系和能力的認可中，對試驗方法進行方法學性能驗證是實驗室技術(shù)要求中非常重要的一環(huán)。CNAS- CL39《實驗室質(zhì)量和能力的認可準則在臨床免疫學定性檢驗領(lǐng)域的應用說明》的條款5.5.1.2中，明確規(guī)定檢驗方法和程序的分析性能驗證內(nèi)容應包括檢出限(limit of detection，LoD)、符合率[1]。本實驗室根據(jù)上述要求，結(jié)合實際工作環(huán)境，應用2017年衛(wèi)計委新發(fā)布的WS/T 514- 2017：《臨床檢驗方法檢出能力的確立和驗證》行業(yè)標準文件中的概率單位方案對上述項目建立了檢出限并進行評價，具體如下：

1　材料和方法

1.1實驗樣本北京康徹斯坦生物科技有限公司生產(chǎn)的標準物質(zhì)8種，分別為HBsAg(濃度0.5 IU/ml)，HBsAb(濃度30 mIU/ml)，HBeAg(濃度2 NCU/ml)，HBeAb(濃度4 NCU/ml)，HBcAb(濃度1 IU/ml)，HIV(濃度0.5 NCU/ml)，TP(濃度6 mIU/ml)，HCV(濃度1 NCU/ml)。上述試劑盒及標準物質(zhì)均按說明書要求保存，在有效期內(nèi)使用。采用北京康徹斯坦生物科技有限公司提供的陰性標準物質(zhì)進行稀釋。

1.2試劑和儀器試劑：國產(chǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb，HIV，TP和HCV試劑盒，共8種試劑盒，每種試劑均有兩個批號的試劑盒。儀器：TECAN SUNRISE酶標儀，上海一恒電熱恒溫水箱，匯松全自動酶標洗板機PW- 960。所有儀器均按ISO15189質(zhì)量體系要求進行校準。

1.3評價方法

1.3.1LoD的建立：根據(jù)衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T 514- 2017：《臨床檢驗方法檢出能力的確立和驗證》中的概率單位方案設計實驗方案。

1.3.1.1按一定倍數(shù)稀釋已知濃度標準物質(zhì)，每個稀釋度的標本嚴格按照試劑說明書進行實驗操作，重復測定三次，取S/CO平均值為1附近的濃度值，根據(jù)其S/CO平均值來確定5個評估濃度值。在同一套檢測系統(tǒng)中，使用2個試劑批號連續(xù)4天對這5個評估濃度值標本，每個批號每個標本每天重復檢測5次。

1.3.1.2選擇估計LoD的β錯誤風險為0.05，即命中率為95%，對應的概率單位為1.645。

1.3.1.3收集數(shù)據(jù)，計算每個批號的5個評估濃度值標本的命中率，根據(jù)《百分比與概率單位對照表》將其轉(zhuǎn)換為概率單位，然后以此為橫坐標，以濃度值的對數(shù)值為縱坐標繪制散點圖，制作回歸模型，得到回歸曲線方程，將命中率為95%對應的概率單位1.645代入方程式中，所得的濃度值即為LoD估計值。

1.3.1.4將兩個試劑批號的LoD估計值作比較，取所得的LoD估計值的最大值作為測量程序的最終LoD估計值。

1.3.2LoD的驗證：根據(jù)衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T 514- 2017：《臨床檢驗方法檢出能力的確立和驗證》中的“LoD聲明的驗證”部分的要求，設計實驗方案如下：連續(xù)3天檢測對2個LoD聲明濃度附近的標本(由標準物質(zhì)稀釋所得)重復檢測4次，所有數(shù)據(jù)來源于1個儀器系統(tǒng)和1個批號的試劑。收集數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計算≥LoD聲明的陽性結(jié)果百分比，將該百分比與WS/T 514- 2017：《臨床檢驗方法檢出能力的確立和驗證》中的附錄E“測量結(jié)果總數(shù)與臨界值觀察比例對照表”中對應的臨界值(本次實驗的條件下，該臨界值為87%)比較，若該百分比≥臨界值，則驗證成功，否則驗證失敗。

1.4統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均用EXCEL表進行記錄及計算處理。

2　結(jié)果

2.1檢出限的建立過程及結(jié)果

2.1.1稀釋標準物質(zhì)，測得S/CO值為1附近的濃度：HBsAg 0.10 IU/ml(S/CO值為1.09)，HBsAb 10.0 mIU/ml(S/CO值為1.06)，HBeAg 0.67 NCU/ml(S/CO值為1.01)，HBeAb 3.50 NCU/ml(S/CO值為1.06)，HBcAb 0.80 IU/ ml(S/CO值為0.97)，HCV 0.50 NCU/ml(S/CO值為1.03)，TP 2.00 mIU/ml(S/CO值為0.94)和HIV 0.13 NCU/ml(S/CO值為1.09)。根據(jù)上述結(jié)果，選擇各項目的評估濃度為HBsAg(IU/ml)：0.092，0.094，0.096，0.098，0.100；HBsAb(mIU/ml)：8，8.5，9，9.5，10；HBeAg(NCU/ml)：0.60，0.62，0.64，0.66，0.68；HBeAb(NCU/ml)：3.50，3.55，3.60，3.65，3.70；HBcAb(IU/ml)：0.72，0.74，0.76，0.78，0.80；HCV(NCU/ml)：0.42，0.44，0.46，0.48，0.50；TP(mIU/ml)：2.00，2.05，2.10，2.15，2.20；HIV(NCU/ml)：0.110，0.115，0.120，0.125，0.130。

2.1.2各項目各濃度測定命中率及LoD估計值：見表1及表2。

根據(jù)表1和表2的結(jié)果，將兩個批號試劑的LoD作比較，取所得的LoD最大值作為測量程序的最終LoD估計值，得出各個項目的LoD估計值為：HBsAg：0.100 IU/ml，HBsAb：9.642 mIU/ml，HBeAg：0.666 NCU/ml，HBeAb：3.700 NCU/ml，HBcAb：0.786 IU/ml，HCV：0.506 NCU/ml，HIV：0.135 NCU/ml，TP：2.236 mIU/ml。

2.2檢出限的驗證見表3。

表1 各項目批號1測試結(jié)果

表2 各項目批號2測試結(jié)果

表3 各項目LoD估計值驗證結(jié)果

3　討論

臨床輸血是臨床治療的重要組成部分，是搶救的重要手段之一，但輸血的同時也會傳播危害極其嚴重的疾病[2]，其中最嚴重的是艾滋病、病毒性乙型肝炎和丙型肝炎。為減少和避免醫(yī)院感染和醫(yī)療糾紛，輸血前對患者進行上述病毒的檢測顯得十分重要[3]。為此，臨床實驗室對其檢驗方法和程序的分析性能合理選擇方法學驗證試驗，系統(tǒng)設計方法學驗證方案，以保證實驗結(jié)果的準確性。

評價實驗室檢驗方法的檢出能力的性能指標主要有空白限(limit of blank，LoB)及檢出限。以往測定檢出限的方案是以健康人群血清為空白樣本做重復測定，計算這些結(jié)果的平均值及標準差，以平均值加3個標準差作為LoD值，這種方案由于其沒有區(qū)分統(tǒng)計數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布或偏態(tài)分布，容易引起統(tǒng)計錯誤而被淘汰。美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)在2004年發(fā)布的《確定檢出低限和定量檢測限的方案》(EP17- A)[4]文件推薦用空白及系列低濃度的樣本連續(xù)數(shù)天檢測至少60次，并根據(jù)數(shù)據(jù)為正態(tài)分布或偏態(tài)分布分別采用不同的公式來計算空白限、檢出限，結(jié)果更加可靠，國內(nèi)外學者以此作為標準對不同項目檢出限進行建立及驗證[5～7]，但CLSI EP17- A文件的方案在操作上更適用于定量檢驗程序，對于定性檢驗程序在2017年以前國內(nèi)并沒有適用的完整而標準的檢出限建立及驗證方法標準文件。2017年1月15日衛(wèi)計委發(fā)布了衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T 514- 2017：《臨床檢驗方法檢出能力的確立和驗證》，對檢出限的建立及驗證起到了極其重要的指導作用，其中的概率單位方案[8]適用于檢出能力以比例(陽性結(jié)果數(shù)/重復檢測的總數(shù))的形式表示的定性檢驗程序，由于這種檢驗程序沒有陰性標本結(jié)果的分布，因為此類結(jié)果通常報告為0，這種情況下，空白標本檢測結(jié)果的第95百分位數(shù)為0，LoB是測量空白標本時可能得到的最高檢出結(jié)果[9]，按定義設為0，故本次驗證中無LoB的內(nèi)容。LoD是檢測方法可以檢測出的最低被測物濃度[10]，本文根據(jù)最新的行業(yè)標準文件的要求建立了相關(guān)項目的LoD估計值，并對這些LoD估計值進行了驗證，驗證結(jié)果通過，表明各個項目在檢測對應的檢出限濃度以上的標本時，可以為臨床提供穩(wěn)定可靠的結(jié)果。

另外需要說明的是，WS/T 514- 2017：《臨床檢驗方法檢出能力的確立和驗證》行業(yè)標準有關(guān)LoD聲明驗證的條款中，僅說明“使用2個LoD聲明濃度附近的標本”，并沒有明確要求驗證標本濃度的合適范圍，讓人困惑。本次評估根據(jù)實驗室的實際情況選擇了比LoD聲明濃度值高5%左右的濃度值進行驗證。此方法恰當與否，歡迎各位同行討論及指正。

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