王紅，馬波，盛琴，周裕卿，彭玉蘭

?

經(jīng)皮恒河猴肝纖維化模型超聲引導(dǎo)下肝臟穿刺介紹

王紅1，馬波2，盛琴2，周裕卿1，彭玉蘭1

(1. 四川大學(xué)華西醫(yī)院超聲科，四川成都 610041；2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)中心，四川成都 610041)

目的：觀察超聲引導(dǎo)下恒河猴肝穿刺活體組織檢查技術(shù)在動物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用情況，探討超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮恒河猴肝臟穿刺活檢的價(jià)值和意義。方法：采用PHILIPS iU22超聲儀、9～3 MHz探頭、Bard 16G活檢槍及活檢針對22只恒河猴肝纖維化疾病進(jìn)行穿刺，對穿刺組織進(jìn)行病理檢查。結(jié)果：22只恒河猴均穿刺成功，病理學(xué)染色良好，能夠進(jìn)行肝臟疾病的病理分析和診斷。結(jié)論：在動物實(shí)驗(yàn)中，超聲引導(dǎo)下肝臟穿刺活檢術(shù)是一項(xiàng)微創(chuàng)、安全、方便的取材方法，能確定肝臟損害的病理性質(zhì)，對實(shí)驗(yàn)動物疾病模型診斷和治療有重要的臨床價(jià)值。

超聲引導(dǎo)；肝臟；穿刺；恒河猴

0 引言

在動物實(shí)驗(yàn)中，非人類靈長類動物由于其組織結(jié)構(gòu)、生理和代謝功能同人類高度近似，常被認(rèn)為是研究人類疾病模型和疾病相關(guān)問題的理想動物模型。其中，恒河猴(Macacamalatta，Rhesus Macaque)作為非常重要的擬人類實(shí)驗(yàn)動物，目前已經(jīng)有越來越多的學(xué)者和科研工作者認(rèn)識到其在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等研究領(lǐng)域的重要性[1-3]。而肝臟，作為非常重要的消化系統(tǒng)臟器之一，同時(shí)也是重要的造模器官和藥物實(shí)驗(yàn)的靶器官，其結(jié)構(gòu)及功能都較為復(fù)雜。目前對于恒河猴肝臟疾病模型的研究較多，包括如恒河猴肝移植實(shí)驗(yàn)、恒河猴肝纖維化、恒河猴肝臟腫瘤等疾病模型[4-8]。而這些疾病模型的評估需要經(jīng)過對動物實(shí)驗(yàn)的檢驗(yàn)。在對恒河猴肝臟疾病模型的研究中，科研人員常需要對動物疾病模型進(jìn)行長期的觀察及跟蹤研究。病理作為疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在動物實(shí)驗(yàn)的研究過程中也發(fā)揮著巨大的作用。在進(jìn)行恒河猴肝臟疾病模型變化的長期動態(tài)實(shí)驗(yàn)觀察中，由于受到動物疾病模型與實(shí)驗(yàn)客觀條件的限制，在對這些疾病模型的病理分析和診斷時(shí)，科研人員大多通過對肝臟組織進(jìn)行盲穿或手術(shù)取材的方法得到肝組織，進(jìn)行病理等研究。而盲穿的方法受穿刺者經(jīng)驗(yàn)及動物個(gè)體差異性的影響較大，在實(shí)際運(yùn)用中，效果參差不齊。而手術(shù)取材的方法，對實(shí)驗(yàn)動物創(chuàng)傷較大，術(shù)后護(hù)理及恢復(fù)較復(fù)雜，且易導(dǎo)致各類并發(fā)癥，不利于疾病模型動物的長期觀察。參考在臨床上的實(shí)際運(yùn)用情況，超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮的肝臟活體組織穿刺技術(shù)由于其具有創(chuàng)傷小、術(shù)后恢復(fù)較好的特點(diǎn)，在臨床中此項(xiàng)技術(shù)已較為成熟，并得到了廣泛使用[9]。而目前的現(xiàn)狀是，由于國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室條件限制以及科研人員對經(jīng)皮超聲引導(dǎo)下肝臟穿刺技術(shù)的經(jīng)驗(yàn)不足，在科研實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)時(shí)顯像的超聲技術(shù)在動物實(shí)驗(yàn)尤其是在實(shí)驗(yàn)動物活體組織穿刺取材上的運(yùn)用較少。本文對本實(shí)驗(yàn)室近兩年來共22只實(shí)驗(yàn)動物恒河猴肝臟疾病模型在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行的經(jīng)皮超聲穿刺檢查技術(shù)進(jìn)行總結(jié)，并對其診斷價(jià)值進(jìn)行評價(jià)，探討超聲引導(dǎo)下活體組織檢查技術(shù)在恒河猴肝臟病變中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

22只恒河猴(年齡為4～6歲，體重為4.4～9.8 kg)由四川成都平安動物繁育研究基地提供。飼育條件，室內(nèi)溫度為(21±5)℃，濕度為(55±15)%。猴精飼料每日2次，水果或蔬菜每日1次，自由飲水。精神、食欲正常，健康狀況良好。22只雄性恒河猴肝纖維化疾病模型，其中10只動物為硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)誘導(dǎo)的恒河猴肝纖維化疾病模型，造模方法參考文獻(xiàn)[10]；12只動物為通過開腹手術(shù)形成膽汁淤積性肝纖維化模型，造模方法參考劉迎春等的研究文獻(xiàn)[11]。在硫代乙酰胺誘導(dǎo)的恒河猴肝纖維化疾病模型中，穿刺時(shí)間為注射藥物3個(gè)月后；在梗阻型肝纖維化模型中，穿刺時(shí)間為術(shù)后2個(gè)月，結(jié)合我們的前期研究認(rèn)為，此時(shí)恒河猴肝臟發(fā)生病理改變。實(shí)驗(yàn)中所有動物相關(guān)操作均通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)審查。

1.2 方 法

超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮恒河猴肝穿刺活檢，在本實(shí)驗(yàn)中使用PHILPS iU22超聲儀、9～3 MHz探頭及固定導(dǎo)向穿刺架。穿刺槍為美國Bard公司生產(chǎn)的第3代連續(xù)可調(diào)式自動活檢槍，射程為1.5～2.2 cm，配以Bard 16Ｇ一次性穿刺針(長度為160 mm,取樣槽長度為19 mm；取樣針外徑為1.60 mm，內(nèi)徑為1.19 mm)。對恒河猴用氯胺酮5 mg/kg(ketamine)和0.2 mg/kg咪達(dá)唑侖誘導(dǎo)麻醉，麻醉后脫去肝區(qū)體毛。皮膚常規(guī)消毒、鋪洞巾等常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備。穿刺前先進(jìn)行B-Mode超聲檢查，將儀器的增益、焦距、深度等各項(xiàng)參數(shù)調(diào)節(jié)至最佳位置，以獲得最優(yōu)分辨率的超聲圖像。結(jié)合穿刺者經(jīng)驗(yàn)，在本實(shí)驗(yàn)中均選取恒河猴右肝肋間進(jìn)行穿刺，多斷面連續(xù)掃查，盡量避開肝內(nèi)大血管及擴(kuò)張的膽管、腫大的膽囊，確定穿刺安全路徑，并做體表標(biāo)記。這時(shí)將探頭固定，使圖像保持最佳狀態(tài)。穿刺點(diǎn)先用手術(shù)刀做2 mm切口，取16G穿刺針沿固定導(dǎo)向穿刺架的針槽刺入，當(dāng)穿刺針穿破肝包膜進(jìn)入肝組織時(shí)，會有較為清晰的“落空感”。實(shí)時(shí)監(jiān)測穿刺針進(jìn)入肝臟情況，待穿破包膜刺入一段肝實(shí)質(zhì)后(約2 cm)，啟動穿刺針取長約2 cm的肝組織１條。按照免疫組化及病理需要，重復(fù)同樣的方法反復(fù)穿刺取肝組織2～3條。穿刺完畢后紗布按壓傷口10～15 min，以防止出血。穿刺完成后超聲檢查肝周有無出血。所得肝組織均置于中性甲醛液中固定。4 h后取出組織塊，脫水、石蠟包埋、切片染色后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。待動物蘇醒后連續(xù)三天觀察動物進(jìn)食、行為等有無異常。穿刺過程中恒河猴肝周無明顯出血；術(shù)后連續(xù)觀察三天實(shí)驗(yàn)動物未發(fā)現(xiàn)飲食及其他行為異常；穿刺取材的組織病理染色清晰，可以用于疾病的診斷。滿足上述三點(diǎn)認(rèn)為穿刺成功。

2 結(jié)果

22只恒河猴共進(jìn)行56次肝臟穿刺，成功獲得55條肝組織，1例失敗。失敗的原因?yàn)槟懼俜e性肝纖維化模型中，恒河猴肝內(nèi)膽管明顯擴(kuò)張，膽囊腫大，導(dǎo)致在肝臟穿刺的過程中未能成功完全避開梗阻擴(kuò)張的肝內(nèi)膽管，穿刺出的組織中發(fā)現(xiàn)有墨綠色的液體，考慮為膽汁，認(rèn)為穿刺失敗。超聲引導(dǎo)下恒河猴肝臟肝組織檢查如圖1所示，成功率為98%。采用右肝低位肋間進(jìn)行超聲活體組織穿刺檢查，能夠較為完整地觀察到穿刺針的走行與針尖的位置，以及針尖距肝包膜的距離，成功率為98%。術(shù)后超聲觀察發(fā)現(xiàn)僅3例肝周少量出血。病理結(jié)果顯示，在蘇木素(Hematoxylin)-伊紅(Eosin)染色及天狼星紅染色中，能夠清晰顯示肝細(xì)胞形態(tài)，觀察炎性細(xì)胞浸潤與膠原纖維情況及肝臟纖維化程度如圖2所示。

圖1 超聲引導(dǎo)下恒河猴肝臟穿刺圖像

圖2 恒河猴肝臟病理圖片

3 討論

肝臟是體內(nèi)最重要也是最大的消化腺，作為理想實(shí)驗(yàn)動物類型的非人類靈長類動物恒河猴，其肝臟的正常組織學(xué)結(jié)構(gòu)與人基本相似[1,12]。在解剖結(jié)構(gòu)上，恒河猴肝臟分為6葉，各葉之間較為獨(dú)立，由肝小葉和肝門管區(qū)構(gòu)成。與人相比，在肝臟外形上的主要區(qū)別在于肝葉的愈合程度不一。在肝內(nèi)門靜脈系統(tǒng)、膽道系統(tǒng)的分支上基本相似，但在分支的角度、粗細(xì)、長短及分布范圍、分支數(shù)量上略有差別[12]。恒河猴肝臟位置表淺，體積較大，在超聲多斷面連續(xù)掃查引導(dǎo)下能夠避開較大的膽管及血管，穿刺操作安全、簡便。這一點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)中12只通過手術(shù)造成恒河猴膽總管狹窄制備的膽汁淤積性肝纖維化模型中，其常規(guī)超聲可見肝內(nèi)呈“樹枝”狀擴(kuò)張的肝內(nèi)膽管，最大管徑約7 mm，可見腫大的膽囊，肝臟體積長大，這些較為復(fù)雜的超聲現(xiàn)象使得超聲引導(dǎo)下肝臟取材的方法具有較大的意義。當(dāng)然，準(zhǔn)確的超聲導(dǎo)向是保證穿刺安全性的前提。在實(shí)驗(yàn)中，動物雖然為麻醉狀態(tài)，但由于恒河猴肝臟位置受呼吸、心臟運(yùn)動影響較大，且恒河猴肝臟各葉較為獨(dú)立，操作過程中需要嚴(yán)格控制穿刺方向、角度和深度。考慮到由于恒河猴左肝位置受胃及心臟運(yùn)動、呼吸的影響較大，且動物在穿刺時(shí)不能配合屏氣動作，為了獲得最大的取材成功率以減少實(shí)驗(yàn)動物穿刺針數(shù)，在超聲引導(dǎo)下，基于能夠較好地觀察到穿刺針在肝內(nèi)的走行，以及能夠較好地觀察到穿刺針針尖距肝包膜的距離，結(jié)合穿刺者經(jīng)驗(yàn)，最終我們選取了右肝低位肋間進(jìn)行超聲活體組織穿刺檢查，且成功獲得了連續(xù)性較好的肝組織。在操作中也發(fā)現(xiàn)，恒河猴肝臟體積、形態(tài)存在一定的個(gè)體差異，且由于疾病模型造模方式的不同，不同體重、不同梗阻程度的恒河猴最佳穿刺點(diǎn)也會有所變化。這也提示我們在超聲掃查時(shí)需進(jìn)行多斷面連續(xù)觀察，結(jié)合實(shí)驗(yàn)動物疾病模型，盡量獲得較佳的穿刺點(diǎn)，確定安全的穿刺路徑。且在穿刺完成后，需超聲觀察肝周有無出血，待蘇醒后還需觀察動物進(jìn)食、行為等是否有異常。目前有關(guān)恒河猴肝纖維化疾病模型的研究較多，但并未建立較為經(jīng)典的造模方法[13-14]。在本實(shí)驗(yàn)中，病理結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)誘導(dǎo)恒河猴肝纖維化疾病模型和通過手術(shù)造成實(shí)驗(yàn)動物膽總管狹窄制備的恒河猴膽汁性肝硬化模型的可行性。

超聲引導(dǎo)下進(jìn)行恒河猴肝組織活體穿刺檢查具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：(1) 定位準(zhǔn)確，實(shí)時(shí)顯示，可動態(tài)顯示活檢針進(jìn)針取材的全部過程，以及評估穿刺針與周圍肝組織的位置關(guān)系，大大提高了穿刺的成功率。與盲穿相比，提高了取材成功率。(2) 采用自動活檢槍避免了穿刺過程中的不穩(wěn)定性，所取組織標(biāo)本具有較好的連續(xù)性、完整性，有利于后續(xù)病理檢查和分型。(3) 安全微創(chuàng)，可重復(fù)穿刺，術(shù)后恢復(fù)較好。且方便術(shù)后對穿刺可能導(dǎo)致的出血進(jìn)行觀察。粗針活檢穿刺與手術(shù)活檢相比，取材的組織方便進(jìn)行進(jìn)一步的病理學(xué)觀察，且能較好地保證動物福利，善待動物，防止或減少動物的應(yīng)激、傷害，有利于進(jìn)行恒河猴動物疾病模型變化的長期動態(tài)觀察與研究。

4 結(jié)論

超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮恒河猴肝臟活體組織穿刺檢查技術(shù)，在取材成功率、安全性、術(shù)后護(hù)理等方面相比盲穿或手術(shù)取材具有顯著的優(yōu)勢，且能夠提供肝臟疾病較為完整全面的定性信息，包括肝臟損傷類型和程度。這些優(yōu)點(diǎn)使得此項(xiàng)技術(shù)在對實(shí)驗(yàn)動物模型的觀察、治療及判斷預(yù)后等方面均具有重要的意義，能夠極大地提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)動物福利的完善。這也提示我們在動物實(shí)驗(yàn)中開展這項(xiàng)技術(shù)的必要性。

[1] 冉江華, 李鑄, 劉靜, 等. 二袖套法建立恒河猴原位肝移植的穩(wěn)定模型[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2011, 15(5): 762-768. RAN Jianghua, LI Zhu, LIU Jing, et al. Construction of stable rhesus monkey orthotopic liver transplantation models using two-cuff technique[J]. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, 2011, 15(5): 762-768.

[2] LEE J I, SHIN J S, LEE J E, et al. Reference values of hematology, chemistry,electrolytes, blood gas, coagulation time, and urinalysis in the Chinese rhesus macaques(Macacamulatta)[J]. Xenotransplantation, 2012, 19(4): 244-248.

[3] WANG Hong, HAN Pengfei, SUN Xiaorong, et al. Detection of hepatic hemodynamics in normal rhesus monkeys using high-frequency ultrasound[J]. Ultrasound in Med. & Biol., 2014, 40(4): 837-842.

[4] WANG Hong, TAN Tao, WANG Junfeng, et al. Rhesus monkey model of liver disease reflecting clinical disease progression and hepatic geneexpression analysis[J]. Scientific RepoRts, 2015, 7(5): 15019-15024.

[5] KIM J M, SHIN J S, MIN B H, et al. Induction, management, and complications of streptozotocin-induced diabetes mellitus in rhesus monkeys[J]. Xenotransplantation, 2016, 23(6): 472-478.

[6] SCULL M A, SHI C, DE JONG Y P, et al. Hepatitis c virus infects rhesus macaque hepatocytes and simianized mice[J]. Hepatology, 2015, 62(1): 57-67.

[7] 趙璽龍, 李學(xué)鋒, 陳碉, 等. 不同年齡實(shí)驗(yàn)恒河猴自然死亡的肝臟病變譜分析[J]. 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào), 2011, 19(3): 228-232. ZHAO Xilong, LI Xuefeng, CHEN Diao,et al. Analysis of liver pathology in captive rhesus monkeys at different ages[J]. Act a Laboratorium Animalis Scientia Sinica, 2011, 19(3): 228-232.

[8] ZHOU P,XIA J,GUO G,et al. A macacamulatta model of fulminant hepatic failure[J]. World J Gastroenterol,2012, 18(5): 435-444.

[9] 張景山, 鄭永. 超聲引導(dǎo)下肝臟穿刺107例的臨床分析[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2011, 40(7): 697-698. ZHANG Jingshan, ZHENG Yong. Clinical analysis of 107 cases Ultrasound guided liver biopsy[J]. Chongqing Medicine, 2011, 40(7): 697-698.

[10] 孟令平, 鄒彪，李楊，等. 硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝硬化增生結(jié)節(jié)模型的評價(jià)[J]，中華臨床醫(yī)師雜志, 2012, 6(13): 171-172. MENG Lingping, ZOU Biao, LI Yang,et al. Evaluation of thioacetamide induced rat liver cirrhosis hyperplastic nodule model[J]. Chinese Journal of Clinicians, 2012, 6(13): 171-172.

[11] 劉迎春, 顧小紅. SD大鼠膽汁淤積性肝纖維化動物模型的建立與評價(jià)[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2012, 41(5): 458-460. LIU Yingchun, GU Xiaohong. Establishment and evaluation of cholestatic liver fibrosis model induced by bile duct ligation in SD rat[J]. Chongqing Medicine, 2012, 41(5): 458-460.

[12] 陳嘉績. 哺乳動物肝內(nèi)門管鞘系統(tǒng)的相似性和肝臟類型[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2002, 8(2): 122-125. CHEN Jiaji. Similarity of glisson’s system and classification of livers in mammals[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2002, 8(2): 122-125.

[13] 劉玲, 譚正懷. 膽總管結(jié)扎致肝纖維化動物模型研究現(xiàn)狀[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2013, 42(23): 2793-2796. LIU Ling, TAN Zhenghuai. Common bile duct ligation induced liver fibrosis animal model research status[J]. Chongqing Medicine, 2013, 42(23): 2793-2796.

[14] 侯艷鋒, 李暉, 梁穎丹, 等. 肝纖維化動物模型研究進(jìn)展[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2015, 36(1): 155-158. HOU Yanfeng, LI Hui, LIANG Yingdan,et al. Research progress of liver fibrosis of animal model[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2015, 36(1): 155-158.

Aanalysis of ultrasound guided percutaneous rhesus monkey liver biopsy

WANG Hong1, MA Bo2, SHENG Qin2, ZHOU Yu-qing1,PENG Yu-lan1

(1. Department of Ultrasound,West China Hospital, Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan, China;2.Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan, China)

Objective: To observe the application of ultrasound guided percutaneous biopsy of rhesus monkey liver in animal experiments and to explore the value and significance of this technology. Method: Using PHILPS IU22 ultrasound diagnostic instrument with a 9～3MHz probe and Bard 16 G biopsy gun and biopsy needle to perform liver biopsy for 22 rhesus monkeys with liver fibrosis disease, and then making pathological examination to these biopsy tissues. Results: All these punctures to the 22 rhesus monkeys are successful. Pathological dyeing is good, and the pathological changes of liver diseases can be analyzed and diagnosed. Conclusion: Ultrasound guided liver biopsy is a minimally invasive, safe and convenient examination method, which can determine the pathological nature of liver injury and has important clinical value in the diagnosis and treatment of experimental animal disease models.

ultrasound guided percutaneous biopsy; liver; puncture; Rhesus monkeys

TB559

A

1000-3630(2018)-01-0062-04

10.16300/j.cnki.1000-3630.2018.01.011

2017-04-21;

2017-06-16

王紅(1986－), 女, 四川廣安人, 醫(yī)師, 研究方向?yàn)槌曖t(yī)學(xué)影像技術(shù)。

彭玉蘭, E-mail: ylphuaxi@163.com