蔣海明，　李　俠，　劉振旺，　張　鵬，　李　玲，　趙宏宇

(內(nèi)蒙古科技大學(xué) a. 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；b. 礦業(yè)研究院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

0　引　言

厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，作用也日益引起重視。厭氧微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵是要使該類微生物接種及培養(yǎng)時(shí)都處于無氧的環(huán)境中。目前，厭氧微生物培養(yǎng)一般采用堿性焦性沒食子酸法[1-3]、皰肉培養(yǎng)基法[4-6]、厭氧罐培養(yǎng)法[4，7]及厭氧手套箱[8-9]。堿性焦性沒食子酸法無需特殊及昂貴的設(shè)備，操作簡單，適于任何可密封的容器，可迅速建立厭氧環(huán)境，而其缺點(diǎn)是在氧化過程中會產(chǎn)生少量的一氧化碳，對某些厭氧菌的生長有抑制作用。皰肉培養(yǎng)基法常用于厭氧微生物的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，且通用性較差，只能適用特定厭氧微生物的培養(yǎng)。厭氧罐不能實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基配制、微生物接種環(huán)節(jié)的厭氧環(huán)境，只能保證培養(yǎng)過程的厭氧環(huán)境。厭氧培養(yǎng)箱雖既可用于厭氧微生物培養(yǎng)，也能厭氧微生物接種，但也存在許多不足，如操作不方便、儀器昂貴、體積較大、不適合極端厭氧微生物(如海底菌種、深層土壤菌種)培養(yǎng)以及不能恒溫，也不能制備厭氧培養(yǎng)基。針對堿性焦性沒食子酸法與皰肉培養(yǎng)基法培養(yǎng)基制備過程中存在的不足，開發(fā)了厭氧培養(yǎng)基制備裝置[10-12]，但這些裝置沒有設(shè)計(jì)脫氧裝置，無法滿足嚴(yán)格厭氧微生物的生長，且無法實(shí)現(xiàn)接種。于東寧等[13-14]開發(fā)了厭氧微生物接種裝置及厭氧微生物培養(yǎng)系統(tǒng)，但這些裝置同樣沒有設(shè)計(jì)脫氧裝置，無法滿足嚴(yán)格厭氧微生物的生長，且無法實(shí)現(xiàn)厭氧培養(yǎng)基制備。此外，這些裝置不易實(shí)現(xiàn)不同培養(yǎng)氣氛的變化。

針對現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室厭氧微生物培養(yǎng)技術(shù)及裝置存在的問題，本文研究設(shè)計(jì)了一種厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)裝置，該裝置體積小、制作簡單、易于操作，可在空氣中自由操作等優(yōu)點(diǎn)，適用于各種環(huán)境的厭氧微生物的培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)。本裝置為我?！拔⑸飳W(xué)”“環(huán)境微生物技術(shù)”及“發(fā)酵工程”的實(shí)驗(yàn)教學(xué)創(chuàng)造了良好的實(shí)驗(yàn)平臺并取得了很好的效果。

1　厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置設(shè)計(jì)與制備

1.1　厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置設(shè)計(jì)

根據(jù)厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)的要求和特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)裝置，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

鋼瓶中的N2、CO2或H2/CO2經(jīng)減壓閥、氣體流量計(jì)及三通閥后進(jìn)入高溫帶紫銅絲的密封玻璃管中脫氧，然后分成兩路，一氣路為厭氧接種，另一氣路為厭氧培養(yǎng)基制備及厭氧培養(yǎng)。通過調(diào)節(jié)調(diào)壓閥、氣體流量計(jì)及三通閥，可以制備不同氣氛的厭氧培養(yǎng)基及適應(yīng)不同氣氛與極端環(huán)境的厭氧微生物培養(yǎng)。

圖1厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖

1.氣體鋼瓶；2.鋼瓶減壓閥；3.外徑1/8′不銹鋼管；4.浮子氣體流量計(jì)；5.卡套式三通接頭；6.卡套式三通球閥；7.橡膠管；8.電線；9.玻璃纖維發(fā)熱絲；10.紫銅絲；11.玻璃管；12.整體式閥帽針閥；13.撥動開關(guān)閥；14.橡膠管；15.14G不銹鋼針頭；16.厭氧瓶；17.玻璃注射器；18.20G不銹鋼針頭；19.單相接觸式調(diào)壓器

1.2　厭氧接種及培養(yǎng)裝置的加工與組裝

按照厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置的設(shè)計(jì)購買相關(guān)的組件：3個(gè)40 L 氣體鋼瓶，3個(gè)鋼瓶減壓閥(LFR91F11S，德國LOCKE)，1個(gè)卡套式三通球閥(SS-41GXS2，美國Swagelok)，2個(gè)整體式閥帽針閥(SS-ORS2-PK，美國Swagelok)，7個(gè)卡套式三通接頭(LQT-3，德國LOCKE)，3個(gè)浮子氣體流量計(jì)(LWTM6，德國LOCKE)，6個(gè)撥動開關(guān)閥(SS-OGS2，美國Swagelok)，1個(gè)單相接觸式調(diào)壓器(0～250 V，3 kW)，1根兩端帶接口的石英玻璃管(?3.5 cm×55 cm)，2個(gè)短管卡套式接頭(LHYP，德國LOCKE)，12 m 1/8′不銹鋼管(德國LOCKE)，2 m外徑為13 mm的橡膠管，4.5 m外徑為5 mm橡膠管，4 m玻璃纖維發(fā)熱絲(電阻絲?0.5 mm)，6 m電線，不銹鋼板(45 cm×60 cm×0.2 cm)，4個(gè)喉箍，不銹鋼針頭，厭氧瓶及紫銅絲若干。圖2所示為厭氧接種及培養(yǎng)裝置各主要組件的實(shí)物圖。

圖2厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)裝置各主要組件的實(shí)物圖

將不銹鋼板的長邊向內(nèi)折疊15 cm作為底座，且底座面與控制面板面成80°夾角，然后根據(jù)組件的尺寸大小及相對位置，按照圖3所示的尺寸采用機(jī)械鉆孔機(jī)在不銹鋼板上加工出不同的圓孔分別用于固定三通球閥、整體式閥帽針閥、浮子氣體流量計(jì)及撥動開關(guān)閥(見圖4(a))。設(shè)計(jì)時(shí)所有孔的直徑比組件的直徑大1.5～2 mm，以利于組件的安裝。利用鋼鋸將不銹鋼管切割成端口平滑的不銹管短管：4 cm 4根，3.5 cm 6根，3 cm 8根，9 cm 1根，10 cm 2根，19 cm 1根，43 cm 1根，27 cm 1根，30 cm 2根，20 cm 1根，2.8 m 2根及3.2 m 1根。不銹管短管端口用1 000目砂紙打磨光滑后待用。

圖3控制面板結(jié)構(gòu)示意圖

圖4厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)裝置安裝過程示意圖

組件安裝過程如下：

(1) 將浮子氣體流量計(jì)固定到控制面板上(見圖4(b))；

(2) 用長度為4 cm的不銹鋼管將5個(gè)卡套式三通接頭連接；最右邊的卡套式三通接頭與撥動開關(guān)閥間用長度為9 cm的不銹鋼管連接，與其他撥動開關(guān)閥間用長度為3.5 cm的不銹鋼管連接；最左邊卡套式三通接頭與整體式閥帽針閥用19 cm的不銹鋼管連接；兩個(gè)整體式閥帽針閥間用長度為3 cm的不銹鋼管鏈接一個(gè)卡套式三通接頭；所有撥動開關(guān)閥的另一端連接3 cm的不銹鋼短管(見圖4(c))(注：卡套連接時(shí)，螺母擰1 又1/4圈)；

(3) 將圖4(c)所示組件與球閥安裝到控制面板上(見圖4(d))；

(4) 按圖1所示，N2、CO2氣體流量計(jì)與三通接頭兩端之間用2根10 cm的不銹鋼短管連接，三通接頭上端與三通球閥的左端用27 cm不銹鋼短管連接；H2/CO2氣體流量計(jì)與三通球閥的右端用43 cm不銹鋼短管連接；三通球閥的下端通過80 cm不銹鋼短管及30 cm橡膠管(?13 mm)與玻璃管下端連接；玻璃管下端通過30 cm橡膠管(?13 mm)及80 cm不銹鋼短管與兩個(gè)整體式閥帽針閥間的三通接頭連接； 80 cm橡膠管(?5 mm)通過45 cm不銹鋼短管與位于上部的整體式閥帽針閥連接；40 cm橡膠管(?5 mm)與撥動開關(guān)閥連接；減壓閥與氣體流量計(jì)間分別用2根2.8 m及1根3.2 m不銹鋼管連接(見圖4(e)、(f))；

(5) 將減壓閥與鋼瓶連接、玻璃纖維發(fā)熱絲通過電線與調(diào)壓器連接，以完成整個(gè)裝置的安裝(見圖5)。

圖5　厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)裝置實(shí)物圖

1.3　厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置氣密性檢測

以氮?dú)鉃闄z測氣，對安裝好的厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置的氣密性進(jìn)行檢測。將裝置連接到N2氣體鋼瓶上，打開所有閥門，用止水夾將等橡膠軟管回折密封，然后將肥皂水依次滴加到所有的連接接頭上，以對各個(gè)接頭的氣密性進(jìn)行檢查。如果滴加肥皂水的接頭冒泡，則說明該接頭有泄漏，否則說明該接頭氣密封好。通過對各個(gè)接頭氣密性的檢測，以檢驗(yàn)厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置的氣密性。

2　厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置實(shí)踐

利用自制實(shí)驗(yàn)室簡易厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置培養(yǎng)GeobactersulfurreducensPCA(ATCC 51573)及Geobactergrbiciae(ATCC BAA-46)與Methanosarsinabarkeri800(ATCC 43569，DSM 800)的co-culture，以檢驗(yàn)該裝置的有效性。

2.1　Geobacter sulfurreducens PCA的培養(yǎng)

GeobactersulfurreducensPCA的培養(yǎng)參考Summers等[15]的方法。將NBF(Media NB with Fumarate)培養(yǎng)基置于三角瓶中，用鋁箔紙密封后煮沸，然后將煮沸的培養(yǎng)基置于冰域中，利用厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置中的厭氧接種氣路通入N2/CO2(V/V=80∶20)混合氣使其冷卻至室溫。156 mL厭氧瓶先用厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置脫氧10 min，然后用電動移液器量取45 mL NBF培養(yǎng)基至厭氧瓶中，厭氧瓶插入曝氣針后塞上丁基橡膠塞，N2/CO2(80/20，V/V)曝氣40 min后鋁蓋密封，121 °C滅菌30 min后冷卻到室溫待用。制備好的培養(yǎng)基通過接種氣路用1 mL注射器加入0.75 mL微量微生素溶液及0.5 mL乙酸溶液(2 mol/L)，厭氧氣路接種GeobactersulfurreducensPCA(10%接種量，V/V)后置于30 °C下培養(yǎng)。圖6為使用本研究設(shè)計(jì)的厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種與培養(yǎng)裝置培養(yǎng)GeobactersulfurreducensPCA情況。圖6(a)為未接種G.suifurreducensPCA的NBF培養(yǎng)基，圖6(b)為接種G.suifurreducensPCA并培養(yǎng)一周后的NBF培養(yǎng)基。從圖6中能夠看出未接種G.suifurreducensPCA的NBF培養(yǎng)基顏色沒有發(fā)生變化，而接種G.suifurreducensPCA并培養(yǎng)一周后的NBF培養(yǎng)基由無色變?yōu)榉奂t色，菌種生長良好，這表明該厭氧環(huán)境滿足G.suifurreducensPCA的生長要求。

圖6接種G.suifurreducensPCA前后NBF培養(yǎng)基顏色變化

2.2　G. grbiciae與M. barkeri co-culture的培養(yǎng)

G.grbiciae與M.barkerico-culture的培養(yǎng)參考Rotaru等[16]的方法。將NBM(Media NB modified)培養(yǎng)基置于三角瓶中，用鋁箔紙密封后煮沸，然后將煮沸的培養(yǎng)基置于冰域中，利用厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置中的厭氧接種氣路通入N2/CO2(V/V=80∶20)混合氣使其冷卻至室溫。156 mL厭氧瓶先用厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置脫氧10 min，然后用移液器量取45 mL NBM培養(yǎng)基至厭氧瓶(內(nèi)置1 g顆?；钚蕴?Granular Active Carbon，GAC))中，厭氧瓶插入曝氣針后塞上丁基橡膠塞，N2/CO2(80/20，V/V)曝氣40 min后鋁蓋密封，121 °C滅菌30 min后冷卻到室溫待用。制備好的培養(yǎng)基通過接種氣路用1 mL注射器加入0.75 mL微量微生素溶液、0.5 mL還原劑(100 mmol/L L-Cysteine 和 50 mmol/L的Na2S混合溶液)及0.5 mL乙醇溶液(2 mol/L)，厭氧氣路接種M.barkeri與G.grbiciae構(gòu)成的混合微生物(10%接種量，V/V)后置于37 °C下培養(yǎng)。利用氣相色譜定期檢測厭氧瓶中甲烷的濃度。厭氧瓶中甲烷的濃度隨時(shí)間變化如圖7所示，接種培養(yǎng)64天后厭氧瓶中甲烷的量達(dá)1.45±0.03 mmol(±SD,n=3)，這說明使用自制實(shí)驗(yàn)室多功能厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置成功地培養(yǎng)了G.grbiciae與M.barkeri的co-culture。G.grbiciae與M.barkeri都為嚴(yán)格厭氧微生物，而兩種微生物在自制的裝置中都能生長，這充分說明了該裝置在嚴(yán)格厭氧微生物的接種及培養(yǎng)時(shí)的有效性。

圖7G.grbiciae與M.barkeri的co-cultures耦合代謝乙醇產(chǎn)甲烷

3　結(jié)　語

本文設(shè)計(jì)與制備了實(shí)驗(yàn)室簡易厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種與培養(yǎng)裝置，并將該裝置用于嚴(yán)格厭氧微生物GeobactersulfurreducensPCA、Geobactergrbiciae及Methanosarcinabarkeri800的培養(yǎng)基制備、接種與培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該裝置完全滿足試驗(yàn)要求，且具有原料易得、制作簡單、成本低及使用靈活等優(yōu)點(diǎn)。該裝置還適用于批量厭氧培養(yǎng)基的制備、厭氧接種及厭氧微生物的培養(yǎng)，在為我?！拔⑸飳W(xué)”“環(huán)境微生物技術(shù)”及“發(fā)酵工程”的實(shí)驗(yàn)教學(xué)構(gòu)建了新的實(shí)驗(yàn)平臺，并取得了良好的效果。實(shí)驗(yàn)室簡易厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種與培養(yǎng)裝置的成功設(shè)計(jì)與制造，不僅改善了學(xué)校的實(shí)驗(yàn)教學(xué)條件，更重要地是引導(dǎo)學(xué)生將所學(xué)的金工、機(jī)械制圖、AutoCAD、化工原理及生物等知識有機(jī)結(jié)合后應(yīng)用到一個(gè)具體工程項(xiàng)目，有助于培養(yǎng)和提高學(xué)生的協(xié)同合作、查閱文獻(xiàn)、實(shí)驗(yàn)探索、工程實(shí)踐及科技創(chuàng)新能力，最終達(dá)到培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新意識、創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力的目的。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]袁桂秀，林晨，江振友，等. 改良焦性沒食子酸法培養(yǎng)厭氧菌[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版)，1999，20(4): 24-25.

[2]曹杰，屠靜，鄧娟. 中華醫(yī)學(xué)會第七次全國感染病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C]//上海：中華醫(yī)學(xué)會，2001:226.

[3]趙建玲，高興政. 焦性沒食子酸培養(yǎng)陰道毛滴蟲方法的建立及其應(yīng)用[J]. 中國血吸蟲病防治雜志，2002，14(1): 28-31.

[4]施曼玲，戴赟，章玲. 丁酸梭菌培養(yǎng)條件的研究[J]. 杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，18(4): 38-40.

[5]喬藝然. A型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染雛雞病理形態(tài)學(xué)研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[6]楊小蓉，黃偉峰，黃玉蘭，等. 肉毒梭菌檢驗(yàn)樣本處理及培養(yǎng)研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2017，27(7): 968-970.

[7]黎景景，高鑫，李寬鈺，等. 敲除牙齦卟啉單胞菌菌毛次要組分FimCDE的載體構(gòu)建[J]. 上海口腔醫(yī)學(xué)，2013，22(6): 623-627.

[8]王愛寬，秦勇. 褐煤本源菌在煤層生物氣生成中的微生物學(xué)特征[J]. 中國礦業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40(6):888-893.

[9]徐隋意. 間斷多次低溫對糖氧剝奪神經(jīng)元的保護(hù)作用[D]. 廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

[10]張穎，刁婥，范春輝，等. 厭氧培養(yǎng)液制備裝置：中國，ZL200820089414.6[P]. 2009-01-07.

[11]承磊，代莉蓉，劉來雁，等. 用于厭氧培養(yǎng)基制備的氣路裝置：中國，ZL200820222804.6[P]. 2009-08-12.

[12]宋新妥，趙明輝，李毅烜. 一種厭氧培養(yǎng)基制備系統(tǒng)：中國，ZL201620127468.1[P]. 2016-08-10.

[13]于東寧，于基成，劉秋. 厭氧微生物接種裝置及厭氧微生物培養(yǎng)系統(tǒng)：中國，ZL201420828906.8[P]. 2015-06-17.

[14]于東寧，于基成，劉秋. 厭氧微生物接種裝置、厭氧微生物培養(yǎng)系統(tǒng)以及厭氧微生物接種、培養(yǎng)方法：中國，ZL201410812995.1[P]. 2016-01-13.

[15]Summers Z M, Fogarty H E, Leang C,etal. Direct exchange of electrons within aggregates of an evolved syntrophic coculture of anaerobic bacteria. Science, 2010, 330(6009): 1413-1415.

[16]Rotaru A E, Shrestha P M, Liu F,etal. Direct Interspecies Electron Transfer Between Geobacter metallireducens and Methanosarcina barkeri [J]. Appl Environ Microbiol, 2014, 80(15): 4599-4605.