李曉麗，魏玉震，徐 劼，趙章風(fēng)，鐘 江，何 勇※

?

基于高光譜成像的茶葉中EGCG分布可視化

李曉麗1，魏玉震1，徐 劼2，趙章風(fēng)3，鐘 江3，何 勇1※

（1. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058； 2. 嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，嘉興 314001； 3. 浙江工業(yè)大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，杭州 310014）

針對目前關(guān)于表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）在茶葉中的分布缺乏可視化表達(dá)問題，該文采用高光譜成像技術(shù)以實(shí)現(xiàn)EGCG在茶葉中的分布可視化。通過高光譜成像儀采集茶葉的光譜信息，按照標(biāo)準(zhǔn)方法HPLC（high performance liquid chromatography）法測量茶葉的EGCG濃度。運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立光譜與EGCG濃度之間的回歸模型。為尋求相對較優(yōu)的模型效果，對光譜進(jìn)行不同的預(yù)處理，以確定最優(yōu)的預(yù)處理方法；采用4種建模方法建立回歸模型，以確定最優(yōu)的建模方法；對光譜進(jìn)行特征波段選擇，以降低數(shù)據(jù)冗余提高模型的穩(wěn)定性和運(yùn)算速度。最后，將高光譜圖像中像素點(diǎn)對應(yīng)的光譜變量導(dǎo)入模型，從而生成EGCG濃度分布圖。結(jié)果表明：可見-近紅外光譜與EGCG濃度之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性，其回歸模型的決定系數(shù)達(dá)到0.905，利用高光譜成像技術(shù)對茶葉中EGCG分布進(jìn)行可視化可行。通過對不同品種、葉位的茶葉中EGCG濃度分布進(jìn)行可視化，能夠?yàn)楦逧GCG濃度茶樹品種的培育、EGCG代謝規(guī)律的分析以及茶樹采摘部位的識別提供有效手段。

作物；光譜分析；圖像處理；模型；茶葉；高光譜成像；EGCG；分布可視化

0 引 言

茶多酚是茶葉中最主要的功能性物質(zhì)，屬于多元酚類化合物[1]，約占茶葉干質(zhì)量的18%～40%。其主要成分是兒茶素類化合物，約占茶多酚總質(zhì)量的70%～80%。在各兒茶素類化合物中，一般又以EGCG（epigallocatechin gallate）含量最高，約占兒茶素總量的50%～60%[2]。研究表明EGCG具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠提高免疫力[3]，對糖尿病、前列腺疾病、帕金森病、阿茲海默癥和中風(fēng)等有一定的防治功效[4]，此外，EGCG還能夠抑制癌細(xì)胞的產(chǎn)生[5]。由于EGCG對人體有諸多益處，并且EGCG不能人工合成，主要依靠茶葉代謝產(chǎn)生[6]，因此，EGCG含量是衡量茶葉品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。

目前測定EGCG濃度的常用方法是高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7]，該方法存在操作復(fù)雜和耗時(shí)長的缺點(diǎn)。而光譜信息能夠反映物體的內(nèi)部特征，為實(shí)現(xiàn)非接觸快速檢測提供理論基礎(chǔ)[8]，基于光譜的茶葉品質(zhì)快速無損檢測技術(shù)也因此得到發(fā)展[9]，Bian等[10]利用反射光譜預(yù)測茶粉、茶葉和冠層中的茶多酚、游離氨基酸和可溶性糖等重要內(nèi)含物的含量，李曉麗等[11]運(yùn)用漫反射光譜對綠茶中含水率進(jìn)行檢測，余濤等[12]利用可見近紅外光譜分析茶葉中葉綠素、茶氨酸、茶多酚的含量，Zhao等[13]運(yùn)用紅外光譜技術(shù)測量茶葉中的EGCG含量，但針對的是成品茶，且沒能實(shí)現(xiàn)可視化。因?yàn)?，僅利用光譜信息只能反映出內(nèi)含物的類別及濃度高低，無法體現(xiàn)內(nèi)含物在空間分布上的特征。

高光譜成像技術(shù)同時(shí)獲取光譜信息和圖像信息，能夠?qū)崿F(xiàn)內(nèi)含物分布的可視化表達(dá)，在農(nóng)作物[14]和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量[15]檢測方面有著廣泛的應(yīng)用。Yu等[16]利用高光譜成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了氮素在尖椒根、莖和葉中濃度分布的可視化，為直觀分析尖椒植株的生理狀態(tài)提供了依據(jù)；孫俊等[17]以生菜葉片作為研究對象，利用高光譜成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了氮素在其葉片中的可視化，為生菜的精準(zhǔn)施肥提供有效的參考信息；丁希斌等[18]利用高光譜成像技術(shù)對油菜葉片SPAD值的可視化進(jìn)行研究，為評估油菜的光合作用提供了有效手段；趙艷茹等[19]為研究南瓜葉片在霜霉病脅迫下的葉綠素變化機(jī)制，利用高光譜成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了不同病害期的葉綠素分布可視化，為判別霜霉病疫情提供了理論基礎(chǔ)。關(guān)于高光譜成像技術(shù)應(yīng)在茶葉品質(zhì)檢測方面的研究，Chen等[20]利用高光譜成像技術(shù)對茶葉品質(zhì)進(jìn)行分級，方案首先對高光譜圖像進(jìn)行主成分分析，然后提取主成分圖像的紋理特征作為輸入變量建立模型，取得了良好的分級效果；Sohara等[21]采集茶葉嫩梢的高光譜圖像，提取嫩梢的平均光譜，建立了光譜與主要兒茶素單體濃度之間的回歸模型，沒有充分利用圖像信息。盡管高光譜成像技術(shù)在可視化檢測方面已有諸多應(yīng)用，但關(guān)于EGCG濃度分布可視化的研究還未見報(bào)道。

茶樹的代謝主要分為碳代謝和氮代謝，EGCG屬于次級碳代謝產(chǎn)物[1]。研究EGCG在茶樹不同部位的分布規(guī)律，尤其是在不同葉位中的分布規(guī)律，對指導(dǎo)茶葉的生產(chǎn)具有重要意義。文獻(xiàn)[22]以龍井43茶樹作為研究對象，系統(tǒng)地研究了葉位對碳、氮代謝的影響，并計(jì)算了主要代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，茶多酚含量在第1至6葉位中呈現(xiàn)遞減趨勢，總氨基酸含量呈先上升后下降的趨勢。且EGCG與總氮含量的相關(guān)系數(shù)為0.966，呈強(qiáng)相關(guān)性，但文中并未解釋相關(guān)機(jī)理。近紅外光譜進(jìn)行有機(jī)物定性定量分析基礎(chǔ)是有機(jī)物的C-H、N-H和O-H有強(qiáng)烈的光譜響應(yīng)特性[23]，而EGCG并不含有氮元素，EGCG的定量檢測主要基于C-H和O-H基團(tuán)的光譜響應(yīng)特性，因此茶葉中EGCG的高光譜圖像檢測不應(yīng)直接取決于EGCG與總氮之間的相關(guān)性，盡管基于高光譜成像技術(shù)的氮素可視化已經(jīng)在一些作物上成功實(shí)現(xiàn)[16-17]。文獻(xiàn)[22]只針對一個(gè)品種的茶樹，缺乏品種之間的比較；對于EGCG的分布狀況只有統(tǒng)計(jì)上的數(shù)字描述，不夠直觀形象。

因此，本文選取3個(gè)茶樹品種作為研究對象，利用高光譜成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)EGCG在不同葉位中的分布可視化，為分析茶樹的代謝情況，培育高EGCG濃度的茶樹提供直觀有效的方法。另外，鑒于茶樹嫩梢和老葉在EGCG含量上存在顯著差異[24]，EGCG在茶樹中的分布成像還可以為茶樹嫩梢的自動識別和名優(yōu)茶采摘標(biāo)準(zhǔn)的制定提供思路。

1 材料與方法

1.1 樣本制備

試驗(yàn)研究的3個(gè)茶樹品種分別為菊花春（Juhuachun）、迎霜（Yingshuang）和浙農(nóng)25（Zhenong 25），茶樹種植于浙江大學(xué)華家池校區(qū)試驗(yàn)茶園內(nèi)（120.206 E，30.274 N），葉片采摘于2016年9月27日。采摘時(shí)，依次摘取嫩梢頂芽至魚葉之間前6個(gè)葉位的葉片，如圖1所示。每個(gè)品種的每個(gè)葉位各設(shè)置9個(gè)重復(fù)，共得到162個(gè)樣本（3個(gè)品種×6個(gè)葉位×9個(gè)重復(fù)）。

圖1 茶葉嫩梢葉位示意圖

1.2 高光譜圖像獲取系統(tǒng)

本研究采用的高光譜成像儀結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示，系統(tǒng)主要由暗箱、高光譜相機(jī)、鏡頭、線光源、步進(jìn)電機(jī)和計(jì)算機(jī)等部件組成。系統(tǒng)的圖像分辨率為672×512像素，光譜分辨率為2.8 nm，光譜范圍為380～1 030 nm，包含512個(gè)波段。在采集高光譜圖像時(shí)，移動平臺的速度設(shè)置為3 mm/s，相機(jī)的曝光時(shí)間設(shè)置為75 ms。

圖2 高光譜成像系統(tǒng)示意圖

1.3 高光譜圖像的校正

在獲取高光譜圖像之前，需要采集白板和暗電流的校正信息，首先將白色校正板（聚四氟乙烯材料制成）放置在鏡頭正下方以獲得白色標(biāo)定圖像（反射率接近100%），然后關(guān)閉光源并蓋住鏡頭得到暗電流圖像（反射率接近0%）。按如下公式進(jìn)行校正。

式中0為原始高光譜圖像，I為校正后高光譜圖像。通過校正，可以有效減少光照不均勻和暗電流對高光譜圖像的影響。

1.4 EGCG濃度值的測定

葉片采摘后，隨即被放入含有冰袋的保溫箱中，然后在2 h內(nèi)采集光譜。采集完光譜后，葉片被放入-80 ℃冰箱中，以盡量減少其離體后EGCG的變化。由于單個(gè)葉片質(zhì)量較小，因此將每個(gè)品種每個(gè)葉位的3片葉子作為1個(gè)樣本進(jìn)行測量。樣本的處理過程為：將樣本放入冷凍干燥機(jī)（凍干溫度：-40 ℃，真空度：0.12 mbar；FreeZone?Triad?2.5L 型，LABCONCO公司，美國），冷凍干燥24 h；用研磨儀（振動頻率：75 Hz，研磨時(shí)間：30 s；FW100型，泰斯特儀器有限公司，天津）將干燥后的茶葉研磨成粉末狀，粉末過40目篩（篩孔尺寸：0.425 mm），每組樣本稱取0.1 g的過篩粉末放入具塞試管；向具塞試管中加入25 mL純水，85 ℃水浴加熱20 min，使用10m水系濾膜過濾后獲取EGCG水溶液；采用高效液相色譜儀（HPLC儀型號為日本島津LC-20AD，混合濃度準(zhǔn)確度：<0.5%，流量準(zhǔn)確度：1%或2L/min其中較大值以內(nèi)）測定EGCG濃度。

HPLC試驗(yàn)的相關(guān)參數(shù)如下：流動相A為醋酸:乙腈:高純水（0.5∶3∶96.5），流動相B為醋酸:乙腈:高純水（0.5∶30∶69.5），通過將流動相A和B的溶劑組成設(shè)置成不同的比例，以調(diào)節(jié)流動相極性，使樣品中具有不同極性的組分依次溶解出來；洗脫梯度：0～35 min，流動相B由20%線性增加至65%，35～45 min流動相B維持65%；流動速度：1 mL/min；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10L；柱溫：35 ℃。

根據(jù)保留時(shí)間和峰面積大小計(jì)算EGCG濃度。EGCG標(biāo)準(zhǔn)品（用于確定出峰時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線）購買于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，純度≥98%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1 光譜提取與預(yù)處理

使用HSI Analyzer（ISUZU optics，中國臺灣）軟件對高光譜圖像進(jìn)行白板與暗電流校正。然后，利用ENVI 5.1（Exelis VIS，USA）軟件分析葉片和背景的光譜特征，確定分割閾值，將背景置0。為與化學(xué)值對應(yīng)，以每個(gè)樣本的3片葉子作為1個(gè)ROI（感興趣區(qū)域，region of interest），計(jì)算ROI中所有像素點(diǎn)的平均光譜作為建立模型的光譜數(shù)據(jù)。

隨機(jī)噪聲污染和基線漂移是光譜采集時(shí)常遇到的問題[25]，針對這2個(gè)問題，本文分別使用SG（Savitzky- Golay）平滑[26]、基線校正（baseline correction，BC）[27]以及這2種方法的混合預(yù)處理。通過對比不同預(yù)處理方法的建模效果，確定最佳的預(yù)處理方法。

1.5.2 樣本劃分

為了構(gòu)建穩(wěn)定的回歸模型，需要對樣本進(jìn)行建模集和預(yù)測集的劃分。合理的樣本劃分方法應(yīng)滿足2個(gè)基本條件：1）建模集的濃度范圍應(yīng)大于預(yù)測集的濃度范圍；2）建模集和預(yù)測集的濃度值應(yīng)均勻分布。因此，本研究對各品種及葉位的9個(gè)樣本按照EGCG濃度進(jìn)行降序排列，然后選取第2、5和8序號的3個(gè)樣本作為預(yù)測集，其余6個(gè)樣本作為建模集，共得到建模集樣本108個(gè)，預(yù)測集樣本劃分樣本54個(gè)；分別計(jì)算建模集、預(yù)測集和總體樣本的均值、最大值、最小值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，評估樣本劃分是否合理。

1.5.3 建模方法與模型評價(jià)

樣本劃分后，本研究使用主成分回歸（principal component regression，PCR）、偏最小二乘回歸（partial least-squares regression，PLSR）、徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（radial basis function neural network，RBFNN）和最小二乘-支持向量回歸（least squares support vector regression，LS-SVR）4種常用建模方法。

PCR和PLSR均廣泛運(yùn)用于化學(xué)計(jì)量學(xué)領(lǐng)域[28]，所不同的是，在提取光譜變量的主成分（principal components，PCs）時(shí)，PCR只對光譜矩陣進(jìn)行分析，而PLSR則同時(shí)綜合考慮光譜矩陣和濃度矩陣。RBFNN和LS-SVR都是將低維模式的輸入數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換到高維空間內(nèi)，RBFNN由輸入層、隱含層和輸出層組成，能夠逼近任意非線性函數(shù)，克服了BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的局部極小值問題[29]。LS-SVR采用最小二乘線性系統(tǒng)作為損失函數(shù)，用等式約束代替SVM中的不等式約束，具有計(jì)算復(fù)雜度低，求解速度快的優(yōu)點(diǎn)[30]。

建立樣本平均反射光譜（按照1.5.1節(jié)所述方法獲?。┡cEGCG濃度的回歸模型之后，以預(yù)測集決定系數(shù)R2（determination coefficient of prediction set）和預(yù)測集均方根誤差RMSEP（root mean square error of prediction）作為模型性能的主要評價(jià)指標(biāo)，以建模集決定系數(shù)R2（determination coefficient of calibration set）和建模集均方根誤差RMSEC（root mean square error of calibration）作為輔助評價(jià)指標(biāo)。以驗(yàn)證集實(shí)測值的標(biāo)準(zhǔn)偏差與預(yù)測均方根誤差的比值RPD（residual prediction deviation）作為模型預(yù)測性能的評判指標(biāo)，且RPD值越大越好。

1.5.4 特征波段提取

原始的高光譜數(shù)據(jù)信息維度高，輸入變量較多，容易出現(xiàn)共線性和數(shù)據(jù)冗余問題，為簡化模型和提高模型穩(wěn)定性，需要對全波段進(jìn)行特征波段的選取，本研究采用連續(xù)投影算法SPA（successive projection algorithm）[31]進(jìn)行特征波段選取。

SPA是一種前向循環(huán)選擇方法，它從一個(gè)波長開始，每次循環(huán)都計(jì)算它在未選入波長上的投影，將投影向量最大的波長引入到波長組合。每一個(gè)新選入的波長，都與前一個(gè)線性關(guān)系最小，從而降低信息冗余，提取特征波長。最后，對每一次循環(huán)所提取的變量，分別建立多元線性回歸模型，得到建模集交互驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV），最小的RMSECV值所對應(yīng)的特征集即為最優(yōu)特征波長集。

1.5.5 EGCG可視化分析

在建立合適的光譜-EGCG濃度的預(yù)測模型后，將每個(gè)像素點(diǎn)對應(yīng)的光譜導(dǎo)入預(yù)測模型，可計(jì)算出各像素點(diǎn)的EGCG濃度值，從而生成EGCG在茶葉中的濃度分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片EGCG濃度統(tǒng)計(jì)分析

利用HPLC法測得的茶葉EGCG濃度值如圖3所示，對于3個(gè)品種茶樹而言，其第一葉位的EGCG濃度均明顯高于其他葉位。對于不同品種的茶樹，其EGCG在含量和分布規(guī)律上明顯不相同。菊花春的第1至3葉位，葉片的EGCG濃度呈逐漸降低的趨勢，而第4至6葉位則是先上升后下降；浙農(nóng)25的第1至6葉位，葉片的EGCG濃度呈現(xiàn)逐漸降低的規(guī)律；迎霜茶的第1至4葉位，葉片的EGCG濃度呈遞減的趨勢，第5至6葉位濃度基本相同。

對品種和葉位進(jìn)行雙因素方差分析，品種因素對應(yīng)的值為3.979×10-32，葉位因素對應(yīng)的值為2.842×10-40，品種與葉位交互對應(yīng)的值為1.518e×10-29，所得到的值均遠(yuǎn)小于0.01。因此，品種和葉位對EGCG的濃度都有顯著的影響，這為后文分析EGCG成像效果提供參考。

注：不同小寫字母表示同一品種間各葉位之間差異顯著。

2.2 光譜分析

圖4為所有樣本的光譜，380～420 nm區(qū)間光譜比較雜亂。提取380、400和420 nm單波段圖像如圖5所示，可以發(fā)現(xiàn)這些單波段圖像不顯示有效的信息，因此判定該區(qū)間為噪聲區(qū)間。在后續(xù)的分析中，以420～1030 nm作為有效波段。光譜曲線550 nm附近的波峰為葉片中葉綠素的強(qiáng)反射區(qū)，650～700 nm處的波谷因?yàn)槿~綠素強(qiáng)吸收導(dǎo)致，700～750 nm范圍急劇上升，是因?yàn)槿~片對近紅外波段吸收較少。每條光譜的形狀相似，但在反射強(qiáng)度上存在差異，這也從側(cè)面說明茶葉的內(nèi)部成分大致相同，但在含量上有所不同，為建立EGCG濃度預(yù)測模型提供了客觀基礎(chǔ)。

2.3 樣本劃分與光譜預(yù)處理

按照1.5所述劃分方法進(jìn)行樣本劃分后，對建模集和預(yù)測集的化學(xué)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示，表中列出了建模集、預(yù)測集和全部樣本的EGCG濃度值的最大值、最小值、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表1可以發(fā)現(xiàn)建模集的EGCG濃度范圍覆蓋預(yù)測集的濃度范圍；不同樣本集的EGCG濃度平均值較為相近，標(biāo)準(zhǔn)偏差也較為相近。因此，樣本劃分合理。

圖4 全部樣本光譜示意圖

圖5 部分高光譜圖像的RGB圖和單波段灰度圖

表1 建模集和預(yù)測集的EGCG濃度值的統(tǒng)計(jì)分析

為驗(yàn)證不同預(yù)處理方法的效果，分別建立不同預(yù)處理方法處理后的光譜與EGCG濃度值的PLSR模型，結(jié)果如表2所示。由表可見未經(jīng)預(yù)處理的光譜所建立的PLSR模型效果最好，說明原始光譜的隨機(jī)噪聲和基線漂移問題不明顯，預(yù)處理反而會造成有效信息的損失。因此，后續(xù)的分析都基于未經(jīng)處理的光譜進(jìn)行。

表2 基于不同預(yù)處理方法的PLSR模型結(jié)果

4注：‘RMSEC’表示校正集均方根誤差，‘2’表示校正集決定系數(shù)，‘RMSEP’表示預(yù)測集均方根誤差，‘2’表示預(yù)測集決定系數(shù)，‘RPD’表示預(yù)測集實(shí)測值的標(biāo)準(zhǔn)偏差與預(yù)測均方根誤差的比值，下同，

Note: ‘RMSEC’ means root mean square error of calibration set, ‘2’ means determination coefficient of calibration set, ‘RMSEP’ means root mean square error of prediction set, ‘2’ means determination coefficient of prediction set, ‘RPD’ means residual prediction deviation, the same below.

2.4 全波段建模分析

首先，選取建模集的反射光譜數(shù)據(jù)（420～1 030 nm范圍，478個(gè)波段）作為自變量，對應(yīng)的EGCG濃度值作為因變量，分別建立PCR、PLSR、RBFNN和LS-SVR模型，在建立PCR模型過程中，最優(yōu)主成分?jǐn)?shù)量為18，在建立PLSR模型過程中，最佳潛在變量數(shù)為12，在訓(xùn)練RBFNN過程中，徑向基函數(shù)的擴(kuò)展系數(shù)spread值為423，在建立LS-SVR模型的時(shí)，核函數(shù)選用徑向基函數(shù)。全波段的建模效果如表3所示。

表3 基于全波段不同建模方法的建模結(jié)果

由表3可見，總體來說非線性建模效果優(yōu)于線性建模，這說明光譜和EGCG濃度可能并不完全是呈現(xiàn)線性關(guān)系。LS-SVR模型優(yōu)于RBFNN，這可能是因?yàn)長S-SVR方法的非線性映射能力更強(qiáng)[32]。鑒于LS-SVR方法的建模效果比其他3種方法好，為了簡潔起見，在后續(xù)的分析中僅采用LS-SVR方法。

2.5 特征波段提取與建模分析

在建立全波段模型時(shí)，共有478個(gè)光譜變量，這些變量在提供豐富信息的同時(shí)，也導(dǎo)致信息冗余。為降低信息冗余和提高運(yùn)算速度，采用SPA選取特征波長，共選取493，526，554，562，570，641和785 nm處的7個(gè)特征波長，特征波段的分布情況如圖6所示，這些波段主要集中于可見光區(qū)，這是因?yàn)椴煌珴傻牟枞~其化學(xué)成分的含量和組成是有差異的，這也反映在黃烷醇類化合物的含量和組成上，而茶葉中的兒茶素屬于黃烷醇類化合物[2]。

圖6 基于SPA選取特征波段在光譜曲線上的分布圖

利用7個(gè)特征波段建立LS-SVR模型，模型采用徑向基函數(shù)作為核函數(shù)，模型的預(yù)測集預(yù)測值與實(shí)測值的散點(diǎn)圖如圖7所示，模型的2值為0.905、RPD值為3.248，優(yōu)于基于全波段的LS-SVR模型。且通過特征波段選擇以后，建模的輸入變量顯著減少，由478個(gè)減少為7個(gè)，從而降低了模型復(fù)雜度。

圖7 EGCG試驗(yàn)值與SPA-LS-SVR模型預(yù)測值的散點(diǎn)圖

2.6 茶葉中EGCG濃度分布可視化

選取菊花春、浙農(nóng)25和迎霜嫩梢葉片的高光譜圖像進(jìn)行成像分析，將每個(gè)像素點(diǎn)的特征波段輸入SPA-LS-SVR模型，計(jì)算EGCG含量，生成葉片的EGCG濃度分布圖如圖8所示。

菊花春第1葉的EGCG濃度分布圖最亮，第2葉比第3至6葉明亮，但明顯比第1葉暗，第3至6葉的EGCG分布圖差別不明顯。浙農(nóng)25第1至6葉的EGCG分布圖的亮度呈現(xiàn)明顯的遞減規(guī)律。迎霜第1葉的EGCG分布圖最亮，第2和第3葉次之，第4至6葉之間差別不明顯。根據(jù)色譜柱的特點(diǎn)，顏色越亮對應(yīng)的濃度值越高，圖8與圖3所示的規(guī)律基本一致。

總體來看，選取3個(gè)品種茶樹嫩梢上的葉片都是第1葉EGCG分布圖對應(yīng)的濃度值最高，這一定程度上佐證了茶樹體內(nèi)的多酚類物質(zhì)主要集中在茶樹嫩梢生長旺盛的部位[33]。就單片鮮葉來看，主脈部位EGCG含量相對較低，這也印證了文獻(xiàn)[34]的結(jié)論，即在茶葉中，除了主脈薄壁細(xì)胞外，大多數(shù)組織都有積累，其中以維管束和柵欄組織積累較多。

注：數(shù)字代表葉位數(shù)，每一列的葉片采自同一嫩梢。

3 結(jié) 論

本研究采用高光譜成像技術(shù)對茶葉中EGCG濃度進(jìn)行定量檢測，并基于該定量檢測模型對不同葉位葉片中EGCG分布進(jìn)行了可視化分析，從而為直觀分析EGCG分布特征提供依據(jù)。主要結(jié)論如下：

1）文中研究了不同的光譜與處理方法、建模方法，對光譜進(jìn)行特征波段提取，成功建立了光譜與EGCG濃度值的回歸模型；

2）利用高光譜圖像技術(shù)實(shí)現(xiàn)茶葉不同葉位的EGCG濃度分布可視化，為分析EGCG的代謝規(guī)律提供手段；

3）通過對不同品種茶樹的EGCG濃度分布圖進(jìn)行比較，可以為茶葉品質(zhì)的鑒定和高EGCG濃度茶樹品種的培育提供直接依據(jù)；

4）所研究的3個(gè)品種茶樹嫩梢的第1葉EGCG濃度顯著高于其他葉位，鑒于不同葉位茶葉顏色相近，難以通過普通RGB圖像識別，對EGCG濃度分布成像能夠?yàn)椴枞~采摘部位的識別提供思路。

[1] Nagle D G, Ferreira D, Zhou Y D. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG): chemical and biomedical perspectives [J]. Phytochemistry, 2006, 67(17): 1849－1855.

[2] 宛曉春. 茶葉生物化學(xué)(第三版) [M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[3] Higdon J V, Frei B. Tea catechins and polyphenols: Health effects, metabolism, and antioxidant functions [J]. Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 2003, 43(1): 89－143.

[4] Khan N, Afaq F, Saleem M, et al. Targeting multiple signaling pathways by green tea polyphenol (-)-epigallocatechin- 3-gallate [J]. Cancer Research, 2006, 66(5): 2500－2505.

[5] Shankar S, Ganapathy S, Hingorani S R, et al. EGCG inhibits growth, invasion, angiogenesis and metastasis of pancreatic cancer [J]. Frontiers in Bioscience A Journal & Virtual Library, 2008, 13(2): 440－452.

[6] 王小萍，劉曉軍，唐小波，等. 高EGCG含量茶的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢 [J]. 茶業(yè)通報(bào)，2009，31(3)：108－110. Wang Xiaoping, Liu Xiaojun, Tang Xiaobo, et al. Research status and development trend of high EGCG content tea [J]. Journal of Tea Business, 2009, 31(3): 108－110. (in Chinese with English abstract)

[7] Liu J W, Li H Y, Shi R J, et al. Determination of content of EGCG and ECG in tea polypheenols by HPLC [J]. Science & Technology of Food Industry, 2010, 31(11): 372－374(in Chinese with English abstract)

[8] Gredilla A, Vallejuelo F O D, Elejoste N, et al. Non-destructive spectroscopy combined with chemometrics as a tool for green chemical analysis of environmental samples: A review [J]. Trends in Analytical Chemistry, 2016, 76: 30－39.

[9] 彭繼宇，宋星霖，劉飛，等. 基于波譜技術(shù)的茶樹生長與茶葉品質(zhì)信息快速檢測研究進(jìn)展[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2016，36(3)：775－782. Peng Jiyu, Song Xinglin, Liu Fei, et al. Fast detection of camellia sinensis growth process and tea quality Informations with spectral technology: A review [J]. Spectroscopy & Spectral Analysis, 2016, 36(3): 775－782. (in Chinese with English abstract)

[10] Bian M, Skidmore A K, Schlerf M, et al. Predicting foliar biochemistry of tea (Camellia sinensis) using reflectance spectra measured at powder, leaf and canopy levels [J]. Isprs Journal of Photogrammetry & Remote Sensing, 2013, 78(4): 148－156.

[11] 李曉麗，程術(shù)希，何勇. 基于漫反射光譜的初制綠茶含水率無損檢測方法[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010，26(5)：195－201. Li Xiaoli, Cheng Shuxi, He Yong. Nondestructive measurement of moisture content of green tea in primary processing based on diffuse reflectance spectroscopy [J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2010, 26(5): 195－201. (in Chinese with English abstract)

[12] 余濤，胡波，孫睿，等. 茶葉光譜與葉綠素、茶氨酸、茶多酚含量關(guān)系分析[J]. 遙感技術(shù)與應(yīng)用，2016，31(5)：872－878. Yu Tao, Hu Bo, Sun Rui, et al. Analysis of the relationship between the tea spectrum and the content of chlorophyll, theanine and tea polyphenols [J]. Remote Sensing Technology and Application, 2016, 31(5): 872－878. (in Chinese with English abstract)

[13] Zhao J W, Guo Z M, Chen Q S. Near infrared spectroscopy determination of EGCG content in tea based on OSC and PLS [J]. Journal of Food Science & Biotechnology, 2008, 39(9): 3278－3297.

[14] Ahmed M R, Yasmin J, Mo C, et al. Outdoor applications of hyperspectral imaging technology for monitoring agricultural crops: A Review [J]. 2016, 41(4): 396－407.

[15] Liu D, Zeng X A, Sun D W. Recent developments and applications of hyperspectral imaging for quality evaluation of agricultural products: A review [J]. Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 2015, 55(12): 1744－1757.

[16] Yu K Q, Zhao Y R, Li X L, et al. Hyperspectral imaging for mapping of total nitrogen spatial distribution in pepper plant [J]. Plos One, 2014, 9(12): e116205.

[17] 孫俊，金夏明，毛罕平，等. 基于高光譜圖像光譜與紋理信息的生菜氮素含量檢測[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2014，30(10)：167－173. Sun Jun, Jin Xiaming, Mao Hanping, et al. Detection of nitrogen content in lettuce leaves based on spectroscopy and texture using hyperspectral imaging technology [J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2014, 30(10): 167－173. (in Chinese with English abstract)

[18] 丁希斌，劉飛，張初，等. 基于高光譜成像技術(shù)的油菜葉片SPAD值檢測[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2015, 35(2)：486－491. Ding Xibin, Liu Fei, Zhang Chu, et al. Prediction of SPAD value in oilseed rape leaves using hyperspectral imaging technique [J]. Spectroscopy & Spectral Analysis, 2015, 35(2): 486－491. (in Chinese with English abstract)

[19] 趙艷茹，余克強(qiáng)，李曉麗，等. 基于高光譜成像的南瓜葉片葉綠素分布可視化研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2014, 34(5)：1378－1382. Zhao Yanru, Yu Keqiang, Li Xiaoli, et al. Study on SPAD visualization of pumpkin leaves based on hyperspectral imaging technology.[J]. Spectroscopy & Spectral Analysis, 2014, 34(5): 1378－1382. (in Chinese with English abstract)

[20] Chen Q. Estimation of tea quality level using hyperspectral imaging technology [J]. Acta Optica Sinica, 2008, 28(4): 669－674.

[21] Sohara Y, Ryu C, Suguri M, et al. Estimation of catechins concentration of green tea using hyperspectral remote sensing [J]. IFAC Proceedings Volumes, 2010, 43(26): 172－177.

[22] Li Z X, Yang W J, Ahammed G J, et al. Developmental changes in carbon and nitrogen metabolism affect tea quality in different leaf position [J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2016, 106: 327－335.

[23] Cen H, He Y. Theory and application of near infrared reflectance spectroscopy in determination of food quality[J]. Trends in Food Science & Technology, 2007, 18(2):72－83.

[24] Lee J E, Lee B J, Hwang J A, et al. Metabolic dependence of green tea on plucking positions revisited: A metabolomic study [J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2011, 59(19): 10579－10585.

[25] Guo Y, Zhao X H, Zhang R, et al. The noise filtering and baseline correction for harmonic spectrum based on wavelet transform [J]. Spectroscopy & Spectral Analysis, 2013, 33(8): 2172－2176.

[26] Chen H, Tao P, Chen J, et al. Waveband selection for NIR spectroscopy analysis of soil organic matter based on SG smoothing and MWPLS methods [J]. Chemometrics & Intelligent Laboratory Systems, 2011, 107(1): 139－146.

[27] Liland K H, Alm Y T, Mevik B H. Optimal choice of baseline correction for multivariate calibration of spectra [J]. Applied Spectroscopy, 2010, 64(9): 1007.

[28] Ergon R. Reduced PCR/PLSR models by subspace projections [J]. Chemometrics & Intelligent Laboratory Systems, 2006, 81(1): 68－73.

[29] Huang G B. Extreme learning machine: RBF network case [C]// Siew C K. Control, Automation, Robotics and Vision Conference, 2004. Icarcv 2004. IEEE, 2012: 1029－1036.

[30] Li Y, Shao X, Cai W. A consensus least squares support vector regression (LS-SVR) for analysis of near-infrared spectra of plant samples [J]. Talanta, 2007, 72(1): 217－222.

[31] Araújo M C U, Saldanha T C B, Galv?o R K H, et al. The successive projections algorithm for variable selection in spectroscopic multicomponent analysis[J]. Chemometrics & Intelligent Laboratory Systems, 2001, 57(2):65－73.

[32] Reboreda M. Time estimation in injection molding production for automotive industry based on SVR and RBF [C]// Fernández-Delgado M. International Work-Conference on the Interplay Between Natural and Artificial Computation. Springer-Verlag, 2009: 509－518.

[33] Forrest G I, Bendall D S. The distribution of polyphenols in the tea plant (Camellia sinensis L.) [J]. Biochemical Journal, 1969, 113(5): 741－755.

[34] 劉亞軍. 茶樹酯型兒茶素合成途徑及酚類物質(zhì)積累特異性研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

Liu Yajun. Study on the Synthesis of Catechin and Accumulation Characteristics of Phenolics [D]. Hefei: Anhui Agricultural University, 2011. (in Chinese with English abstract)

EGCG distribution visualization in tea leaves based on hyperspectral imaging technology

Li Xiaoli1, Wei Yuzhen1, Xu Jie2, Zhao Zhangfeng3, Zhong Jiang3, He Yong1※

(1.310058,;2.314001,3.310014,)

EGCG (epigallocatechin gallate) is an important functional material in tea, and it is regarded as an indispensable index for evaluating the quality of tea as it’s of great benefit to health. With the difference of tea varieties and physiological parts of tea plant, the distribution of EGCG is different. Visualization of EGCG distribution contributes to analyze the distribution and metabolism of EGCG directly. However, no research on the visualization of EGCG distribution in tea leaves has been reported till now. This study took advantage of hyperspectral imaging technology and chemometrics method to realize visualization of EGCG distribution in fresh tea leaves. On the basis of visualization, distribution characteristics of EGCG between different tea varieties and different leaf positions were studied. The operation procedure of visualization was mainly divided into 5 steps: 1) Acquisition of physical and chemical information. To obtain the physical information, 486 fresh leaves from the 1stto the 6thleaf positions at the tender shoots of tea plants with 3 varieties were gathered first, hyperspectral images of these fresh leaves were collected by a hyperspectral imager, and then average spectral information used to build models was extracted from the hyperspectral images. To acquire the chemical information, the fresh leaves were freeze-dried, ground into powder, sieved and heated by water-bath to obtain the EGCG solution, and the EGCG concentration was determined through HPLC (high performance liquid chromatography) at last. 2) Samples division and spectral preprocessing. In order to divide the samples reasonably, an interval-extraction method was adopted to ensure the distribution uniformity of chemical values. All the samples were divided into calibration set and prediction set in a ratio of 2:1. Due to the limited performance of hyperspectral imager, obvious noise region of the spectra was eliminated first in order to avoid the interference to subsequent analysis. For 2 common issues during spectral acquisition, i.e. random noise and baseline drift, the SG (Savitzky-Golay) smoothing and baseline correction were performed. Through comparing different preprocessing methods, it was found that the unprocessed spectra showed the best performance. 3) Model establishment and analysis based on full efficient spectra. To determine the best modeling method, PCR (principal component regression), PLSR (partial least squares regression), RBFNN (radial basis function neural network) and LS-SVR (least squares support vector regression) models between full efficient spectra and EGCG concentration values were established respectively. The results showed that the nonlinear models had better performance, and by comparing the evaluation parameters of different models, LS-SVR was chosen as the best modeling method. 4) Model establishment and analysis based on feature bands. The full efficient spectra contain 478 variables, which carry rich information, and cause a collinear problem between variables at the same time. To reduce the data redundancy and the complexity of the model based on full efficient spectra, SPA (successive projection algorithm) was employed to select feature bands, and the LS-SVR model based on feature bands showed better performance compared with the LS-SVR model based on full efficient spectra, with theR2(determination coefficient of prediction set) and RPD (residual prediction deviation) that is the ratio of standard deviation of measured values to root mean square error of prediction set reaching 0.905 and 3.248 respectively. 5) Generation of EGCG distribution map. Inputting the feature bands of each pixel selected by SPA in the testing hyperspectral images into the SPA-LS-SVR model, the EGCG concentration of each pixel could be calculated, so the distribution maps of EGCG in fresh tea leaves were generated finally. This study proved that EGCG distribution visualization in fresh tea leaves can be realized by hyperspectral imaging technology and chemometrics method. Through the analysis of EGCG distribution between different tea varieties and different leaf positions, the distribution showed significant differences. This study provides an effective method for cultivation of tea plant variety with high EGCG concentration, analysis on the metabolism rule of EGCG and recognition of tea shoots.

crops; spetrum analysis; image processing; models; tea; hyperspectral imaging; EGCG; distribution visualization

李曉麗，魏玉震，徐 劼，趙章風(fēng)，鐘 江，何 勇. 基于高光譜成像的茶葉中EGCG分布可視化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2018，34(7)：180－186. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.07.023 http://www.tcsae.org

Li Xiaoli, Wei Yuzhen, Xu Jie, Zhao Zhangfeng, Zhong Jiang, He Yong. EGCG distribution visualization in tea leaves based on hyperspectral imaging technology[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(7): 180－186. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.07.023 http://www.tcsae.org

2017-10-22

2018-03-08

國家自然科學(xué)基金（31771676）；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015C02008，2017C02027）；浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014C32091)；高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015QNA6005)

李曉麗，四川廣安人，副教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)椴枞~品質(zhì)快速無損檢測。Email：xiaolili@zju.edu.cn

何 勇，浙江寧波人，教授，博士，主要從事數(shù)字農(nóng)業(yè)與精細(xì)農(nóng)業(yè)研究。Email：yhe@zju.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.07.023

S571.1

A

1002-6819(2018)-07-0180-07