周果，李慶麗，陳博陽，師丹陽，陸健昇，周曉巍，余云舟

軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）俗稱老年癡呆，是一種伴隨著記憶力減退、認(rèn)知功能障礙的神經(jīng)退行性疾病，由德國醫(yī)生Alzheimer Alois于1906年首次發(fā)現(xiàn)[1]。目前它是老年人中僅次于心、腦血管病和癌癥的第四大致死病，給患者的家庭和社會(huì)造成了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和壓力。AD發(fā)病機(jī)制的主流假說是由Hardy于1992年提出的淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說（amyloid cascade hypothesis），該假說認(rèn)為患者腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）水解產(chǎn)生過量有毒性的β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的聚集，是產(chǎn)生神經(jīng)毒性的主要原因[2-3]。目前認(rèn)為AD的主要組織病理學(xué)特征是患者大腦中胞外過度積累的Aβ42形成的淀粉樣斑塊，以及細(xì)胞內(nèi)由過度磷酸化的Tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)[4]。因此，以毒性Aβ作為靶標(biāo)，成為很多研究者治療AD的著力方向。

將Aβ作為重要靶標(biāo)，通過主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫的方式清除過多聚集的Aβ是預(yù)防或治療AD的主要方法[4-5]。1999年Schenk等首次將人纖維化的Aβ42用于免疫AD轉(zhuǎn)基因小鼠并取得了一定的效果[6-7]；一年后，Elan和Wyeth研究的AN-1792疫苗以人源纖維化Aβ42聯(lián)合QS21佐劑首次進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，在Ⅰ期實(shí)驗(yàn)中取得初步性良好反應(yīng)后，臨床Ⅱ期有6%的患者出現(xiàn)了腦膜炎而被迫終止了實(shí)驗(yàn)[8-9]，多數(shù)人認(rèn)為患者存在自身毒性T細(xì)胞免疫反應(yīng)可能是炎癥出現(xiàn)的原因[10]。Aβ42是由1個(gè)B細(xì)胞表位（1～15）和2個(gè)T細(xì)胞表位（17～21，29～42）組成的多肽，研究發(fā)現(xiàn)，許多利用Aβ的N端B細(xì)胞表位制備的抗原蛋白免疫動(dòng)物或AD模型動(dòng)物后均能誘發(fā)Th2型免疫反應(yīng)，避免Th1型炎癥細(xì)胞反應(yīng)[11]，因此AD免疫治療的研究方向是選擇靶向Aβ42的B淋巴細(xì)胞表位作為抗原疫苗。

本研究中重組融合抗原4Aβ15-TF采用的是Aβ42的B淋巴細(xì)胞表位Aβ15，同時(shí)基于研究表明Aβ分子中具毒性的是Aβ寡聚體[12-13]，而進(jìn)行了4個(gè)拷貝多重復(fù)串聯(lián)，形成多聚體結(jié)構(gòu)，并加入一個(gè)輔助T細(xì)胞表位（AKFVAAWTLKAAA，簡(jiǎn)稱TF），能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，增加抗原的免疫原性。結(jié)果顯示，該重組融合抗原免疫C57BL/6小鼠取得了良好的免疫效果，為進(jìn)一步研究靶向Aβ的AD重組亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡雌性SPF級(jí)C57BL/6小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌Top10感受肽細(xì)胞和DNA純化回收試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司；pTIG-Trx原核表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；DNA聚合酶Prime STAR和T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega公司；山羊抗小鼠IgG-HRP購自ZSGBBIO公司；山羊抗小鼠IgG1/IgG2a/IgG2b/IgG3/IgMHRP購自Santa Cruz公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、轉(zhuǎn)膜緩沖液和Western印跡顯色試劑盒購自Thermo公司；基因和引物合成、基因測(cè)序、Aβ42多肽合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

重組融合蛋白4Aβ15-TF的基因序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，并引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，瓊脂糖凝膠電泳后純化回收得到目的片段，與原核表達(dá)載體pTIG-Trx雙酶切后室溫連接2 h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)，37℃過夜孵育，挑取單克隆菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 重組融合蛋白4Aβ15-TF的表達(dá)和純化

將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，挑取單克隆接種到5 mL 2×YT培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐西林）中，37℃、220 r/min培養(yǎng)至菌液D600nm值達(dá)到0.6～1.0，按1%的比例轉(zhuǎn)至200 mL培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)至菌液D600nm值達(dá)到0.6～1.0，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，16℃、220 r/min過夜培養(yǎng)，8000 r/min離心10 min收集菌體，去掉上清培養(yǎng)基，用20 mmol/L pH8.0的PB緩沖液重懸，冰水浴條件下超聲波破碎，待破碎完全后4℃、8000 r/min離心20 min，收集上清用0.45 μm的濾紙過濾，加入終濃度為20 mmol/L的咪唑，以1 mL/min的速度讓上清穿過Ni柱使目的蛋白與其結(jié)合，上樣結(jié)束后用50～500 mmol/L咪唑進(jìn)行梯度洗脫，最后用SDS-PAGE對(duì)收集的蛋白進(jìn)行純度和含量鑒定，

1.4 Western印跡鑒定目的蛋白

純化好并脫去咪唑的目的蛋白用Western印跡進(jìn)一步鑒定。樣品電泳結(jié)束后于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15 min，按下層濾紙、PVDF膜、SDS-PAGE膠、上層濾紙的順序疊加鋪于轉(zhuǎn)膜儀上（避免氣泡），620 mA轉(zhuǎn)膜20 min，將膜于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，加入1∶500稀釋的抗Aβ42抗體，室溫孵育2 h，用TBS-T洗膜3次，每次10 min，加入1∶5000稀釋的山羊抗小鼠IgG-HRP，室溫孵育30 min，TBST洗膜3次，每次10 min，將West?ern印跡顯影液A液和B液按1∶1的體積配制1 mL，用凝膠成像儀曝光顯影。

1.5 重組亞單位疫苗免疫C57BL/6小鼠

將6～8周齡的SPF級(jí)雌性C57小鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組每只小鼠每次免疫蛋白的劑量為5 μg，將重組抗原蛋白用無菌的PBS稀釋至50 μg/mL，并在配制疫苗時(shí)加入1/10體積的鋁佐劑（10 mg/mL）而成亞單位疫苗，采用肌內(nèi)注射方式，注射體積100 μL，免疫3周后剪尾采血，每間隔3周加強(qiáng)免疫，共4次，免疫方案不變。

1.6 重組亞單位疫苗免疫后抗體水平、滴度和亞型測(cè)定

用包被液稀釋人工合成抗原Aβ42至終濃度為2 μg/mL，酶聯(lián)板每孔加入100 μL，4℃過夜包被抗原；用PBS-T洗滌6次，每孔加入200 μL 2%牛血清白蛋白（BSA），37℃封閉2 h；將采集的血清樣品于4℃、5500 r/min離心10 min后取上清，按1∶100稀釋（抗體滴度和亞型的測(cè)定先進(jìn)行1/ 100稀釋，再按1/4梯度稀釋），每孔加入稀釋好的血清100 μL，37℃孵育2 h，PBS-T洗6次，每孔50 μL加入1∶5000用封閉液稀釋的山羊抗小鼠的IgG-HRP（或IgG1-HRP/IgG2a-HRP/IgG2b-HRP/ IgG3-HRP/IgM-HRP），37℃孵育0.5 h，PBS-T洗6次，加入50 μL現(xiàn)配的顯色液（240 mmol/L檸檬酸，50 mmol/L Na2HPO4，0.4 mg/mL OPD，0.1% H2O2），避光顯色10 min后用2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取D492nm及D630nm值。血清抗體水平取樣品的平均值，抗體滴度用終末稀釋ELISA法計(jì)算，以D492nm≥0.3為陽性結(jié)果。

1.7 細(xì)胞免疫水平測(cè)定

小鼠斷頸處死后在75%乙醇溶液中浸泡30 min，于超凈臺(tái)中取脾，用玻璃棒在400目細(xì)胞篩上研磨，用5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞篩，收集脾細(xì)胞懸液于15 mL離心管中，800 r/min離心10 min，棄上清；用5 mL NH4Cl吹打重懸沉淀，放置5 min，800 r/min離心10 min，棄上清；重復(fù)2次后加入5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基（含10% FBS）重懸并計(jì)數(shù)；用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋脾細(xì)胞懸液至1×106/mL，在96孔板每孔中加入100 μL脾細(xì)胞懸液，并加入濃度為5 μg/mL的Aβ42和TF 100 μL，同時(shí)設(shè)置未刺激的空白對(duì)照組和ConA刺激的陽性對(duì)照組，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔；將混勻后的96孔細(xì)胞板放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)3 d后在超凈工作臺(tái)中于每孔分別加入10 μL MTS，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，測(cè)定各孔的D492nm值，計(jì)算刺激指數(shù)（stimulate index，SI）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用單因素方差進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用柔性肽GS將4個(gè)Aβ15串聯(lián)，加入輔助T細(xì)胞表位，并對(duì)氨基酸表位進(jìn)行密碼子優(yōu)化，N端添加EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，C端添加XhoⅠ酶切位點(diǎn)，合成基因序列4Aβ15-TF（圖1），將該基因克隆到原核表達(dá)載體pTIG-Trx中，用試劑盒提取該質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的載體測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建成pTIG-Trx-4Aβ15-TF。

2.2 重組融合蛋白4Aβ15-TF的表達(dá)、純化及鑒定

鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)后，用pH8.0的PB緩沖液重懸收集的菌體，冰水浴下進(jìn)行超聲波破碎，破碎后收集上清，表達(dá)的目的蛋白主要以可溶性方式存在于上清中，用0.45 μm的濾紙過濾后經(jīng)Ni柱純化，將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western印跡（圖2），蛋白大小約為20 000（二聚體），且能特異性與抗Aβ42抗體結(jié)合，經(jīng)鑒定為本研究所設(shè)計(jì)的蛋白。

2.3 重組亞單位疫苗免疫C57BL/6小鼠后抗體水平、滴度和亞型測(cè)定

用ELISA檢測(cè)小鼠免疫后的體液免疫反應(yīng)?？贵w水平測(cè)定結(jié)果表明（圖3），重組融合抗原4Aβ15-TF免疫小鼠產(chǎn)生了較強(qiáng)的針對(duì)Aβ42的特異性抗體，初次免疫后的血清抗體水平免疫組明顯高于PBS組，具有極其顯著的差異（P＜0.01），抗體的水平隨免疫次數(shù)的增加而提高?？贵w滴度結(jié)果如圖4，4次免疫后免疫組抗體滴度可達(dá)1∶120 000左右，相對(duì)于PBS組具有明顯差異（P＜ 0.01），由此表明嵌合疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。

圖1 重組融合蛋白4Aβ15-TF的基因序列

圖2 目的蛋白純化后的SDS-PAGE和Western印跡M：蛋白marker；1：SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物；2：Western印跡鑒定純化產(chǎn)物；箭頭示目的蛋白條帶（20 000）

另外，對(duì)第3次免疫后采取的血清的抗體亞型進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明（圖5）這種抗原免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體亞型主要是IgG1，并且伴隨著少量的IgG2b，這說明抗原免疫后所產(chǎn)生抗體的主要來源是Th2型免疫反應(yīng)。

2.4 重組亞單位疫苗免疫C57BL/6小鼠后T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將免疫后小鼠的脾臟取出，分離淋巴細(xì)胞，用抗原刺激后，在CO2孵箱中培養(yǎng) 4 d，測(cè)定細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果見圖6。經(jīng)Aβ42抗原刺激的免疫組淋巴細(xì)胞增殖情況與對(duì)照組相比沒有明顯差異（P＞0.05），沒有產(chǎn)生特異性的針對(duì)Aβ42的T細(xì)胞免疫反應(yīng)；而經(jīng)TF刺激的免疫組產(chǎn)生了相應(yīng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，且與對(duì)照組相比有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖3 重組亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體水平

圖4 重組亞單位疫苗免疫小鼠后的抗體滴度

圖5 重組亞單位疫苗免疫小鼠后抗體亞型測(cè)定

圖6 重組蛋白免疫小鼠后脾細(xì)胞經(jīng)抗原刺激的增殖情況

3 討論

早期針對(duì)Aβ的主動(dòng)免疫治療研究有2個(gè)問題，一是主動(dòng)免疫用抗原免疫原性相對(duì)較差；二是臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)，研究表明炎癥的出現(xiàn)是因?yàn)闄C(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)Aβ42的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)。針對(duì)這些問題，我們只選取Aβ42中的B細(xì)胞表位Aβ15構(gòu)建疫苗抗原分子，以避免出現(xiàn)自身Th1型炎癥細(xì)胞免疫反應(yīng)；另外，Aβ分子中具毒性的是Aβ寡聚體，故將多個(gè)Aβ15分子用GS串聯(lián)，形成多聚體結(jié)構(gòu)，同時(shí)融合了一個(gè)輔助性T細(xì)胞表位TF，以增強(qiáng)抗原的免疫原性。先前，本研究室利用這種策略研究6Aβ15-T重組融合蛋白抗原，結(jié)果表明該分子作為抗原疫苗具有良好的免疫原性，免疫小鼠后產(chǎn)生了高滴度的針對(duì)Aβ42的特異性抗體，并進(jìn)一步證明其在AD模型鼠上也有著良好的免疫治療效果[14-15]。

將分子佐劑與蛋白疫苗結(jié)合，再共同作用于機(jī)體，也能增強(qiáng)疫苗的免疫原性。本實(shí)驗(yàn)室在先前研究中用重組融合抗原聯(lián)合了幾種常見的佐劑免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鋁佐劑相對(duì)于其他佐劑，在快速增強(qiáng)抗原的免疫原性和誘使趨向Th2型抗體反應(yīng)等方面更具優(yōu)勢(shì)[15]，而且鋁佐劑應(yīng)用更加廣泛，也是適用于人的安全佐劑。另外，先前本實(shí)驗(yàn)室對(duì)6Aβ15-T的研究結(jié)果也顯示鋁佐劑增強(qiáng)了抗原的免疫原性，并且產(chǎn)生的抗體反應(yīng)趨向于Th2型[14]。因此，本研究采用鋁佐劑聯(lián)合重組嵌合抗原4Aβ15-TF免疫C57BL/6小鼠評(píng)價(jià)其免疫原性，證實(shí)其有效性。

在本研究中，我們探討了4個(gè)拷貝串聯(lián)的重組分子作為AD疫苗的可行性，設(shè)計(jì)了一個(gè)重組融合抗原分子4Aβ15-TF，人工合成其基因序列后用基因工程技術(shù)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pTIGTrx-4Aβ15-TF，表達(dá)且純化到了穩(wěn)定性好、純度較高的4Aβ15-TF抗原，用其結(jié)合鋁佐劑免疫小鼠后產(chǎn)生了較強(qiáng)的針對(duì)Aβ42的特異性抗體，抗體水平隨免疫次數(shù)的增加而提高，4次免疫后的血清抗體滴度水平可達(dá)1∶120 000，證明此抗原有較好的免疫原性。血清抗體亞型主要是IgG1型和少量IgG2b型，證明免疫反應(yīng)主要趨向于Th2型。免疫后沒有產(chǎn)生針對(duì)Aβ42而只產(chǎn)生了針對(duì)TF的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。后續(xù)，還將對(duì)重組融合抗原4Aβ15-TF作為亞單位疫苗在AD模型鼠上進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，明確其免疫預(yù)防或治療效果，并與6Aβ15-T進(jìn)行比較，為預(yù)防和治療AD提供安全有效的候選亞單位疫苗。

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