潘學(xué)洪，王曉東

濰坊市益都中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容科 山東濰坊 262500

皮膚對(duì)創(chuàng)傷的修復(fù)方式分為2種，依次為簡(jiǎn)單的表皮修復(fù)和深層真皮修復(fù)，而真皮及皮下組織修復(fù)常常出現(xiàn)病理性瘢痕[1]。增生的病理性瘢痕一般高于周圍的正常皮膚組織，其表面充血呈現(xiàn)紅色，不僅嚴(yán)重影響美觀，還常常出現(xiàn)疼痛、瘙癢等現(xiàn)象[2]。病理性瘢痕以成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖為主要病理學(xué)表現(xiàn)，抑制病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡是病理性瘢痕治療的重要途徑[3]。蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路具有調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等作用，其磷酸化后生成磷酸化的Akt(p-Akt)，激活A(yù)kt信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。有研究[5]顯示，Akt信號(hào)通路在病理性瘢痕組織中過(guò)度激活。本研究用Akt信號(hào)通路抑制劑處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞，探討其對(duì)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，以期為病理性瘢痕的治療提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本及試劑收集2013年1月至2016年12月濰坊市益都中心醫(yī)院手術(shù)切除的病理性瘢痕組織50例，患者中男26例，女24例，年齡6～28歲，病程6～12個(gè)月。組織標(biāo)本采集均經(jīng)過(guò)患者及家屬知情同意。青鏈霉素、DMEM、胰蛋白酶為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002為美國(guó)MCE公司產(chǎn)品；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為上海Bogoo公司產(chǎn)品；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Cleaved Caspase-9)抗體為美國(guó)CTS公司產(chǎn)品；Akt抗體、p-Akt抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[6]。病理性瘢痕組織用生理鹽水洗滌3次后，將表皮以及皮下組織去除，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇洗滌2次后，用含有青鏈霉素的PBS溶液洗滌3次，再用含有青鏈霉素的DMEM洗滌2次。將組織剪碎成大小約為1 mm3的組織塊，把組織塊涂在培養(yǎng)瓶的下壁，在組織塊上滴加2滴胎牛血清后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，放在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。將培養(yǎng)瓶再次翻轉(zhuǎn)至組織塊的貼壁面朝下，加入2 mL含有體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM。每隔3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d后，在組織塊周圍觀察有成纖維細(xì)胞出現(xiàn)后，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換成含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用2.5 g/L的胰蛋白酶于37 ℃消化1 min。1 000 r/min離心10 min后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清)，以12的比例接種培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均為第3代病理性瘢痕成纖維細(xì)胞。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖病理性瘢痕成纖維細(xì)胞以每孔1 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞貼壁后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入適量的Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002，使其終濃度為0、10、20、40、80 mg/L。培養(yǎng)48 h后，在每孔中加入20 μL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h。將上清吸除后，加入150 μL的二甲基亞砜，觀察結(jié)晶物溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度值(A值)，計(jì)算IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期用IC50濃度的Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞48 h后，加入2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS洗滌2次，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入冰預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，4 ℃孵育1 h。1 000 r/min離心10 min后，棄上清，PBS 2 mL重懸細(xì)胞。再加入50 mg/L的PI 300 μL，4 ℃避光條件下染色30 min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡用IC50濃度的Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞48 h后，加入2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用冰預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞密度調(diào)整為106mL-1，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入300 μL的緩沖液，再加入5 μL的Annexin V-FITC和PI，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6Westernblot檢測(cè)細(xì)胞中CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-9、Akt、p-Akt水平用IC50濃度的Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞48 h后，將上清液吸除，加入RIPA裂解液，4 ℃裂解完全后，14 000 r/min離心15 min，吸取蛋白上清，與5×上樣緩沖液以體積比41的比例混勻后，煮沸變性。70 V電壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入到分離膠和濃縮膠交界處時(shí)，把電壓調(diào)整為110 V。2 h后，觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠的底部時(shí)，關(guān)閉電源。200 mA冰浴轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，牛血清白蛋白在室溫封閉2 h。與一抗4 ℃過(guò)夜反應(yīng)后，與辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗在室溫孵育2 h。顯色后，用Image J圖像處理軟件分析目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值的比值，以此表示目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不同組間細(xì)胞A值的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；2組間細(xì)胞周期、凋亡率及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平的比較均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果見表1。10、20、40、80 mg/L的Akt信號(hào)通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖活性逐漸降低，與0 mg/L作用組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算其IC50為32.58 mg/L，后續(xù)用30 mg/L的Akt信號(hào)通路抑制劑處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞。

表1　不同質(zhì)量濃度Akt信號(hào)通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞A值的變化(n=3)

F=99.308,P<0.001;*：組間兩兩比較，P均<0.05

2.2細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果見表2。30 mg/L的Akt信號(hào)通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。

2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果見表2。30 mg/L的Akt信號(hào)通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率明顯高于0 mg/L作用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2　Akt信號(hào)通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞周期及凋亡率的比較(n=3)　%

2.4CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-9、Akt、p-Akt表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見圖1和表3。30 mg/L的Akt信號(hào)通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)水平明顯高于0 mg/L作用組，而p-Akt表達(dá)水平明顯低于0 mg/L作用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　0、30 mg/L的Akt信號(hào)通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Akt、p-Akt表達(dá)水平

表3　Akt信號(hào)通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Akt、p-Akt表達(dá)水平的比較(n=3)

3　討論

病理性瘢痕的形態(tài)較為多樣，常常高于正常的皮膚組織，表現(xiàn)為彈性差、質(zhì)脆等現(xiàn)象，在病變的早期，其表面呈現(xiàn)紫色或者是鮮紅色，在病變的晚期則呈現(xiàn)灰白色和蒼白色，同時(shí)常出現(xiàn)色素沉著的現(xiàn)象[7-9]。病理性瘢痕不僅嚴(yán)重影響美觀，還會(huì)損害正常組織的生理功能。目前對(duì)于病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，燒傷、動(dòng)物咬傷以及手術(shù)等醫(yī)療過(guò)程均能夠?qū)е虏±硇择：鄣漠a(chǎn)生，其產(chǎn)生的原因與成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)有關(guān)，是一種病理性的纖維化過(guò)程[10]。成纖維細(xì)胞是皮膚創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其過(guò)度增殖也是瘢痕形成的主要原因[11]。

Akt信號(hào)通路在心肌組織、腦組織、消化道等中均有廣泛表達(dá)，并且在細(xì)胞生長(zhǎng)、器官形成、胚胎發(fā)育過(guò)程中均有重要作用[12]。郭亮等[13]的研究顯示，運(yùn)用Western blot、PCR和免疫組化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)瘢痕組織和正常皮膚組織中Akt磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，瘢痕組織中Akt磷酸化水平高于正常皮膚組織。本研究首先體外分離培養(yǎng)了人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞，用Akt信號(hào)通路特異性抑制劑作用后發(fā)現(xiàn)，病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖活性降低，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞凋亡率升高，G0/G1期細(xì)胞增加。說(shuō)明抑制Akt信號(hào)通路可以抑制病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期。

細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)特性的發(fā)揮與細(xì)胞內(nèi)多種基因調(diào)控有關(guān)，是一系列復(fù)雜過(guò)程的最終結(jié)果，Caspase蛋白家族是目前研究較多的與細(xì)胞凋亡發(fā)生有關(guān)的半胱氨酸蛋白酶。目前發(fā)現(xiàn)的Caspase蛋白家族成員至少有11種，根據(jù)其在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用可以分為凋亡起始因子、凋亡執(zhí)行因子，其中Caspase-3是凋亡執(zhí)行因子，Caspase-9是凋亡起始因子[14-16]。正常情況下，細(xì)胞中的Caspase蛋白成員以無(wú)活性的酶原形式存在，當(dāng)受到外界信號(hào)刺激后活化發(fā)揮其生物學(xué)功能[17-18]。本研究結(jié)果顯示，Akt信號(hào)通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)水平升高。Caspase-3、Caspase-9活化水平升高，說(shuō)明病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡增多，這與細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果相一致。

綜上所述，抑制Akt信號(hào)通路激活可以促進(jìn)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，提高Caspase-3、Caspase-9活化水平，其作用機(jī)制需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探討。本研究結(jié)果為探討Akt信號(hào)通路在病理性瘢痕中的作用奠定了基礎(chǔ)，為治療病理性瘢痕提供了理論依據(jù)。本研究存在一定的局限性，沒有探討Akt在體內(nèi)對(duì)瘢痕組織的作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)對(duì)這一部分進(jìn)行完善和補(bǔ)充。

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