韓凌霞 趙麗麗 于海波 張 偉 張圓圓 陳洪巖

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物與比較醫(yī)學團隊/國家禽類實驗動物種子中心，哈爾濱 150001)

開發(fā)具有重大價值的實驗動物資源，特別是農(nóng)用實驗動物資源，是實驗動物科學研究的重要內容。目前我國雖已基本除雞實現(xiàn)實驗動物化而得到廣泛應用外，尚無其它禽類動物實驗動物化，這對豐富實驗動物資源，尤其是動物疫病研究，以及診斷試劑、疫苗研發(fā)非常不利。我國是世界最大的鴨生產(chǎn)國，鴨肉、鴨蛋和羽絨產(chǎn)量均位居世界第一。全國肉鴨存欄已達12億只，肉鴨出欄約38億只，鴨肉、鴨絨初級產(chǎn)品的年總產(chǎn)值已經(jīng)達到790億元，鴨蛋總產(chǎn)值約430億元。鴨還是多種禽病和部分人類疫病疫苗的生產(chǎn)原材料和檢定材料。本文是目前國內有關無特定病原體(SPF)種鴨群的專業(yè)報道。疫病對我國水禽養(yǎng)殖業(yè)危害嚴重，因此，培育SPF鴨，實現(xiàn)禽病研究和生物制品材料的標準化，對于動物健康養(yǎng)殖非常必要。

1 引種

紹興麻鴨白殼I號產(chǎn)蛋性能優(yōu)良，適應性強，可在寒冷干燥地區(qū)離地飼養(yǎng)和籠養(yǎng)，適合于實驗動物化；金定鴨是我國著名的蛋鴨地方品種，具有產(chǎn)蛋量高、體型小、飼料利用率高、雜交利用效果明顯、適應性強等優(yōu)點[1-2]。國家禽類實驗動物種子中心在2005年引進了浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所培育的紹興麻鴨高產(chǎn)系白殼I號祖代鴨種卵，在國內率先開始培育SPF鴨群，2015年從國家水禽種質資源基因庫江蘇省豐達水禽育種場引進祖代金定鴨種卵，豐富SPF鴨群遺傳資源。

種卵在正壓5級屏障環(huán)境內的孵化器和出雛器內孵化、出雛，在鴨用正壓隔離器內飼養(yǎng)。開始SPF鴨群的培育。

2 質量控制

2.1 制定飼養(yǎng)管理制度、規(guī)程

結合鴨的生產(chǎn)特點，制訂了詳細的環(huán)境設施、設備運行、養(yǎng)護、檢測、驗證程序，嚴格控制環(huán)境設施指標；對人流、物流、氣流、飼喂、孵化等環(huán)節(jié)制定了嚴格的日常消毒、管理和生產(chǎn)工藝規(guī)程，規(guī)定了詳細的三次更衣、換鞋、手消毒、種蛋熏蒸、物料無菌傳遞、動物飲用水與清潔水無菌處理及檢測、消毒劑驗證等操作流程，阻斷各種可能的水平傳播途徑。

嚴格控制環(huán)境設施指標，實時維護、實時監(jiān)測、定期檢測、定期驗證、積極評價及糾偏。特別注意設施設備的氣密性維護，各種出入口的控制，進入設施設備人員、物品、鴨卵、飼料、清潔水、動物應用水的去菌、消毒。注意降溫、降塵。注意動物及物品傳遞。阻斷外界環(huán)境污染和再感染途徑，保證孵化環(huán)境達到正壓7級，飼養(yǎng)環(huán)境達到正壓5級。

2.2 選育培育

以母系為單位組成家系，采用循環(huán)雄鴨的雜交方式培育封閉群。對各世代種鴨進行體增重、受精率、孵化率、產(chǎn)蛋率、等性能指標測定，選出性能好的家系組成種鴨基礎群(不少于800羽，連續(xù)3代以上)。

2.3 微生物質量控制

按照世界獸醫(yī)組織(OIE)的公布，有26種病原可感染鴨，新西蘭出口鴨種卵規(guī)定檢測9種病原，澳大利亞檢測8種病原。我國報道的主要疫病有鴨瘟、鴨病毒性肝炎、番鴨細小病毒病、鴨禽流感、番鴨“花肝病”、鴨大腸桿菌病、鴨副傷寒、鴨出敗、鴨疫里默氏桿菌病等。參照國外進出口鴨及鴨卵檢驗檢疫技術，結合我國國情制定了SPF鴨微生物學監(jiān)測技術規(guī)范，建立了番鴨細小病毒[3]、I型鴨肝炎病毒[4]、多殺性巴氏桿菌[5]、鴨疫里氏桿菌[6]、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌[7]等多種疫病的檢測技術，確定了SPF鴨微生物學監(jiān)測的病原微生物項目、檢測方法和檢測程序，制定了中國實驗動物學會團體標準《實驗動物 SPF鴨微生物學監(jiān)測總則》T/CALAS 18—2017。

針對嚴重影響實驗鴨的多種病原微生物，利用病原微生物分離，血清學抗原、抗體檢測，以及分子生物學等手段，對紹興麻鴨(定名為HBK鴨)、金定鴨(定名為JD鴨)定期全群監(jiān)測。要求在鴨群的一生中至少每周要做一次臨床觀察，以確保鴨沒有任何感染的癥狀，首次監(jiān)測從8周～10周齡開始。常規(guī)監(jiān)測，每隔4周，抽樣檢測規(guī)定的所有項目。未開產(chǎn)鴨，對所有飼養(yǎng)單元進行全部檢測;在整個產(chǎn)蛋期對全部因子進行抗原或抗體檢測;在產(chǎn)蛋后期，監(jiān)測是否存在垂直傳播疾病。

2.3.1疫苗免疫:對種鴨免疫鴨病毒性肝炎I型滅活苗，對F1代雛鴨免疫2次禽流感H5/H9二聯(lián)滅活苗，對F2代雛鴨免疫鴨疫里默氏桿菌/大腸桿菌二聯(lián)滅活苗。

2.3.2臨床監(jiān)測和隔離淘汰:制訂臨床癥狀觀察項目表，用于飼養(yǎng)人員隨時記錄鴨群的異常臨床癥狀。采用“看”、“聽”和“聞”等感官觀察，要求飼養(yǎng)人員隨時對鴨群和個體的精神狀態(tài)、采食量、糞便顏色等12項指標進行監(jiān)測，及時取出可疑動物并送交檢測室剖檢。

2.3.3凈化:鴨病毒性腸炎和鴨病毒性肝炎是鴨最常見、危害較大的兩種病毒性疾病。紹興麻鴨種蛋引進之前，曾對種母鴨免疫了鴨病毒性肝炎I型滅活苗和鴨瘟凍干苗。種蛋孵出后，先連續(xù)對F1代和F2代進行血清學監(jiān)測，結合疫苗免疫情況和微生物學監(jiān)測情況，對抗體陽性個體小于占被檢總數(shù)10%的個體，淘汰陽性個體；對陽性個體數(shù)占被檢總數(shù)的10%以上群體，進行全群病原學監(jiān)測，將病原學陰性和陽性的鴨分別在不同隔離器內飼養(yǎng)，直至血清學監(jiān)測結果全部為陰性，凈化了HBK鴨群中的鴨病毒性腸炎、鴨病毒性肝炎。為防止病原菌感染，對F2代鴨群連續(xù)服用廣譜抗生素新霉素和強力霉素，在F3代鴨分別對咽拭子、肛拭子、糞便、隔離器和飼養(yǎng)室墻壁等采樣，分離細菌，經(jīng)DHL鑒別培養(yǎng)、生化試驗、針對沙門氏菌毒力侵襲基因和內毒素基因的PCR檢測，結果表明無白痢沙門氏菌感染。

2.3.4建立疫病監(jiān)測標準:微生物的監(jiān)測方法主要有血清中和試驗、瓊脂擴散試驗、細菌分離、聚合酶鏈式反應、平板凝集試驗、乳膠凝集試驗等病原學技術，以及血清凝集抑制試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等血清學方法，不斷增加排除的疫病，對鴨瘟等10種病原進行全群血清學和病原學監(jiān)測，淘汰陽性個體。HBK鴨目前已凈化了包括白痢、鴨疫里式桿菌、禽網(wǎng)狀內皮組織增生癥、禽腺病毒(III群)病、鴨病毒性肝炎I型、鴨病毒性腸炎、禽流感和新城疫等在內的10種疫病，建立了核心群。JD鴨已經(jīng)排除了禽流感、雞新城疫、禽腺病毒(Ⅲ群)病、番鴨細小病毒病、雞白血病、鵝細小病毒病、鴨病毒性腸炎、鴨病毒性肝炎I型、鴨圓環(huán)病毒病和鴨坦布蘇病等10種疫病，建立了無特定病原體核心群。

2.4 遺傳質量控制

由于鴨的遺傳學特征與其疫病敏感性、免疫學應答能力和繁殖性能有密切相關性，而且受飼養(yǎng)設施設備的限制，種鴨群的規(guī)模無法與常規(guī)養(yǎng)殖業(yè)相提并論，因此制定SPF鴨種群的遺傳學質量控制標準尤為重要，利用微衛(wèi)星標記和免疫遺傳基因提出了團體標準《SPF鴨遺傳學監(jiān)測》，分別針對封閉群和免疫遺傳基因單倍體型進行了規(guī)定。

2.4.1HBK-SPF鴨群的遺傳學監(jiān)測:利用酯酶1(Es1)、轉鐵蛋白(Trf)、碳酸酐酶-2(Car2)、葡萄糖磷酸異構酶-1(Gpi1)、酯酶10(Es10)和磷酸葡萄糖轉位酶-1(Pgm1)等6種同工酶在HBK鴨不同代次、不同品系和不同組織中的表達進行了研究，結果表明血清中的Es1和Trf、溶血素中的Car2和Gpi1、腎臟中的Pgm1、肝臟中的Es10等6種同工酶在相應的組織中能夠出現(xiàn)穩(wěn)定的帶型，重復性較好。檢測F2代和F3代，染色結果基本一致，除Car2位點F3代鴨比F2代多一條帶，Es10位點F3代比F2代少一條帶外，F(xiàn)2代和F3代存在一定程度的多態(tài)性，而且相互之間有一定差異，符合封閉群實驗動物的遺傳學要求[8]。

根據(jù)蛋殼顏色選育出B和Q兩個品系。利用聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的18對鴨微衛(wèi)星DNA標記位點，建立了HBK鴨群的分子遺傳學檢測方法。在F2和F3世代的4個群體中，共檢測到80個等位基因。每個位點上的等位基因數(shù)最多的為7個，最少的為3個。F2代HBK-B和HBK-Q群體中分別有8個和11個位點屬于高度多態(tài)位點，平均雜合度分別為0.519±0.160和0.549±0.237；在F3代HBK-B和HBK-Q分別有11和10個位點呈現(xiàn)出高度多態(tài)，雜合度分別為0.552±0.192和0.512±0.192，其他位點均呈現(xiàn)中度多態(tài)。利用16對微衛(wèi)星標記對F5代和F6代行遺傳多樣性分析，共檢測到71個等位基因，每個位點的平均等位基因數(shù)為4.14，與F2代和F3代相比有所下降；F5代和F6代鴨群偏離哈-代平衡的位點有所減少，分別僅有2個和4個位點顯著偏離平衡狀態(tài)；多態(tài)信息含量(PIC)大于 0.5的位點數(shù)量減少，F(xiàn)5代2個群體的平均PIC分別為0.511和0.512，F(xiàn)6代2個群體的平均PIC分別為0.48和0.505；F5代2個群體的期望雜合度(He)分別為0.575和0.574，F(xiàn)6代的He分別為0.546和0.566。表明經(jīng)過6個世代的繁育，偏離平衡的位點減少，以等位基因數(shù)目為標志的群體遺傳多樣性下降，近交程度呈上升趨勢，但群體的雜合度則維持相對穩(wěn)定；Q品系從F2～F6代的遺傳背景呈規(guī)律性變化，B品系遺傳背景存在一定的交替上升或下降，但總體趨于持續(xù)的上升或下降[9]。

2.4.2JD-SPF鴨的群體遺傳結構分析:采用17個微衛(wèi)星標記，結合PCR和毛細管電泳技術，在JD-SPF鴨群71個位點共檢測到119個等位基因，每個位點上等位基因數(shù)為3～13個，大部分位點上檢測到的等位基因數(shù)都接近于文獻報道鴨群有13個位點呈現(xiàn)出高度多態(tài)(PIC>0.5)，平均雜合度為0.5816 ± 0.0142，其它位點均呈現(xiàn)出中度多態(tài)，有5個位點處于哈-代平衡，其余12個位點顯著偏離，達到極顯著水平(P<0.01)[10]。

2.5 飼料營養(yǎng)與飲水

目前尚無SPF鴨的飼料營養(yǎng)標準，主要參考商業(yè)標準。SPF鴨飼養(yǎng)階段依據(jù)不同生理需要和生產(chǎn)需要分為育雛期、育成期、產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期四個階段。在參考旱式平養(yǎng)蛋鴨營養(yǎng)需要量的同時，根據(jù)隔離飼養(yǎng)和屏障飼養(yǎng)的變化，以及飼料滅菌過程產(chǎn)生的營養(yǎng)損失，制定了《實驗動物SPF鴨配合飼料》T/CALAS 17—2017團體標準草案。SPF鴨配合飼料的衛(wèi)生指標采用“豬雞鴨用飼料產(chǎn)品安全質量的要求(DB35/562)”，飼料滅菌標準參照“飼料輻照滅菌工藝本標準(DB32/T572)”，輻照強度及滅菌效果參照“飼料輻照殺菌技術規(guī)范(NY/T1448)”。

采用自動飲水裝置自由飲水，飲用無菌純化水。定期進行微生物含量的監(jiān)測，消毒與滅菌效果的評價參照“消毒與滅菌效果的評價方法與標準(GB15981)”。

2.6 生物學特性數(shù)據(jù)的采集與社會化共享

根據(jù)實驗禽生物學特性數(shù)據(jù)及其采集規(guī)范，采集HBK-B-SPF鴨和HBK-Q-SPF鴨的生物學特性數(shù)據(jù)，包括19項血液生理參數(shù)、15項生殖生理參數(shù)、1項生長發(fā)育生理參數(shù)、2項種呼吸生理參數(shù)、3項心血管生理參數(shù)、19項血液生化參數(shù)、11項解剖學參數(shù)和7項遺傳學數(shù)據(jù)，并進行了差異顯著性比較，發(fā)現(xiàn)部分數(shù)據(jù)存在顯著性差異，為新品系的建立提供了基礎。所有數(shù)據(jù)都提交國家實驗動物數(shù)據(jù)資源中心(E-平臺)，實現(xiàn)了數(shù)據(jù)資源的社會共享[11-14]。

2.7 疫病敏感性研究

針對HBK鴨進行了網(wǎng)狀內皮組織增生癥(REV)[15]、禽流感重組鴨瘟疫苗[16]的敏感性分析。利用HBK雛鴨接種鴨疫里氏桿菌24 h后，實驗組動物有縮頸、嗜眠、共濟失調等癥狀，36 h后出現(xiàn)死亡。剖檢可見心包炎、肝臟表面覆蓋一層薄膜狀的纖維素性滲出物等RA病典型臨床特征[17]；鴨病毒性肝炎I型強毒株感染HBK雛鴨，接種后4 h即可在雛鴨心、肝、腦、肺、胰腺、回腸、盲腸、直腸、法氏囊和脾臟組織中檢測到病毒RNA，隨著病程發(fā)展，RNA拷貝數(shù)持續(xù)升高，接種24 h后，肝臟中的病毒含量最高，說明強毒在HBK雛鴨的早期感染雛鴨的實質器官、免疫器官和消化系統(tǒng)等均具有廣泛的嗜性[18-19]；利用SPF鴨評估了當前在中國鴨群中流行的新城疫病毒基因型，表明比SPF雞更適合用于評估鴨源新城疫病毒的毒力[20]；利用SPF鴨胚首次發(fā)現(xiàn)鴨腸炎病毒感染能引起自噬，為鴨病毒性腸炎的致病機理研究提供了新思路[21]。除了基礎研究，在鴨病生物制品研制中也發(fā)揮了重要作用[22]。

利用鴨基因組抗原轉關相關蛋白TAP的單位點等位基因型，從HBK鴨群選育出4個免疫遺傳相關的家系，用鴨疫里氏桿菌感染上述B1、B2、B3 3個純系和B2/B4雜合鴨，結果死亡率無顯著性差異；接種鴨病毒性肝炎I型，結果B2鴨死亡率(36%)明顯低于其他型(73%～93%)[23]。接種表達H5亞型禽流感HA基因重組鴨瘟活載體疫苗，結果9周內B3群鴨血凝抑制抗體效價始終顯著高于B1、B2和B4群[16]。表明HBK鴨的TAP等位基因型與鴨病的致病性和免疫應答能力有關。

3 結語

鴨是絕大多數(shù)禽病的天然病原儲存庫和混合器，離開SPF鴨研究禽病獲得的成果是不完整的。從比較醫(yī)學的角度講，至今鴨肝炎仍是人乙型肝炎研究最適合的動物模型。事實上，鴨在人和禽用生物制品的研究、生產(chǎn)和檢定方面同樣不可或缺。

當前，我們已初步完成HBK和JD兩個品系的選育，實驗鴨的年產(chǎn)量從2013年的8 520羽發(fā)展到2015年的19 276羽[24]，為全國禽病科研單位和企業(yè)提供了良好的條件支撐。進一步結合疫病敏感型和高生產(chǎn)力，篩選相應的分子標記，選育遺傳學更純合、質量更優(yōu)良的SPF鴨，將是我們下一步的工作。