高乙惠，姜立新

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視窗模型的分類及其在影像學中的研究進展

高乙惠，姜立新

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院，上海 200030)

視窗模型(Window Chamber, WC)是直接在動物活體上研究疾病的發(fā)生、發(fā)展、及其對治療藥物的反應，尤其對各種腫瘤的研究,提供了很好的平臺。目前常用的視窗模型有脊背視窗模型、乳腺視窗模型、脊柱視窗模型以及顱腦視窗模型，目前對其成像方式多種多樣，包括熒光成像、超聲成像、磁共振(Magnetic Resonance Imaging, MRI)及核醫(yī)學(Positron Emission Tomography, PET)成像。這些成像方法的發(fā)展對于研究視窗內(nèi)組織的血管、代謝及藥物的治療效果具有重要意義，有利于深入了解疾病進展及研究疾病治療新方法。

視窗模型；熒光成像；超聲成像；光聲成像

0 引言

視窗模型在研究血管生成、腫瘤微環(huán)境及藥物治療反應等方面已經(jīng)有70多年的應用[1]?，F(xiàn)已經(jīng)發(fā)展為可以研究腫瘤發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移的一種方式，使得活體模型在細胞和分子水平的研究成為現(xiàn)實[2]。其主要優(yōu)勢在于可以在2～3周的時間內(nèi)動態(tài)觀察腫瘤及其微環(huán)境的變化[3]，對腫瘤生長檢測、腫瘤治療新藥物等方面都有一定的意義[4]。

1 視窗模型的分類

20世紀20年代，Sandison[5]制作出第一個視窗模型，用來觀察兔耳微循環(huán)及炎癥反應。Goodall等[6]于1965年第一次將視窗模型安裝在倉鼠臉頰上

以觀察腫瘤血管。視窗模型發(fā)展至今，種類及用途多種多樣，比如研究多種腫瘤的脊背視窗模型(Dorsal Skinfold Window Chamber, DSWC)、研究乳腺癌的乳腺視窗模型(Mammary Window Chamber, MWC)、研究脊髓血管及軸突的脊柱視窗模型(Spinal Cord Window Chamber, SCWC)以及研究大腦的顱內(nèi)視窗模型(Intracranial Window Chamber, ICWC)。

1.1 脊背視窗模型

脊背視窗模型(DSWC)是一種活體模型，過去三十多年在研究微血管方面一直發(fā)揮著重要的作用。Moy等[7]在1943年提出脊背視窗模型的概念，使用兩個鋁框架固定在大鼠背部制作成為視窗模型。通過不斷改進，已經(jīng)制作出可以應用于體型更小動物的脊背視窗模型，比如應用于小鼠及倉鼠。固定裝置也由鋁框架改為由鈦或更輕的材料制作的框架，并且具有更高的物理穩(wěn)定性。

脊背視窗模型的主要優(yōu)點是可以在活體直接觀察微血管的情況，研究活體在正常及患病情況下微血管的變化情況。脊背視窗模型在生物醫(yī)學研究中應用廣泛，例如，Laschke等[8]研究血管生成，Yuan等[9]研究腫瘤進展及微血管靶向分子生物治療的評價等。Dewhirst等[10]通過將腫瘤細胞系或原發(fā)腫瘤細胞移植入脊背視窗進行腫瘤研究，可以直接觀察腫瘤及其周圍血管。對脊背視窗模型的很多研究都表明腫瘤血管與正常血管的諸多不同，并通過諸多測量參數(shù)進行量化，例如血管通透性，血紅蛋白飽和度，紅細胞通量，氧分壓等，這些參數(shù)被作為腫瘤治療后的生物標志物進行研究[2]。

1.2 乳腺視窗模型

越來越多的研究表明，原位和異位器官環(huán)境的差異性將會影響腫瘤細胞基因表達腫瘤生長、侵襲力、血管生成、轉(zhuǎn)移、藥物的輸送和對許多腫瘤類型中治療藥物的敏感性。乳腺視窗模型是將乳腺癌細胞系移植入雌性動物的乳房，可以重復、持續(xù)并且無侵入性地動態(tài)觀察原位乳腺癌的生長及血管生成，對研究原位腫瘤的特性有更大的優(yōu)勢。原位乳腺癌模型已廣泛應用于研究，如用于研究乳腺癌新型轉(zhuǎn)移模型，新型分子靶點、生長因子對血管生成和乳腺癌腫瘤生長的影響、乳腺及基因治療等方面[11]。Kedrin等[12]使用可以穩(wěn)定表達光轉(zhuǎn)化熒光蛋白Dendra2的乳腺癌細胞系MTLn3與乳腺視窗模型相結(jié)合，以研究腫瘤的轉(zhuǎn)移特性。該實驗表明腫瘤血管周圍微環(huán)境(血管周圍的腫瘤組織)富含腫瘤相關(guān)的巨噬細胞和細胞外基質(zhì)，刺激乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。Schafer等[13]在視窗蓋玻片表面涂上鉑卟啉，使用MDA-MB-231/eGFP乳腺癌細胞系，在與蓋玻片接觸的乳腺癌組織和正常乳腺組織的范圍內(nèi)測量氧分壓水平。

1.3 脊柱視窗模型

脊柱視窗模型(SCWC)用于研究脊髓損傷、脊髓腫瘤、脊髓炎及脊髓缺血后血管、軸突的變化。目前對小鼠脊髓的研究是通過手術(shù)暴露脊髓，利用顯微鏡等顯示脊髓結(jié)構(gòu)，但需要重復手術(shù)進行成像，對脊髓進行長期觀察將會增加脊髓感染，引起脊髓損傷并對動物造成額外的疼痛[14-15]。脊柱視窗模型的優(yōu)勢是可以在活體情況下將視窗固定在脊柱的特定部位進行連續(xù)觀察，避免重復手術(shù)對動物的傷害。Fenrich等[16]對43只成年C57小鼠安裝脊柱視窗模型。他們研究發(fā)現(xiàn)在植入視窗后的數(shù)小時內(nèi)小鼠動作活躍，小鼠體重隨著時間持續(xù)增加，視窗對脊髓細胞的結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響，且在成像中偽影明顯減少，是長時間研究小鼠脊髓的有用工具。Farrar等[15]使用脊柱視窗模型研究激光誘導小鼠脊髓損傷之后小膠質(zhì)細胞及血管的變化，進行多次長時間的連續(xù)成像觀察，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞的數(shù)量和范圍隨著時間不斷增加，且在損傷后24小時內(nèi)變化最大。

1.4 顱內(nèi)視窗模型

顱內(nèi)視窗模型(ICWC)常用于通過光學成像研究動物大腦的結(jié)構(gòu)及其皮質(zhì)功能、腦腫瘤以及大腦對藥物治療的反應等方面。Bok等[17]使用雙光子顯微鏡觀察顱內(nèi)視窗模型局灶性腦缺血小鼠大腦中小膠質(zhì)細胞的活動，并成功在局灶性腦缺血區(qū)域觀察到Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞的活動，這有助于開發(fā)抑制小膠質(zhì)細胞活性的藥物。Burrell等[18]采用小鼠顱內(nèi)視窗模型研究腫瘤生長及藥物對顱內(nèi)結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)骨髓起源的細胞在腦腫瘤組織血管形成中的作用，并在長達8周的時間內(nèi)對大腦進行重復觀察。

2 視窗模型的影像學研究

解剖學成像和功能性成像是研究腫瘤生物學的兩種主要成像手段。解剖學成像常用于測量腫瘤大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其對周圍組織的侵襲，如超聲、磁共振(Magnetic Resonance Imaging, MRI)以及核醫(yī)學(Positron Emission Tomography, PET)成像等。但是在形態(tài)學變化之前常伴隨著腫瘤微環(huán)境的變化，如細胞受體表達失調(diào)、異常代謝途徑、血管形成及組織氧合的變化[19]，這些功能變化的成像被稱為功能性成像，如熒光成像和光聲成像等。解剖學及功能性成像相互結(jié)合，能夠更加全面地研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、對治療藥物的反應等。

2.1 熒光成像

熒光成像在腫瘤研究中應用廣泛，包括研究腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲、研究腫瘤細胞與宿主微環(huán)境的相互作用、細胞受體的檢測以及腫瘤血管等方面。視窗模型的發(fā)展有助于使用光學技術(shù)來研究腫瘤在體內(nèi)的動態(tài)變化[20]。常用的熒光成像手段包括熒光顯微鏡、激光共聚焦熒光顯微鏡以及高光譜熒光顯微鏡等。

2.1.1 熒光顯微鏡

Oye等[21]使用熒光顯微鏡觀察裸鼠脊背視窗模型。視窗內(nèi)種植可以穩(wěn)定表達A-07-GFP人黑色素瘤細胞，在成像時尾靜脈注射TRITC–dextran后觀察視窗內(nèi)部血管，通過連續(xù)觀察看到視窗內(nèi)腫瘤組織周邊六種血管的顯示：正常組織小動脈，正常組織毛細血管，正常組織小靜脈，腫瘤組織小動脈，腫瘤組織毛細血管和腫瘤組織小靜脈。并繪制出這六種血管內(nèi)熒光強度與時間相關(guān)曲線，測量視窗內(nèi)不同血管內(nèi)的血流速度，這對研究腫瘤內(nèi)部血管及其對治療藥物的代謝提供一個很好的平臺。

2.1.2 激光共聚焦熒光顯微鏡成像

Azusa Maeda等[3]使用激光共聚焦顯微鏡觀察裸鼠脊背視窗模型，將DsRed-BxPC-3人胰腺癌細胞系種植到脊背視窗模型中，成像前通過尾靜脈注射FITC-Dextran以顯示功能性血管，并使用4倍物鏡用于共聚焦成像。他們研究發(fā)現(xiàn)，在相同大小的感興趣區(qū)域內(nèi)，與荷瘤小鼠相比，正常小鼠的功能血管面積更大，且在視窗模型安裝后的第21天差異最為顯著。使用骨化算法來分析血管網(wǎng)絡，研究表明與相同大小的正常區(qū)域相比，腫瘤血管比正常的血管更加扭曲，腫瘤血管的長度及扭曲度會隨著腫瘤的生長而增加。Oraevsky等[4]用白光及小于400 nm的光分別從視窗底部照射對表達綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的前列腺腫瘤進行成像以檢測腫瘤生長。熒光圖像可以更加清楚地顯示腫瘤的位置、腫瘤內(nèi)部及其周圍的血管，并可以測量腫瘤組織的大小。

2.1.3 高光譜熒光成像

高光譜成像常用來顯示組織中的血液灌注，并繪制出血紅蛋白飽和度的圖像，能夠以逐個像素為基礎獲得熒光發(fā)射或反射/透射光譜，其主要優(yōu)點在于它可以使用化學計量算法定量分離多種對比度來源。Sorg等[22]使用高光譜熒光成像觀察種植有4T1乳腺癌細胞，其可以穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Protein, RFP)并可在缺氧調(diào)控啟動子(Hypoxia Regulatory Element, HRE )作用下于細胞乏氧時誘導GFP的表達，實驗過程中分別給予小鼠空氣、氧氣及處死后進行成像，用以測量不同情況下視窗內(nèi)腫瘤微血管的血紅蛋白飽和度，并通過GPF的表達量來區(qū)分腫瘤乏氧區(qū)域。

2.2 光聲成像

光聲學(Photoacoustics, PA)是一種新興的生物醫(yī)學研究模式，具有強大的癌癥檢測和鑒定潛力。在光聲成像(Photoacoustic Imaging, PAI)中，通常以高能脈沖激光照射生物樣品。光聲成像的原理是，當光照射生物組織時，其能量部分被吸收并轉(zhuǎn)化成熱，產(chǎn)生熱彈性膨脹和聲波。其產(chǎn)生超聲波與生物組織的光吸收系數(shù)成比例，通過對超聲信號的檢測，從而形成樣品相對光吸收的圖像。Oraevsky等[4]用光聲成像觀察脊背視窗模型中的GFP-PC-3前列腺腫瘤組織。他們發(fā)現(xiàn)光聲成像可以顯示腫瘤血管網(wǎng)并且使組織較深層的血管顯示更加清晰。

2.3 超聲成像

超聲成像是利用超聲聲束掃描組織，通過對反射信號的接收及處理以獲取組織內(nèi)部的圖像。Oraevsky等[4]使用超聲探測器發(fā)射并檢測超聲信號以獲取視窗模型內(nèi)前列腺腫瘤的超聲圖像。超聲圖像可以顯示視窗內(nèi)腫瘤組織的結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部回聲隨時間的變化情況。

2.4 MRI成像

MRI成像是通過對靜磁場中的生物體施加某種特定頻率的射頻脈沖，由于生物組織中含水量豐富，基于核磁共振的原理使氫質(zhì)子受到激勵[19]，停止脈沖后，質(zhì)子在弛豫過程中產(chǎn)生MR(Magnetic Resonance)信號，通過對MR信號的接收、空間編碼和圖像重建等過程成像。Leung[19]通過對乳腺視窗模型進行MRI成像，視窗內(nèi)種植MDA-MD-231乳腺癌細胞。使用多切面多回波序列(Multi-Slice Multi-Echo, MSME)及快速獲取弛豫增強序列(Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement, RARE)來獲得二維的T1W(T1 weight)及T2W(T2 weight)權(quán)圖像，之后重建為視窗模型的三維圖像。他們研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織有長T1及長T2特性，因而在T1加權(quán)圖像上比周圍組織信號更弱，而在T2加權(quán)圖像上比周圍組織信號更強，并且在T2加權(quán)像中腫瘤組織內(nèi)部信號不均，可能是因為腫瘤信號較弱的區(qū)域內(nèi)含有較多的脫氧血紅蛋白，信號較強的區(qū)域內(nèi)含水量較多的原因。由于腫瘤與周圍組織的高對比度，采用T2加權(quán)像來測量腫瘤大小并監(jiān)測其生長速度。

2.5 PET成像

PET成像是核醫(yī)學成像的一種，是功能成像模式，通過注射放射性標記藥物提示示蹤劑分布的成像方法。常用的放射性藥物是F-FDG[18]，其原理是利用惡性腫瘤常表現(xiàn)出異常高水平的糖酵解代謝，使FDG(Fluorodeoxyglucose)在惡性腫瘤中的攝取率顯著增加，在PET掃描中惡性腫瘤組織可攝取更多FDG而明顯顯示。Leung[19]利用PET成像觀察種植MDA-MD-231乳腺癌細胞的乳腺視窗模型，研究顯示視窗內(nèi)乳腺癌腫瘤及其周圍組織對FDG的高攝取率，并提示乳腺癌對周圍組織代謝的影響。

2.6 多模態(tài)成像

上述成像方法各有利弊，多模態(tài)成像可以綜合上述成像方法的優(yōu)點。多模態(tài)成像的目的是對同一研究對象采用不同的影像學方法，結(jié)合各個成像方法的優(yōu)勢，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理將圖像融合以顯示更多影像學信息，提高對腫瘤檢測的精確度和靈敏性。目前常使用的較為成熟的多模態(tài)成像手段包括MRI或PET與熒光成像結(jié)合、熒光與光譜成像結(jié)合以及將光聲、超聲以及熒光成像相結(jié)合的三模態(tài)成像系統(tǒng)。Gaustad等[23]使用增強MRI與熒光顯微鏡相結(jié)合，將A-07-GFP人黑色素瘤種植入脊背視窗模型內(nèi)，以獲取腫瘤微血管的形態(tài)及功能信息。Schafer等[2]在研究乳腺癌時使用乳腺視窗模型與共聚焦熒光顯微鏡成像、PET及MRI成像相結(jié)合，該實驗使三種成像手段的分辨率、成像深度與功能性成像相輔相成，對研究乳腺癌的生物學特征及治療藥物的研發(fā)提供了很好的平臺。

3 結(jié)語

綜上所述，各種視窗模型的建立及多種影像學的交叉研究對我們深入理解腫瘤尤其是腫瘤血管的生成、腫瘤微環(huán)境的變化、腫瘤的轉(zhuǎn)移，及對腫瘤治療藥物的進一步研究將提供更加有用的信息。

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Classification of window chamber model and its research progress in iconography

GAO Yi-hui, JIANG Li-xin

(Shanghai Jiaotong University Affiliated Sixth People's Hospital, Shanghai 200030, China)

The window chamber models, including the mammary window chamber model, the spine window chamber model and the craniocerebral window chamber model, are widely used in iconography, such as fluorescence imaging, ultrasound imaging, magnetic resonance imaging and PET imaging. The development of these imaging methods is of great importance to the study of the vascularity, metabolism, and drug therapy of the tissues in the windows, which is helpful to deepen understanding the progress of disease and the research on new treatment methods.

window chamber; fluorescence imaging; ultrasound imaging; photoacoustic imaging

R443.+1

A

1000-3630(2018)-04-0326-04

10.16300/j.cnki.1000-3630.2018.04.006

2018-03-02;

2018-04-18

國家自然科學基金面上項目(81371574、81771850)。

高乙惠(1992－), 女, 河南商丘人, 研究方向為胰腺癌的超聲治療。

姜立新,E-mail:jinger_28@sina.com