賀梨萍

1997年2月，英國Roslin研究所伊恩·維爾穆特（Ian Wilmut）教授率領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)在頂級學(xué)術(shù)期刊《自然》（Science）公布了“多莉”羊的誕生。這只實(shí)際上出生于1996年5月的首例體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物自此成為動(dòng)物界的“明星”，也徹底顛覆了人類對生殖發(fā)育經(jīng)典理論的認(rèn)識。

“多莉”誕生22年之后，和人類最為接近的靈長類動(dòng)物食蟹猴的克隆體誕生。這一次，突破性成果發(fā)生地是中國。中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所孫強(qiáng)、蒲慕明領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)為最先誕生的這兩只克隆猴取名為“中中”和“華華”。

該項(xiàng)成果歷時(shí)5年，相關(guān)論文則于1月25日以封面文章的形式被《細(xì)胞》（Cell）雜志收錄。罕見的是，論文從投稿到接收甚至歷時(shí)不到一個(gè)月。這或許一定程度上反映了蒲慕明等人希望在世界范圍內(nèi)占據(jù)“克隆猴”優(yōu)勢的急切，“中國只比國外領(lǐng)先一年”，蒲慕明如此提及。

中國科學(xué)院院士季維智在接受采訪時(shí)同樣表示，“克隆猴的出現(xiàn)確實(shí)只是一個(gè)時(shí)間問題。”

季維智是靈長類動(dòng)物研究領(lǐng)域的權(quán)威，現(xiàn)任昆明理工大學(xué)靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院院長。上世紀(jì)90年代末，季維智在全球最頂級的非人靈長類研究機(jī)構(gòu)—美國俄勒岡國家靈長類研究中心做訪問學(xué)者。

當(dāng)然，這并不是意味著“克隆猴”能夠輕易完成，而是二十余年時(shí)間里久未出現(xiàn)進(jìn)展的克隆技術(shù)在2014年終于有所突破，科學(xué)家對“克隆”的干預(yù)逐漸找到方向，一定程度上提高了克隆效率。

值得一提的是，在中國首創(chuàng)“克隆猴”之際，外界會(huì)聯(lián)想到該領(lǐng)域曾經(jīng)的領(lǐng)跑者美國—為何美國沒能成功？答案是，2000年之后，美國科學(xué)界對克隆猴由“雄心勃勃”轉(zhuǎn)為近乎“偃旗息鼓”。分水嶺之一是美國匹茲堡大學(xué)Gerald Schatten教授彼時(shí)的結(jié)論：基于“多莉”的克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)克隆猴是“行不通的”。Schatten此前經(jīng)過6年嘗試，其團(tuán)隊(duì)使用了724個(gè)猴卵，只培育出33個(gè)胚胎，最終無一成活。

美國“克隆猴”逐漸偃旗息鼓，并將研究的重心轉(zhuǎn)向以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)，但大洋彼岸的中國科學(xué)家卻沒有停下腳步?！耙粋€(gè)是實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的問題，另一個(gè)是集中精力的問題，所以由中國創(chuàng)造了目前這個(gè)結(jié)果是很自然的。”季維智表示。

“克隆猴”技術(shù)難點(diǎn)

“多莉”誕生至今已有超過20種哺乳動(dòng)物實(shí)現(xiàn)克隆，其技術(shù)均為體細(xì)胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，簡稱“SCNT”）。該技術(shù)原理并不復(fù)雜，研究人員將一種體細(xì)胞培養(yǎng)后注入去除遺傳物質(zhì)的卵子，通過人工方法激活后再移植到代孕母體發(fā)育成個(gè)體。

而克隆的核心在于，如何讓已經(jīng)高度分化的體細(xì)胞重新變回分化前的狀態(tài)，這種類似“時(shí)光逆轉(zhuǎn)”的反自然過程被稱為“重編程”。季維智提到，“克隆難點(diǎn)就在于體細(xì)胞，科學(xué)家要解決的一個(gè)基本的科學(xué)問題就是，如何把高度分化的細(xì)胞變成多能性，具備像精子一樣的功能?！?/p>

長期從事克隆研究的中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究員、世界首例基因編輯克隆犬“龍龍”的培育者賴良學(xué)在接受采訪時(shí)表示，“重編程是一個(gè)很復(fù)雜的過程，把細(xì)胞核放進(jìn)一個(gè)卵子，這個(gè)卵子的環(huán)境是我們控制不了的。這就像我們把一個(gè)石頭扔到一個(gè)大海里面，這個(gè)石頭具體到了哪兒，將來流向哪里，我們是控制不了的，你也很難對它進(jìn)行有效干預(yù)?！?/p>

根據(jù)孫強(qiáng)的介紹，克隆猴主要有三個(gè)難點(diǎn)。首先是細(xì)胞核不易識別，“去核”難度大。其次，克隆過程中，體細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)入卵細(xì)胞時(shí)，需先“喚醒”卵細(xì)胞，然后才啟動(dòng)一系列發(fā)育“程序”，但卵細(xì)胞容易提前激活。最后，體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育效率低，絕大多數(shù)克隆胚胎都難以正常發(fā)育，往往胎死腹中。

在孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)的研究中，團(tuán)隊(duì)最終利用猴胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行核移植。最終將79枚克隆胚胎（處于二細(xì)胞期至囊胚期）移植入21只代孕母猴中，最終4只代孕成功的母猴有2只流產(chǎn)，剩下2只正常懷孕超過140天，然后通過剖腹產(chǎn)手段獲得2只存活的猴，即“中中”和“華華”。

“中中”和“華華”誕生的墊腳石

體細(xì)胞重編程的難以控制，使得動(dòng)物克隆效率極為低下，長期停留在1%以下的水平。

對于此次克隆猴的成功，未曾走出國門留學(xué)、自稱“土鱉一代”的孫強(qiáng)率領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)毫無疑問是功臣，其中諸多媒體爭相報(bào)道的即是論文第一作者劉真博士耗時(shí)3年訓(xùn)練的快速“去核”“注核”的本事。

蒲慕明提到劉真時(shí)表示，“體細(xì)胞核移植技術(shù)流程非常關(guān)鍵，操作越快，卵細(xì)胞受損就會(huì)越小，劉博士在這方面做的很出色。劉真可能在10秒之內(nèi)對卵母細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞去核操作，在15秒之內(nèi)將體細(xì)胞注入到卵母細(xì)胞當(dāng)中?！痹谄涯矫骱蛯O強(qiáng)的眼里，就細(xì)胞“去核”“注核”技術(shù)，劉真是當(dāng)之無愧的“世界冠軍”。

對于孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)的成功，季維智表示，“顯微操作的時(shí)候技術(shù)熟練是條件之一，另一個(gè)成功的關(guān)鍵在于他們找到了體細(xì)胞去甲基化、乙?；暮线m配方。”談及體細(xì)胞的去甲基化、乙?；@不開孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)成功的墊腳石。

體細(xì)胞甲基化、乙?；瘜?shí)際上都是體細(xì)胞重編程過程中的表觀遺傳修飾障礙。無論DNA、RNA還是蛋白質(zhì)，其表面均有例如甲基、乙?；鹊念~外基團(tuán)，這些基團(tuán)就被稱為“修飾”，它們受細(xì)胞狀態(tài)影響，也能反過來影響細(xì)胞狀態(tài)。

克服表觀遺傳修飾障礙的轉(zhuǎn)機(jī)出現(xiàn)在2014年。華裔科學(xué)家、美國哈佛醫(yī)學(xué)院教授張毅實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，在體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)中，組蛋白H3K9me3的修飾所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默是阻擋細(xì)胞重編程進(jìn)行的“屏障”，加入去甲基化酶Kdm4d就可以使得重編程效率大大增加。

隨后的2016年，上海同濟(jì)大學(xué)的高紹榮團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用去甲基化酶Kdm4b和Kdm5b能極大提高小鼠克隆胚胎的囊胚率及出生率。而早在2006年，日本理化學(xué)研究所RIKEN的Wakayama團(tuán)隊(duì)則發(fā)現(xiàn)TSA能提高小鼠克隆效率，TSA就是一種乙?；敢种苿?/p>

賴良學(xué)表示，“在張毅的這項(xiàng)研究之前，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室也都在想辦法進(jìn)行干預(yù)，但大都沒找到關(guān)鍵點(diǎn)?！倍揪S智上述提到的“合適配方”指的則是，孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)此番在體細(xì)胞核移植體系中找到了TSA和Kdm4d的理想濃度組合。

由此看來，“中中”和“華華”的誕生實(shí)際上并不是單個(gè)實(shí)驗(yàn)室的成果，更像是克隆領(lǐng)域近幾年發(fā)展的一項(xiàng)集成。高紹榮在點(diǎn)評該成果時(shí)也表示，“離不開科學(xué)家們長期以來對克隆胚胎重編程機(jī)制的研究”。也正是基于科學(xué)家近年來的突破性進(jìn)展，季維智才認(rèn)為，“克隆猴確實(shí)只是一個(gè)時(shí)間問題了?！?/p>

2000年后美國基本“偃旗息鼓”

中國此番獲得全球首例克隆猴，被稱為“彎道超車”。

曾經(jīng)克隆猴領(lǐng)域的領(lǐng)跑者當(dāng)屬美國。曾被科學(xué)界認(rèn)為最可能第一個(gè)克隆出猴子的即是美國俄勒岡靈長類研究中心的著名科學(xué)家美籍哈薩克斯坦科學(xué)家沙烏科萊特·米塔利波夫（Shoukhrat Mitalipov）。

早在2007年，米塔利波夫團(tuán)隊(duì)在《自然》發(fā)表成果：利用細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)，成功用猴子皮膚細(xì)胞克隆出胚胎，并提取出兩個(gè)干細(xì)胞系。這是人類首次以體細(xì)胞克隆的方式獲得靈長類胚胎。

2010年，米塔利波夫率領(lǐng)團(tuán)隊(duì)更是成功移植了克隆猴胚胎，但胚胎發(fā)育至81天，以流產(chǎn)告終。這也是在孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)完成克隆之前，全球離實(shí)現(xiàn)克隆猴距離最近的一項(xiàng)研究。

而在米塔利波夫之前，美國的科學(xué)家在2000年時(shí)曾宣布用胚胎分裂的方式對猴進(jìn)行克隆。研究人員把107個(gè)猴胚胎分裂成368個(gè)胚胎，結(jié)果有4個(gè)發(fā)育成熟但胎死腹中，只有一只在胚胎分裂157天之后幸運(yùn)地降生。這只也就是曾經(jīng)一度被稱為首次成功克隆獲得的靈長類動(dòng)物“Tetra”。

但實(shí)際上，胚胎分裂方式并不是真正意義上的體細(xì)胞克隆，因此也未引起過多關(guān)注。

然而，除了米塔利波夫團(tuán)隊(duì)，美國在克隆研究的巔峰期之后又如何看待這項(xiàng)研究？季維智和賴良學(xué)都提及，“近十幾年來，美國已鮮有實(shí)驗(yàn)室研究克隆候?！?/p>

賴良學(xué)提及，Schatten在2000年左右提出的基于“多莉”的克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)克隆猴是“行不通的”，這無疑是給美國克隆研究“潑了冷水”。

“Schatten當(dāng)時(shí)用體細(xì)胞克隆，他認(rèn)為胚胎發(fā)育超越不了八細(xì)胞期（哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的一個(gè)階段）?！奔揪S智也同樣表示，“實(shí)際上，我們在2007年就把這個(gè)觀點(diǎn)否定掉了，我們當(dāng)時(shí)就發(fā)現(xiàn)是可以達(dá)到囊胚階段的。并且還證明了，跟正常的胚胎相比，克隆胚胎在八細(xì)胞期和二細(xì)胞期的時(shí)候確實(shí)是有很高的DNA甲基化水平?！痹擁?xiàng)研究由季維智和中科院動(dòng)物所周琪團(tuán)隊(duì)合作完成，也是首次證明了克隆胚胎的甲基化水平異常。

針對克隆猴近十幾年來在美國遇冷的現(xiàn)象，賴良學(xué)認(rèn)為，“猴子畢竟是靈長類動(dòng)物，成本很高，不像其它實(shí)驗(yàn)一樣，各種方法、技術(shù)都去試。如果一段時(shí)間試不出來，經(jīng)費(fèi)又用完了，很多實(shí)驗(yàn)室可能也就停掉了克隆實(shí)驗(yàn)?！?/p>

不過，在季維智看來，經(jīng)費(fèi)、甚至猴子資源都不是美國近十幾年來在克隆猴方面遇冷的根本原因?！斑@些有一定影響，但關(guān)鍵是美國的興奮點(diǎn)沒有放在克隆上面了，而是轉(zhuǎn)向了基因編輯等其他領(lǐng)域。”

此番克隆猴的出現(xiàn)，會(huì)在全球范圍內(nèi)再次刮起一場克隆巔峰嗎？答案拭目以待。不過，蒲慕明在成果發(fā)布之際曾提到，“基因編輯在胚胎克隆上有很多問題無法解決，比如脫靶等。但在體細(xì)胞克隆上進(jìn)行基因編輯時(shí)，這些問題都比較容易解決?！?/p>