王 進(jìn)(綜述) 夏 軍(審校) 王思群 魏亦兵 陳飛雁 黃鋼勇 陳 杰 石晶晟 趙廣雷

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院骨科 上海 200040)

生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域組織工程技術(shù)的發(fā)展為組織、器官的修復(fù)、再生提供了新的方向和手段[1-3]。為尋找合適的生物支架材料,學(xué)者們做了大量的嘗試,包括金屬、生物陶瓷和生物聚合物類材料。但是,金屬材料的生物相容性及降解性仍存在問題;生物陶瓷類材料脆性高且降解速率不穩(wěn)定,如羥基磷灰石、磷酸三鈣等;而生物聚合物類材料機(jī)械性能較差,降解速度較快,如膠原、明膠和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacid,PLGA)等,這些缺陷都極大地限制了其在生物組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用[4-5]。

絲素蛋白作為一種天然材料,具有良好的生物相容性和一定的機(jī)械強(qiáng)度[6],已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,如手術(shù)縫線、藥物緩釋材料[7]。絲素蛋白作為各種組織工程支架材料[8-11],主要應(yīng)用形式有水凝膠[12]、薄膜[13-14]、納米纖維[15]及三維多孔支架[16]等。Fan等[17]先后在兔、豬體內(nèi)應(yīng)用絲素蛋白/骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞支架重建前交叉韌帶獲得成功,具有可靠的機(jī)械強(qiáng)度,能夠滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日常的活動(dòng)需求。這些研究結(jié)果在一定程度上體現(xiàn)了絲素蛋白作為組織支架材料的可行性。

生物支架材料除了需具備良好的生物相容性和一定的機(jī)械強(qiáng)度,可降解性也是一個(gè)不可忽視的要素。根據(jù)美國(guó)藥典對(duì)于可吸收(縫線)生物材料的定義,可降解材料在體內(nèi)60天后應(yīng)失去大部分強(qiáng)度,故認(rèn)為蠶絲縫線為不可降解材料[18],但越來越多的研究已經(jīng)表明,絲素蛋白在體內(nèi)具有可降解性。Cao等[19]研究發(fā)現(xiàn)絲素蛋白在體內(nèi)可以降解且降解產(chǎn)物主要是可溶性的肽鏈和游離氨基酸,易于被機(jī)體代謝或吸收,對(duì)人體無毒性作用及其他不良反應(yīng)。Wang等[20]通過將三維絲素蛋白支架植入實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)炎癥相關(guān)因子(如TNF-α、INF-γ、IL-6和IL-4等)在mRNA水平表達(dá)量很低,幾乎不可測(cè),并且局限于絲素蛋白植入部位,雖然INF-γ的表達(dá)量在支架植入體內(nèi)8周時(shí)有短暫的升高,但是在6個(gè)月時(shí)顯著下降,說明機(jī)體對(duì)絲素蛋白支架的免疫反應(yīng)是極其輕微并且局限的,Thurber等[21]的研究結(jié)論也與之相符合。于丹丹等[22]利用超聲成像技術(shù)評(píng)估絲素蛋白在大鼠體內(nèi)的降解情況,也發(fā)現(xiàn)絲素蛋白凝膠植入Wistar大鼠體內(nèi)16周后其縱徑、寬徑、橫徑都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的減小,因此也認(rèn)為絲素蛋白具有可降解性。但是,在組織工程中,理想狀態(tài)下生物材料的降解速率應(yīng)時(shí)刻與組織再生的速率相匹配[23],且可以人為地調(diào)控其降解速率,因此材料的可控降解性顯得更為重要。目前研究的絲素蛋白主要來源于家蠶的蠶絲,其降解速率受到以下多種因素的影響,通過對(duì)下列因素的研究有望實(shí)現(xiàn)對(duì)絲素蛋白降解速率的可調(diào)控性。

分子結(jié)構(gòu)蠶絲蛋白主要包括包裹在外周的絲膠蛋白和處于核心位置的絲素蛋白,其中絲膠蛋白約占25%,絲素蛋白約占75%,有研究證明絲膠蛋白是引起免疫排斥反應(yīng)的主要成分。核心的絲素蛋白分子包含一條輕鏈(L鏈)和一條重鏈(H鏈),形成了SILK Ⅰ和SILK Ⅱ兩種構(gòu)型。SILKⅠ型結(jié)構(gòu)呈曲柄型,主要由無規(guī)則的蜷曲和α螺旋構(gòu)成,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,易于分解;而SILK Ⅱ結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,主要由反向平行的β折疊結(jié)構(gòu)組成,是絲素蛋白的基礎(chǔ)構(gòu)像[24]。絲素蛋白往往同時(shí)含有SILK Ⅰ和SILK Ⅱ兩種構(gòu)型,并且這兩種構(gòu)型的相對(duì)比例對(duì)其降解性有較大的影響,SILK Ⅱ所占比例越高,降解性越低。而兩者的比例受到多種因素(如溫度、化學(xué)試劑、pH等)的影響。黃訓(xùn)亭等[25]研究發(fā)現(xiàn),將絲素蛋白多孔膜經(jīng)過乙醇處理后,SILK Ⅱ結(jié)構(gòu)所占比例升高,降解速率減慢;Hu等[26]發(fā)現(xiàn),當(dāng)提高絲素蛋白制備過程中水蒸氣退火的溫度(>40 ℃)時(shí),絲素蛋白中SILK Ⅱ結(jié)構(gòu)所占比例也隨之增加,在相同的酶促環(huán)境下降解速率下降。改變冷卻溫度或用碳化二亞胺或乙醇進(jìn)一步處理絲素蛋白,其β折疊結(jié)構(gòu)增多,降解性下降。增加或減少絲素蛋白中SILK Ⅱ(β折疊)的含量可以改變其降解性。

形態(tài)自然狀態(tài)下的絲素蛋白具有豐富的β-折疊結(jié)構(gòu),所以降解速率較慢,而經(jīng)過人工處理的絲素蛋白支架材料包括水凝膠、絲素蛋白膜、多孔的海綿結(jié)構(gòu)等,其結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)比例減少,所以其更容易被降解。黃訓(xùn)亭等[25]的研究發(fā)現(xiàn),由于天然蠶絲中絲素蛋白纖維分子鏈結(jié)構(gòu)更為規(guī)整、SILK Ⅱ含量更高,而多孔絲素蛋白纖維膜規(guī)整性較差,因此天然的纖維結(jié)構(gòu)比膜結(jié)構(gòu)的降解速度更慢。若應(yīng)用絲素蛋白作為組織工程的材料,由于各個(gè)組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的不同,需“因地制宜”選用不同形態(tài)的絲素蛋白支架材料,此時(shí)絲素蛋白在不同狀態(tài)下的降解性也應(yīng)值得關(guān)注。

三維孔徑生物支架材料應(yīng)為細(xì)胞提供附著、生長(zhǎng)及增殖的場(chǎng)所。支架材料的微觀結(jié)構(gòu),尤其是其能否最大程度模擬自然狀態(tài)下骨基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等種子細(xì)胞的長(zhǎng)入、增殖有重要的影響。千建峰等[27]通過觀察不同孔徑絲素蛋白支架在SD大鼠活體內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的降解,發(fā)現(xiàn)孔徑大小與絲素蛋白材料降解有明顯相關(guān)性,且孔徑較大的絲素蛋白支架比孔徑較小的降解速度快,提示可通過改變絲素蛋白支架的孔徑,有效地干預(yù)其在生物體內(nèi)的降解速率以匹配不同組織修復(fù)的要求。Wang等[20]也通過研究體內(nèi)3D支架材料的降解,發(fā)現(xiàn)三維支架孔徑越小,降解速率越低。但組織細(xì)胞的長(zhǎng)入還與孔徑大小密切相關(guān)。在臨床應(yīng)用絲素蛋白三維多孔支架時(shí),不僅要考慮材料的強(qiáng)度和組織的長(zhǎng)入情況,不同孔徑材料的降解性也是一個(gè)重要的考慮因素。

絲素蛋白濃度有研究發(fā)現(xiàn)絲素蛋白溶液的濃度越高,所制成的支架材料的降解速率越慢。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn),以六氟異丙醇為溶劑所制得的支架材料與水作為溶劑相比,所得材料中絲素蛋白的濃度較高,降解速率較慢。任何可能影響絲素蛋白溶液濃度的方法或處理都可能會(huì)改變材料的降解性,這也為絲素蛋白應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域,對(duì)其降解性的控制提供了可行的手段,值得進(jìn)一步研究。

種植部位絲素蛋白作為骨修復(fù)支架材料,植入機(jī)體后其降解速率受周圍微環(huán)境的影響較大。植入不同的動(dòng)物、不同的部位,其生化環(huán)境、機(jī)械受力情況、免疫因素、局部的生物化學(xué)因素均可以改變降解速率[19],詳細(xì)作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

酶的降解絲素蛋白可以被多種蛋白酶(如α-胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧化酶等)催化降解成多肽鏈或游離氨基酸。絲素蛋白分為以β折疊為主的結(jié)晶區(qū)和以無規(guī)則結(jié)構(gòu)為主的非結(jié)晶區(qū),酶催化分解絲素蛋白的過程中會(huì)優(yōu)先降解非結(jié)晶區(qū)[28]。Numata等[29]研究發(fā)現(xiàn),由于蛋白酶ⅩⅣ能夠作用于結(jié)晶區(qū),而α-胰蛋白酶對(duì)結(jié)晶區(qū)無作用,只能作用于非結(jié)晶區(qū),并且隨著非結(jié)晶區(qū)的降解破壞,結(jié)晶區(qū)(β折疊)所占的比例逐漸增加,故其對(duì)絲素蛋白的降解作用明顯小于前者。隨著酶的濃度、作用時(shí)間及其與底物接觸面積的增加,降解速率也隨之增加。不同的酶具有不同的作用位點(diǎn),因此其對(duì)絲素蛋白的降解作用也有差異。

γ射線γ射線又稱丙種射線,波長(zhǎng)極短、穿透性極高,醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用其來殺死腫瘤細(xì)胞。金洹宇等[30]研究了不同輻射劑量的γ射線對(duì)絲素蛋白降解性的影響,在0～200 kG的照射范圍內(nèi)絲素蛋白膜的降解性隨受照劑量的增大有所提高。Kojthung等[31]研究發(fā)現(xiàn),隨著γ射線輻射劑量的增加,絲素蛋白結(jié)構(gòu)中SILK Ⅱ結(jié)構(gòu)減少,酶降解速度隨之加快。γ射線能使細(xì)胞內(nèi)的DNA片段斷裂,導(dǎo)致細(xì)胞壞死、突變,不能直接用于人體,但該研究為絲素蛋白降解性的間接控制提供了一個(gè)新的思路。

磁場(chǎng)Aliramaji等[32]將磁性納米微粒(氧化鐵)通過反向共沉淀法與絲素蛋白/殼聚糖整合制成復(fù)合磁性支架材料,在絲素蛋白/殼聚糖支架材料中添加磁性微粒(<2 wt% )后,對(duì)外部的磁場(chǎng)有敏感的應(yīng)答且絲素蛋白/殼聚糖支架自身生物相容性及理化性質(zhì)并沒有顯著改變,但細(xì)胞的吸附、增殖等生物學(xué)行為提高,復(fù)合材料的降解速率降低。因此,通過施加外部磁場(chǎng),有望通過非侵入性的方法調(diào)節(jié)該復(fù)合材料的降解性,但磁性微粒對(duì)人體的毒性作用和不良反應(yīng)、如何調(diào)整復(fù)合材料中磁性微粒的比重以及外部磁場(chǎng)強(qiáng)度、頻率、持續(xù)時(shí)間等問題有待于進(jìn)一步研究。

結(jié)語絲素蛋白作為組織工程領(lǐng)域研究的熱門生物材料之一,其降解性受到多種因素的影響,這些影響因素也是調(diào)節(jié)控制絲素蛋白降解速率的重要手段。雖然目前對(duì)于絲素蛋白材料可控降解性的臨床研究報(bào)道較少,但上述研究都提供了新的方向和思路。