葛素俠，任 敏，查曉軍，吳曉東

干擾素-β(interferon-β,IFN-β)聯(lián)合維甲酸(retinoic acid,RA)是目前已知的能夠抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物，但目前乳腺癌細(xì)胞對(duì)于IFN-β/RA藥物的敏感性逐漸下降，抵抗性逐漸增強(qiáng)[1]。為解決這一問(wèn)題筆者選擇IFN-β/RA與其他藥物聯(lián)合治療。姜黃素是從植物姜黃根莖中提取出來(lái)的一種多酚類化合物,許多研究[2]已證實(shí)姜黃素具有抗腫瘤活性，并被用于許多惡性腫瘤包括乳腺癌的治療。但目前關(guān)于姜黃素和IFN-β/RA聯(lián)合用藥在乳腺癌細(xì)胞中的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，因此該研究旨在探討兩者聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人類乳腺癌細(xì)胞系(Michigan cancer foundation 7，MCF-7)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)；IFN-β購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；RA、姜黃素、MTT 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin V /propidium iodide， Annexin V/PI) 細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioVision 公司；胎牛血清購(gòu)自上海Excell公司；DMEM 培養(yǎng)基(高糖)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 將細(xì)胞以104個(gè)/孔分別接種到96孔板中，每孔體積200 μl，置于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后分別加入相應(yīng)藥物，分組如下：對(duì)照組(加培養(yǎng)基)、姜黃素組(40 μmol/L)、IFN-β/RA組(IFN-β 750 U/ml，RA 1.5 μmol/L)、姜黃素聯(lián)合IFN-β/RA組(姜黃素40 μmol/L，IFN-β 375 U/ml，RA 0.75 μmol/L)。繼續(xù)孵箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在0、12、24、36、48 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)10 μl，孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入100 μl DMSO，搖床震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3Annexin-V/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將收集的細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml)加入10 ml離心管中，加入100 μl Bingding Buffer和5 μl Annexin-V(20 μg/ml)，室溫避光30 min，再加入5 μl PI(50 μg/ml)，避光反應(yīng)5 min后，加入400 μl Bingding Buffer，立即用FC500流式細(xì)胞儀分析。數(shù)據(jù)用細(xì)胞流式分析軟件(FCS Express4)分析。分別以Annexin V為橫坐標(biāo)、PI為縱坐標(biāo)作圖。結(jié)果分為以下幾類：左上象限代表壞死細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞，左下象限代表正常細(xì)胞，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞。其中早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞的和代表細(xì)胞總凋亡的百分比。

2 結(jié)果

2.1姜黃素聯(lián)合IFN-β/RA顯著抑制MCF-7細(xì)胞活性MTT結(jié)果顯示，藥物作用48 h后，與對(duì)照組相比，姜黃素和IFN-β/RA單獨(dú)用藥時(shí)均能抑制細(xì)胞活性(F=9.33,P<0.05)；而與單藥組相比，姜黃素聯(lián)合IFN-β/RA組能顯著抑制細(xì)胞活性(F=6.81,P<0.05)。見圖1。

圖1 MTT法檢測(cè)姜黃素和IFN-β/RA單藥及聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞活性的影響與對(duì)照組比較：#P<0.05；與單藥組比較：*P<0.05

2.2姜黃素聯(lián)合IFN-β/RA能顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示單藥組的細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(F=191.83，P<0.05)；而聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率明顯高于單藥組(F=44.02，P<0.05)。見圖2。

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

A：Annexin V和PI染色結(jié)果；B：凋亡細(xì)胞百分比；

與對(duì)照組比較：#P<0.05；與單藥組比較：*P<0.05

3 討論

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，是女性癌癥死亡的第二大常見原因[3]。在過(guò)去20年中，全球乳腺癌絕對(duì)數(shù)量上升了1.4倍，世界上大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率上升了30%～40%[4]。在2015年，美國(guó)有231 840例被診斷為乳腺癌，其中40 290例患者死于乳腺癌，在我國(guó)，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，據(jù)國(guó)際癌癥研究所預(yù)計(jì)，在2030年我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病數(shù)可達(dá)到23.4萬(wàn)例，因乳腺癌死亡7.0萬(wàn)例[5]。除了手術(shù)和放療外，化學(xué)藥物仍是乳腺癌治療的重要手段。但目前單一的藥物總有這樣或那樣的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了藥物的療效，降低患者的生存質(zhì)量，因此尋求有效的聯(lián)合用藥以減少藥物的毒副作用至關(guān)重要。

IFN-β屬于I型干擾素，是一種由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有抗病毒、抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，目前已成功用于治療惡性腫瘤、病毒性感染和多發(fā)性硬化癥。IFN-β是第一個(gè)在臨床上用于惡性腫瘤治療的細(xì)胞因子，在目前的許多動(dòng)物模型和臨床研究[6]中，都顯示IFN-β能夠明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，如乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞。IFN-β的抗腫瘤機(jī)制主要有：增加腫瘤特異性抗原的表達(dá)量，提高自然殺傷細(xì)胞的殺傷水平；在淋巴瘤細(xì)胞系中下調(diào)c-Myc的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7]。盡管單藥IFN-β對(duì)白血病具有很好的治療效果，但對(duì)于一些實(shí)體腫瘤單藥IFN-β治療效果卻不十分理想。

RA是維生素A在體內(nèi)代謝的活性產(chǎn)物或衍生物，在胚胎發(fā)育、 器官形成、 細(xì)胞增殖和分化等許多基本生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。RA可與細(xì)胞核內(nèi)的相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而結(jié)合在靶基因的特定區(qū)域，調(diào)控目的基因表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[8]。RA是臨床上常用的誘導(dǎo)分化劑，是目前臨床上用于治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病的首選藥物。此外,RA也已成功用于乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤的臨床治療。

為了解決IFN-β在臨床上對(duì)多數(shù)實(shí)體腫瘤治療效果差這一問(wèn)題，研究者們提出了許多新的治療方法，在這些方法中，IFN-β與RA的聯(lián)合用藥取得了很好的效果，大大提高了單藥IFN-β對(duì)實(shí)體腫瘤的治療效果[9]。目前有許多研究[10]表明IFN-β與RA聯(lián)合用藥(IFN-β/RA)比單藥能更有效地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而且這種協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)在人類乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌裸鼠移植瘤中也得到了證實(shí)。但隨著乳腺癌發(fā)病率的提高以及年輕化，乳腺癌對(duì)于IFN-β/RA也逐漸出現(xiàn)了“耐藥現(xiàn)象”，抵抗性逐漸增強(qiáng)，敏感性逐漸下降，治療效果越來(lái)越不理想，因此積極尋求新的治療方案以提高乳腺癌患者的生存率及生存質(zhì)量就顯得十分迫切。

姜黃素是從天然植物姜黃中提取出來(lái)的一種色素，自古以來(lái)就被用作藥物。其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等廣譜的生物學(xué)作用，且來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，毒副作用小，對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)影響，因此具有十分廣泛的應(yīng)用前景[11]。近年來(lái)，由于惡性腫瘤如肺癌、胃癌、乳腺癌等疾病的發(fā)病率在逐年上升，嚴(yán)重威脅了人類的健康，因此姜黃素的抗腫瘤作用被越來(lái)越多的研究者們重視，相關(guān)研究[12-15]表明姜黃素對(duì)肺癌、胃癌、骨肉瘤、胰腺癌等許多惡性腫瘤都具有明顯的抗腫瘤作用。姜黃素的抗腫瘤機(jī)制較為復(fù)雜，在不同的腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，目前認(rèn)為姜黃素的抗腫瘤機(jī)制主要有：抑制某些癌基因表達(dá)，促進(jìn)抑癌基因表達(dá)；抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡；抑制腫瘤血管的生成等[13-14,16]。

本研究結(jié)果表明，相對(duì)于姜黃素和IFN-β/RA單一藥物治療，姜黃素和IFN-β/RA的聯(lián)合用藥能更明顯地抑制MCF-7細(xì)胞活性，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而且，在姜黃素與IFN-β/RA聯(lián)合用藥時(shí)，IFN-β/RA的藥物濃度比單獨(dú)用IFN-β/RA時(shí)藥量減少，從而減少IFN-β/RA高濃度時(shí)的毒副作用。綜上所述，姜黃素能協(xié)同性地增強(qiáng)IFN-β/RA對(duì)人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抗腫瘤作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這種協(xié)同效應(yīng)可以在提高IFN-β/RA藥物療效的情況下減少其藥物用量，增強(qiáng)藥物敏感性，降低抵抗性，從而控制單一藥物的副作用，達(dá)到更好的治療效果，為乳腺癌的臨床治療提供一種新的選擇。

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