曹朝霞 劉安國 李小娟 嚴興科

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，蘭州 730000)(2. 達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，達州 635000)

弱視(amblyopia)是指眼部無器質(zhì)性病變，在視覺發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)由雙眼相互作用或視覺剝奪異常所引起的單側(cè)或雙側(cè)視力減退，且矯正后視力仍小于0.9的眼科疾病[1-2]。在我國，兒童弱視的發(fā)病率已達1.2%[3]。自Hubel和Wiesel[4]成功制作弱視模型貓后，越來越多的學者開始致力于弱視的實驗研究，目前弱視動物的造模方法主要有：眼瞼縫合法、眼內(nèi)外直肌切斷法、黑暗環(huán)境飼養(yǎng)法、視網(wǎng)膜摘除法。本文通過分析現(xiàn)有弱視動物模型的優(yōu)、缺點，為研究者們對弱視動物模型的選擇提供參考。

1 實驗動物的選擇

人類和哺乳動物在出生時視覺系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，出生后在一定時期內(nèi)視覺系統(tǒng)還有相當大的可塑性，能夠根據(jù)環(huán)境刺激來調(diào)整和改變與生具有的神經(jīng)聯(lián)系和突觸結(jié)構(gòu)，這一時期稱為視覺可塑性關(guān)鍵期[5]，在視覺可塑性關(guān)鍵期對實驗動物進行干預(yù)，能成功模擬人類弱視的發(fā)病過程，常用于弱視模型制備的動物有大鼠、豚鼠[6]、樹鼩、貓、猴、鴿、雪貂[7]等。以上動物作為制作弱視模型的對象，各有其優(yōu)缺點，研究者們可以根據(jù)實驗的要求以及條件來選擇適合的動物來建立模型。

1.1 哺乳類嚙齒目弱視模型

用于制作弱視模型的嚙齒目動物有大鼠、豚鼠等，因其價格較低、容易獲得、容易飼養(yǎng)且造模周期短等特點，目前已被廣泛用于弱視模型的建立[8-9]，所選大鼠有出生后14 d健康SD大鼠、健康SPF級Long-Evans大鼠，所查文獻中，14 d健康SD大鼠應(yīng)用較多。大鼠視覺發(fā)育的關(guān)鍵期約在出生后14 d，在這段關(guān)鍵期內(nèi)進行單側(cè)眼瞼縫合，可以阻斷視覺信息的進入，形成弱視[10]。

1.2 哺乳類食肉目弱視模型

近年來，貓作為一種哺乳類食肉目動物，已被廣泛用于弱視模型的制作[11]，貓的視覺系統(tǒng)和人較相近，所選貓主要以2～3周健康清潔級新生貓為主，研究發(fā)現(xiàn)，貓視覺發(fā)育的敏感期在出生后4～16周[12]，在這期間進行單眼縫合或者切除外直肌，可以建立弱視模型。但貓的視網(wǎng)膜以視桿細胞為主，而人類的視網(wǎng)膜以由不同比例的視桿細胞和視椎細胞組成。因此，弱視模型貓的建立是否能正確模擬人類弱視的發(fā)病，還有待進一步研究。

1.3 哺乳類攀鼩目弱視模型

近年來，有學者[13]對樹鼩進行了全基因組的測序，發(fā)現(xiàn)樹鼩在神經(jīng)及免疫系統(tǒng)與人類有較高的同源性，而樹鼩在生物學分類上屬于攀鼩目[14]，是介于嚙齒類跟靈長類之間的一個物種，是靈長類的近親，其研究結(jié)果用于人類的可信度較大，且實驗成本不高，容易獲取，因此，樹鼩可以作為研究人類視覺系統(tǒng)的良好動物模型。樹鼩視覺發(fā)育的關(guān)鍵期約在出生后30 d左右[15]，此期對其進行弱視造模，容易成功。周廣龍[16]對出生30 d的樹鼩進行單側(cè)眼瞼縫合，在正常環(huán)境下飼養(yǎng)1月后進行檢測，成功制作了弱視模型。

1.4 哺乳類靈長目弱視模型

哺乳類靈長目動物屬于動物界高等的類群，越是高等動物其解剖生理結(jié)構(gòu)越與人類相似，所造的弱視模型越能模擬人類弱視的發(fā)病特點。猴視覺發(fā)育敏感期約為出生后6周，Sparks等[17]對出生后1～2周的恒河猴進行單側(cè)眼瞼縫合，成功制作了短期視覺剝奪弱視模型。丁娟等[18]在對出生后1周的棉耳絨猴采用單側(cè)眼瞼縫合法，成功制作弱視模型。但靈長類動物因價格較貴而很難被推廣使用。

1.5 其他弱視模型

其他用于建立弱視模型的動物包括鴿、雪貂等，這些動物因其解剖結(jié)構(gòu)與人類有一定的差距，而較少被用于弱視模型的制作。

2 弱視動物模型的制作方法

目前弱視動物模型的制作方法主要有眼瞼縫合法、眼直肌切斷法、黑暗環(huán)境飼養(yǎng)法、視網(wǎng)膜摘除法，每種方法各有其優(yōu)、缺點，所選動物也因造模方法不同而有所差異，研究者們可以根據(jù)實驗的要求來選擇適合的方法建立弱視模型。

2.1 單側(cè)眼瞼縫合法

弱視發(fā)病原因之一是指在視覺發(fā)育過程中，由于上眼瞼下垂、角膜混濁、先天性白內(nèi)障等原因，無法使視覺獲得充分光刺激的眼科疾病，而眼瞼縫合很好地模擬了此類弱視的發(fā)病過程，是研究發(fā)育期視覺剝奪效應(yīng)的一種有價值的實驗方法，近年來，通過單側(cè)眼瞼縫合來建立視覺剝奪弱視模型，已成為公認的建立弱視的經(jīng)典模型[19-20]。張軻等[21]選用出生后2周內(nèi)的SD大鼠16只，10%水合氯醛麻醉后，自內(nèi)眥到外眥剪除上下瞼緣1.0～1.5 mm，間斷縫合封閉術(shù)眼，在自然光線下飼養(yǎng)4周后，用P-VEP記錄其結(jié)果，單眼縫合組較正常未縫合組的P波潛時延長、波幅降低。該方法的病理過程與在視覺發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)由視覺剝奪異常所引起的單側(cè)或雙側(cè)視力減退發(fā)病情況相似。Headon等[22]通過對29只恒河猴出生后的不同時期進行單眼瞼縫合術(shù)，發(fā)現(xiàn)外側(cè)膝狀體神經(jīng)元細胞的大小因縫合時期的不同而不同，結(jié)果表明，不同時期縫合會導致不一樣結(jié)果，因此，應(yīng)根據(jù)實驗的目的來選擇合適的縫合時期。

2.2 眼直肌切斷術(shù)

斜視性弱視是指患者雙眼不能同時對同一物體協(xié)同聚焦，從而產(chǎn)生視覺混淆，腦皮層主動抑制由斜視眼黃斑輸入的視覺沖動，該眼黃斑部功能長期被抑制就形成了弱視。眼內(nèi)、外直肌切斷術(shù)很好地模擬了這種發(fā)病過程，于湛等[23]將普通4周齡家貓18只，隨機分為正常對照組、斜視組和斜視治療組，每組6只，實驗組在4周齡時行右眼外直肌切斷術(shù)，術(shù)后4周經(jīng)P-VEP檢測，發(fā)現(xiàn)正常組在不同年齡段的P1波幅隨年齡增長而增高，而實驗組P1波幅較正常組明顯降低，從而確定弱視造模成功。Adama等[24]通過對獼猴實行眼內(nèi)直肌切斷術(shù)，成功制造斜視性弱視模型。

2.3 黑暗環(huán)境飼養(yǎng)法

目前研究中常用的視覺剝奪模型就是黑暗飼養(yǎng)模型，因其對光覺剝奪的徹底性及模型穩(wěn)定性而經(jīng)常被使用，He等[25]將出生后70 d的大鼠放在黑暗環(huán)境下飼養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)長時間黑暗飼養(yǎng)的正常成年大鼠在短期單眼剝奪后能導致眼優(yōu)勢柱移動。但在正常生理狀態(tài)下，光覺剝奪是一個很難實現(xiàn)和很難遇到的情況，因而期望用黑暗飼養(yǎng)模型所得出的實驗結(jié)論廣泛應(yīng)用于臨床有一定的局限性[26]，與黑暗條件下飼養(yǎng)的模型相比，眼瞼縫合后的視覺剝奪是一種更接近臨床現(xiàn)實，更容易實現(xiàn)的模型[27]。

2.4 視網(wǎng)膜摘除法

從視網(wǎng)膜到初級視覺中樞為完全交叉至對策投射，即為完全視交叉，摘除一側(cè)視網(wǎng)膜，則阻斷了一側(cè)光線的傳導，呂立夏等[28]取美洲純種大白鴿5只，孵出后第1天在嚴格無菌條件下完整摘除左側(cè)視網(wǎng)膜，由母鴿哺至10 d，建立單眼視網(wǎng)膜剝奪模型。弱視的病理基礎(chǔ)到底是中樞神經(jīng)還是視網(wǎng)膜目前尚無定論，因而此法在弱視模型的建立中應(yīng)用較少。

3 模型動物的評價指標

目前沒有明確的標準來判斷動物模型是否已經(jīng)達到弱視的診斷標準，Wiesel[29]認為可以通過測定細胞外側(cè)膝狀體大小來評價單眼視覺剝奪效果，也有人認為c-fos基因及蛋白的表達與否取決于弱視是否形成，因而c-fos基因及蛋白可作為弱視的一個可靠的檢驗指標[30]，但目前應(yīng)用較多的評價弱視模型的方法主要是用圖形視覺誘發(fā)電位(pattern visual evoked potential， P-VEP)法測定。

Halfeld等[31]發(fā)現(xiàn)P-VEP在弱視復(fù)雜的機制中具有重要作用，P-VEP是一種在生物活體上進行的、客觀的、定量的檢測方法，其原理是大腦皮層對模式刺激發(fā)生的一簇電信號，可提供關(guān)于視覺系統(tǒng)功能正常與否的重要診斷信息。近年來有學者將P-VEP 用于人雙眼視功能的研究，并且得到廣泛認同。Burns和Pritchard[32]用電生理學的方法研究人和貓的雙眼視功能，發(fā)現(xiàn)二者的雙眼視覺機制相同。李林林等[33]用P-VEP 評價貓的雙眼視覺，通過在貓視覺發(fā)育的關(guān)鍵期內(nèi)對雙眼視覺進行干擾，用P-VEP 記錄貓單眼和雙眼P 波潛時和振幅的變化，評價干擾因素對貓視功能產(chǎn)生的影響，為雙眼視覺模型制作和雙眼視覺的客觀診斷上提供了可能的實驗手段。

4 討論

目前的一些弱視模型并不能很好地模擬人類弱視的發(fā)病情況。比如外傷性白內(nèi)障的發(fā)病容易在動物身上復(fù)制，而一些先天性白內(nèi)障的發(fā)病和發(fā)展卻很難被復(fù)制，視覺剝奪主要與空間視覺或形式有關(guān)，而不僅是光本身，因為光也能通過混濁的晶狀體到達視網(wǎng)膜。貓和猴天生缺乏眼瞼板，同樣情況下，比人類的眼瞼傳播的光線更多，Crawford和Marc[34]用光譜測量儀發(fā)現(xiàn)貓和猴在眨眼瞬間進入瞬膜的光較進入眼瞼的光多。但出生后就進行眼瞼縫合的貓，在眼瞼打開后，視力很快會趨于正常，縫合眼瞼的貓仍能進行橫向可見光的辨別[35]，縫合后的貓和雪貂仍能通過初級視皮層細胞感受特定的方向[36]。成年大鼠可以通過閉合的眼見來辨別光的濃密度，但不能辨認出最基本的圖形，表明一些光線可以通過動物的眼瞼進行傳播，就像先天性白內(nèi)障，單一的眼瞼縫合可以產(chǎn)生視覺剝奪，卻不能阻擋一些光與視網(wǎng)膜接觸。有研究發(fā)現(xiàn)[18]，異常的視覺刺激首先導致視錐細胞數(shù)量、比例、形態(tài)及視蛋白表達的變化，通過一系列機制進一步引發(fā)了視網(wǎng)膜功能的變化，視網(wǎng)膜再將此信號傳遞至大腦皮質(zhì)，引起皮質(zhì)的改變，最終導致弱視的發(fā)生。有的動物視網(wǎng)膜以視桿細胞為主，如：貓、豚鼠等，有的動物視網(wǎng)膜以視錐細胞為主，如鴿、樹鼩等，有的動物視網(wǎng)膜由不同比例的視錐和視桿細胞組成，如人類、猴等。

總的來說，目前關(guān)于弱視動物模型的研究較少，且采用傳統(tǒng)常規(guī)的實驗動物(實驗嚙齒類和非人靈長類等) 研究人類眼科疾病仍遇到了很多困難。動物模型的作用在于模擬臨床病癥特點，最大程度地符合疾病的演變過程[37]，今后可以通過做進一步研究，制造出一種更加接近人類弱視發(fā)病的動物模型，為弱視模型的制作提供更可靠的依據(jù)。