吳葉嬌，張金坤，周春曉，陳衛(wèi)昌 綜述，余 強(qiáng)Δ 審校

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院消化內(nèi)科 215002；2.蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇蘇州 215006)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)起源于構(gòu)成肝臟實(shí)質(zhì)的肝細(xì)胞，是原發(fā)性肝癌的最常見組織學(xué)類型，約占原發(fā)性肝癌的85%～90%。HCC是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，分別居男性惡性腫瘤的第5位和女性惡性腫瘤的第7位[1]。HCC的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)的分布并不均勻，絕大多數(shù)出現(xiàn)(大于80%)在撒哈拉以南的非洲和東亞地區(qū)；中國的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率男性達(dá)37.4/10萬，女性13.7/10萬[2]，僅中國的病例數(shù)就在全球所有HCC患者中占大約50%[3]。然而在北美洲、南美洲及歐洲，HCC的發(fā)病率相對較低。這種顯著的差異是由多種因素造成的。HCC涉及多重遺傳和環(huán)境因素的共同作用[4]。HCC患者預(yù)后差，平均3年生存率僅為13%～21%[5]。如此高的全球疾病負(fù)擔(dān)使得識別HCC高危個體和可控的危險因子顯得尤為重要。已知數(shù)個增加HCC風(fēng)險的環(huán)境因素，如乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的感染、接觸黃曲霉毒素和大量飲酒、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病和血色病[3,6-7]。然而，人群中僅一小部分暴露于這些危險因素的個體最終罹患HCC，這充分突顯出遺傳易感性是另一個影響HCC發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

目前，血清甲胎蛋白水平測定和肝臟的影像學(xué)檢查是高危人群篩查的主要手段。然而，這兩種技術(shù)的靈敏度較低，使得它們的有效性受到限制。此外，它們并非旨在識別高危個體，而是已經(jīng)罹患HCC的患者。未來的醫(yī)學(xué)實(shí)踐將緊緊圍繞4P概念，即預(yù)測性(predictive)、個體化(personalized)、搶占性(preemptive)和實(shí)踐性(participatory)[8]。其實(shí)，在此框架內(nèi)，目前尚不存在與之相符的HCC遺傳標(biāo)記。因此，與HCC風(fēng)險增高相關(guān)的分子標(biāo)記將會成為識別高危個體策略中的一種非常有價值的上游工具，自然也會在預(yù)防性干預(yù)中扮演特殊的角色。

隨著基因組學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，整個人類基因組序列完成，二代測序技術(shù)出現(xiàn)，基因檢測成本相對降低，以及新分析工具應(yīng)用，讓HCC研究領(lǐng)域出現(xiàn)重大的革新性改變。這些進(jìn)展使得對基因組中成千上萬的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)進(jìn)行快速基因型分型成為可能，這就直接促成了全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS)的出現(xiàn)和發(fā)展。隨之，許多與HCC有關(guān)聯(lián)的遺傳易感性位點(diǎn)通過GWAS被發(fā)現(xiàn)，為HCC的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的重要線索。本文系統(tǒng)介紹GWAS應(yīng)用于HCC發(fā)病機(jī)制研究的最新進(jìn)展。

1 全基因組關(guān)聯(lián)研究

候選基因策略曾經(jīng)最為廣泛地應(yīng)用于研究復(fù)雜性疾病發(fā)生、發(fā)展和治療效果的遺傳因素。這種方法是有假設(shè)前提的，并因依賴于對候選基因在生理、生物化學(xué)或功能等方面的先驗(yàn)知識。因此候選基因策略受到極大的限制。這種局限性導(dǎo)致信息瓶頸而往往引起已報(bào)道實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏一致性。但GWAS的出現(xiàn)徹底打破了這一局限。

GWAS是一種利用人類全基因組高通量測序和分型的技術(shù)，對研究對象的整個基因組中的SNPs進(jìn)行分型。通常，其研究對象有超過數(shù)十萬個SNPs，傳統(tǒng)技術(shù)難以快速測序，但GWAS可以做到。同時，GWAS利用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)的方法，檢驗(yàn)SNPs與復(fù)雜疾病或特定遺傳性狀的關(guān)聯(lián)性，由此全面地揭示與疾病發(fā)生、發(fā)展及治療相關(guān)的遺傳位點(diǎn)。GWAS的理論來源于人類常見的復(fù)雜性疾病，主要是以常見的等位基因遺傳變異為遺傳基礎(chǔ)[9]。通常，GWAS是利用覆蓋人類基因組的高密度SNPs來尋找目標(biāo)人群(有復(fù)雜性疾病或特定遺傳性狀者)和對照人群之間等位基因頻率的差異。如果差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，就提示在其基因組相應(yīng)區(qū)域可能存在具有潛在功能并且與所研究的復(fù)雜性疾病或特定遺傳性狀有關(guān)聯(lián)的DNA序列變異。隨后在新的標(biāo)本中將繼續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證這種有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義關(guān)聯(lián)是否仍然存在[10]。

GWAS一般有如下4個步驟[11]：(1)研究設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備階段。包括查閱相關(guān)文獻(xiàn)、提出科研假說、進(jìn)行科學(xué)研究設(shè)計(jì)、招募合格的研究對象和對照個體、問卷調(diào)查和采集生物學(xué)標(biāo)本。(2)實(shí)驗(yàn)室基因分型階段。包括制備DNA、準(zhǔn)備芯片及基因分型和實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制等。(3)數(shù)據(jù)分析階段。包括調(diào)查資料的整理匯總、基因分型資料整理匯總[如缺失值的控制、最小等位基因頻率的控制、Hardy-Weinberg連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)的檢驗(yàn)、親屬關(guān)系的鑒別等][12]、人群分層分析(鑒別種族和調(diào)整人群的混雜效應(yīng))、各遺傳位點(diǎn)與復(fù)雜性疾病或特定遺傳性狀的效應(yīng)分析，進(jìn)而分析每個基因、每條通路與復(fù)雜性疾病或特定遺傳性狀的關(guān)聯(lián)，以及基因-環(huán)境和基因-基因的交互作用。(4)重復(fù)驗(yàn)證階段。對新發(fā)現(xiàn)的易感位點(diǎn)或基因，在同類人群和(或)其他種族人群中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，評價該研究結(jié)果的可重復(fù)性，以減少假發(fā)現(xiàn)率的產(chǎn)生[13]。

表1 GWAS報(bào)道的HCC相關(guān)遺傳易感位點(diǎn)

1996年GWAS由RISCH等[14]提出，總結(jié)了GWAS所需的技術(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，并指出當(dāng)時GWAS的主要缺乏技術(shù)支持而非統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法。1990年人類基因組計(jì)劃啟動，旨在完成人類基因組測序圖。第一階段的成果公布于2001年。同年，另一個標(biāo)志性項(xiàng)目啟動，即國際人類基因組單體型圖計(jì)劃。該研究記錄了人類基因組中大量共同的SNPs并確定了LD的模式和這些變異等位基因之間的關(guān)聯(lián)性。該研究為商業(yè)性基因型分型芯片奠定了選擇遺傳標(biāo)志物的基礎(chǔ)并使日后的GWAS工作進(jìn)展順利。2005年Science雜志發(fā)表了有關(guān)GWAS的文章[15]。自此，與GWAS相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)表量逐年增加，幾乎覆蓋了所有復(fù)雜性疾病和特定遺傳性狀的表型，報(bào)道了許多與復(fù)雜性疾病和特定遺傳性狀有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)的SNPs，并在不同種族的或更大的人群中得到驗(yàn)證。由此可見，GWAS已經(jīng)成為目前人類復(fù)雜性遺傳性狀和疾病的遺傳易感性的主要研究策略。

2 GWAS與HCC

目前，GWAS所發(fā)現(xiàn)的與HCC可能相關(guān)的遺傳易感位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到20個，見表1。其中，針對部分遺傳易感位點(diǎn)已經(jīng)開展了相關(guān)生物學(xué)功能研究，結(jié)果提示部分遺傳易感位點(diǎn)在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要的作用。本文針對數(shù)個遺傳易感位點(diǎn)的GWAS結(jié)果和致病機(jī)制進(jìn)行綜述。

2.1KIF1B 2010年ZHANG等[16]在華裔人群中采用Affymetrix的人類全基因組SNP芯片對355例HCC合并慢性HBV攜帶的患者和360例慢性HBV攜帶但無HCC的對照患者進(jìn)行初篩。在440 794個標(biāo)記SNPs中發(fā)現(xiàn)，在染色體1p36.22上KIF1B基因內(nèi)的rs17401966變異與乙型肝炎后HCC顯著相關(guān)。隨后在5個獨(dú)立人群中分別進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證。這5次驗(yàn)證的研究對象總?cè)藬?shù)達(dá)1 962例HCC合并慢性HBV攜帶的患者、1 430例慢性HBV攜帶但無HCC對照患者以及159個家系，均為華裔。經(jīng)上述6次研究證實(shí)該位點(diǎn)與乙肝后HCC的發(fā)病有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(6次研究合并P=1.7×10-18，OR=0.61，95%CI：0.55～0.67)。然而，之后的研究并未得出相同的結(jié)論。AL-QAHTANI等[17]報(bào)道，在KIF1B基因內(nèi)的rs17401966變異和乙肝后HCC之間無顯著的相關(guān)性。SAWAI等[18]在日本人的一項(xiàng)隊(duì)列研究中也并未發(fā)現(xiàn)該兩者的相關(guān)性。這些大相徑庭的結(jié)果可能部分因?yàn)椴煌芯咳巳旱倪z傳構(gòu)架差異。另一個可能的原因是忽略了在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中存在復(fù)雜的基因-環(huán)境交互作用。近期CHEN等[19]在中國人群的一項(xiàng)研究表明KIF1B基因內(nèi)的rs17401966變異與飲酒之間存在基因-環(huán)境交互作用并在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

1p36的雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)是多種腫瘤中的常見遺傳缺陷，包括HCC[20-22]。1p36.21-36.22內(nèi)的LOH可能是肝臟癌變的初始事件之一，這意味著該區(qū)域可能存在HCC的抑癌基因[22]。rs17401966處在一個224 kb的LD模塊內(nèi)，該模塊含UBE4B的3′端，KIF1Bα和PGDβ。KIF1B是一個驅(qū)動蛋白超家族成員，編碼兩個選擇性剪接的亞型，KIF1Bα和KIF1Bβ；這兩個亞型形成同源二聚體，運(yùn)輸線粒體和突觸囊泡前體。KIFs的下調(diào)對某些腦部、結(jié)腸、乳腺的腫瘤具有致癌作用[23]。兩個獨(dú)立的研究均證實(shí)KIF1B可能是成細(xì)胞纖維瘤的一個潛在抑癌基因，作用于EglN3脯氨酸羥化酶的下游誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23-24]，最終導(dǎo)致惡變和進(jìn)展得到抑制。所以KIF1B很可能是一個抑癌基因。

2.2DEPDC5 2011年MIKI等[25]在日本人中采用Illumina HumanHap芯片對212例慢性HCV合并HCC感染的患者和765例慢性HCV感染但無HCC的對照患者進(jìn)行初篩。在467 538個SNPs中，發(fā)現(xiàn)在染色體22q12.2-3上DEPDC5基因內(nèi)的rs1012068與丙型肝炎后HCC顯著相關(guān)。隨后在710例慢性HCV合并HCC感染的患者和1 625例慢性HCV感染但無HCC的對照患者中進(jìn)行獨(dú)立的重復(fù)驗(yàn)證，經(jīng)調(diào)整性別、年齡和血小板計(jì)數(shù)后證實(shí)，該位點(diǎn)與丙肝后HCC的發(fā)病有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(合并P=1.35×10-14，OR=1.96，95%CI：1.65～2.32)。雖然曾有報(bào)道稱DEPDC1影響膀胱癌的發(fā)生[26]，該基因含有與DEPDC5類似的DEP結(jié)構(gòu)域，但是DEPDC5的功能目前仍然未知。

近期BURZA等[27]在歐洲裔人群中進(jìn)行的病例對照研究并未發(fā)現(xiàn)DEPDC5基因內(nèi)的rs1012068變異與HCC的相關(guān)性。但研究者注意到該變異與中至重度纖維化相關(guān)。肝硬化，是纖維化最嚴(yán)重的等級，也是HCC的主要危險因素[28]。在MIKI等[25]的研究中，大部分HCC患者很有可能同時存在肝硬化。然而對照組的患者并非丙型肝炎后肝硬化而無HCC的患者。所以，MIKI等[25]找到的關(guān)聯(lián)性可能實(shí)際上是DEPDC5基因內(nèi)的rs1012068與嚴(yán)重肝纖維化相關(guān)而非HCC。為進(jìn)一步明確分子機(jī)制，BURZA等[27]對肝星狀細(xì)胞(LX-2)進(jìn)行了體外研究，結(jié)果表明DEPDC5基因的下調(diào)導(dǎo)致catenin表達(dá)及其下游目標(biāo)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP2)的產(chǎn)生量有所增加。而MMP2是一個與肝臟纖維化密切相關(guān)的酶。

2.3MICA 2011年KUMAR等[29]在日本裔中采用Illumina HumanHap芯片對721例HCV所致HCC的患者和2 890例無慢性HCV感染的對照者進(jìn)行初篩。隨后在673例HCV所致HCC的患者和2 596例無慢性HCV感染的對照者中進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。在432 703個常染色體SNPs中，染色體6p21.33上的MICA基因內(nèi)的rs2496542與丙肝后HCC的發(fā)病顯著相關(guān)(合并P=4.21×10-13，OR=1.39，95%CI：1.27～1.52)。

MICA基因編碼一個膜結(jié)合蛋白，是自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞表面的自然殺傷細(xì)胞組2D(natural killer cell group 2D,NKG2D)的配體。這些NK細(xì)胞通過分泌穿孔蛋白和顆粒酶及死亡受體信號發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，也釋放炎癥細(xì)胞因子以起到抗病毒和對感染和腫瘤免疫應(yīng)答的效果[30]。因此MICA/NKG2D系統(tǒng)是免疫監(jiān)視的有效機(jī)制。病毒通過破壞MICA的產(chǎn)生以拮抗MICA-NKG2D系統(tǒng)的抗腫瘤作用。而rs2596542正處于MICA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游。腫瘤細(xì)胞也逐漸形成了通過脫落酶使MICA從細(xì)胞表面脫落，拮抗MICA/NKG2D激活的信號[31]，從而盡可能減少或躲避NKG2D介導(dǎo)的應(yīng)答機(jī)制。血清sMICA的水平在HCC晚期的患者中升高，且與NKG2D表達(dá)的下調(diào)和NK細(xì)胞活性下降相關(guān)[32]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明NK細(xì)胞的功能障礙在逃脫腫瘤監(jiān)視系統(tǒng)中扮演重要角色[33]。

2.4HLA-DQA1/DRB1與GRIK1 2012年LI等[34]在華裔中對1 538例HCC合并慢性HBV攜帶的患者和1 465例慢性HBV攜帶但無HCC的對照患者進(jìn)行初篩。隨后在總?cè)藬?shù)為3 133例HCC合并慢性HBV攜帶的患者和3 699例慢性HBV攜帶但無HCC的對照患者中進(jìn)行兩次獨(dú)立的重復(fù)驗(yàn)證。結(jié)果在523 663個常染色體SNPs中，發(fā)現(xiàn)染色體6p21.32上的HLA-DQA1/DRB1基因(功能性研究在其后的HLA-DQ基因中共同進(jìn)行闡述)內(nèi)的rs9272105變異和染色體21q21.3上的GRIK1基因內(nèi)的rs455804變異與乙肝后HCC的發(fā)病顯著相關(guān)(合并P=5.24×10-22，OR=1.28，95%CI：1.22～1.35；P=5.24×10-10，OR=0.84，95%CI：0.80～0.89)。

GRIK1編碼GLUR5，是一種促離子型谷氨酸受體，作為配體激活通道的亞基參與谷氨酸信號。谷氨酸通過多種分子機(jī)制在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性表型中起關(guān)鍵作用[35]。抑制谷氨酸的釋放和(或)谷氨酸受體活性可以有效減少乳腺癌、喉癌和胰腺癌的腫瘤細(xì)胞增殖和(或)侵襲[36-38]。LI等[34]研究更進(jìn)一步驗(yàn)證了谷氨酸信號通路在癌癥發(fā)生和發(fā)展中的重要作用，同時對乙型肝炎后HCC的機(jī)制研究具有指導(dǎo)意義。

2.5STAT4與HLA-DQ 2013年JIANG等[39]采用Illumina芯片在中國人群中對1 161例HCC合并慢性HBV攜帶的患者和1 353例慢性HBV攜帶但無HCC的對照患者進(jìn)行初篩。隨后在總?cè)藬?shù)為4 319例HCC合并慢性HBV攜帶的患者和4 966例慢性HBV攜帶但無HCC的對照患者中進(jìn)行兩個階段的重復(fù)驗(yàn)證。研究結(jié)果顯示，在568 280個常染色體SNPs中，染色體2上STATA基因內(nèi)的rs7574865變異和染色體6上的HLA-DQ基因內(nèi)的rs9275319變異與乙型肝炎后HCC的發(fā)病顯著相關(guān)(合并P=2.48×10-10，OR=1.21，95%CI：1.14～1.28；P=2.72×10-17，OR=1.49，95%CI：1.36～1.63)。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription,STAT)可調(diào)節(jié)造血過程并通過抑制或誘導(dǎo)生長因子和特定的細(xì)胞因子影響腫瘤細(xì)胞與其免疫微環(huán)境的相互作用[40-41]。其中，STAT4基因在免疫反應(yīng)的過程中扮演重要的角色。由抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells,APCs)或具有類似APCs功能的細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-12激活STAT4；活化的STAT4能促進(jìn)像NK細(xì)胞等的炎癥細(xì)胞分泌干擾素(interferon,IFN)-γ[42]。IFN-γ是干細(xì)胞凋亡、肝臟再生、病毒控制和抑制腫瘤的關(guān)鍵細(xì)胞因子。STAT4表達(dá)的不平衡能夠通過炎性反應(yīng)、T細(xì)胞分化的調(diào)控和IFN-γ導(dǎo)致自身免疫性疾病或腫瘤[43]。這些都表明STAT4可能參與HCC發(fā)生和發(fā)展的病理過程。

HLA系統(tǒng)是編碼人類主要組織相容性復(fù)合體的基因座的名稱。這個超級基因座包含大量與人類免疫系統(tǒng)功能相關(guān)的基因。HLA Ⅱ類分子包括3個同種型：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了它們與HCC之間的相關(guān)性，而LI等[34]和JIANG等[39]有關(guān)GWASs的研究從另一個角度再次證實(shí)了這一點(diǎn)。rs9272105位于HLA-DQA1和HLA-DRB1之間，而rs9275319位于HLA-DAB1和HLA-DQA2之間。HLA-DQ和-DR編碼的蛋白質(zhì)組成HLAⅡ類復(fù)合物，這是一種表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞表面的α-β異質(zhì)二聚體膜糖蛋白，例如B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。HLAⅡ類糖蛋白為CD4+T細(xì)胞呈遞病毒多肽從而影響免疫反應(yīng)。因此HLA-DQ和-DR基因的SNPs在免疫介導(dǎo)的疾病中具有重要的地位，包括肝病和HCC。而WEN等[44]的近期研究發(fā)現(xiàn)rs9272105與HBV的基因型和變異存在顯著的相關(guān)作用，并進(jìn)一步揭示HLA-DQ/DR基因的多態(tài)性可能通過調(diào)節(jié)HBV變異的免疫選擇而影響慢性HBV感染的結(jié)局，從而增加了因HBV變異導(dǎo)致HCC的風(fēng)險。

3 GWAS的總結(jié)和展望

在GWAS中發(fā)現(xiàn)了大量HCC的易感位點(diǎn)，為深入研究其生物學(xué)發(fā)病機(jī)制起了指導(dǎo)性作用。與先前的研究方法相比，GWAS的最大優(yōu)勢是在研究前不需要提出致病位點(diǎn)所在基因組的生物學(xué)假設(shè)，而是從基因組的所有SNPs中進(jìn)行篩選。采用高通量技術(shù)，輔以大樣本量和重復(fù)驗(yàn)證，極大地提高了GWAS從海量基因組信息中篩選出與HCC相關(guān)遺傳變異的效能。后續(xù)的生物學(xué)通路分析部分證實(shí)了GWAS所發(fā)現(xiàn)的基因的潛在作用。

但GWAS并非完美無瑕。首先，GWAS只能揭示與疾病相關(guān)的基因而不能直接驗(yàn)證這些基因?qū)е录膊?，因?yàn)榕c疾病的相關(guān)的基因與導(dǎo)致疾病的基因可能存在LD[45]。因此，需要功能性分析來驗(yàn)證GWAS所發(fā)現(xiàn)的HCC候選基因。其次，篩選出的位點(diǎn)僅能解釋表型遺傳的一小部分[46]。所以發(fā)現(xiàn)罕見變異仍然是一個問題，亟待解決[47]。另外，GWAS關(guān)注的是疾病的易感性，但并不能夠反映疾病的其他方面，例如進(jìn)展、嚴(yán)重程度或預(yù)后[48-49]。因此，有研究者在經(jīng)典的GWAS基礎(chǔ)上提出了彌補(bǔ)的策略和方法。隨著新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，GWAS將不斷吸收和利用新的技術(shù)，并將其應(yīng)用到將來的研究中。

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