周 山，封建立，高 瑾，顏加強(qiáng)，舒 勇，劉元豐，孫道冬

(中國(guó)人民解放軍第三二四醫(yī)院腎病泌尿科，重慶 400000)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種在體內(nèi)誘導(dǎo)血管生成的細(xì)胞因子，當(dāng)其在組織局部應(yīng)用，能夠增加缺血部位的微血管生成，因此在缺血性疾病(如冠狀動(dòng)脈缺血)、組織工程支架等中有廣泛應(yīng)用[1]。但VEGF半衰期短，體內(nèi)降解速度快，使其臨床應(yīng)用受到限制[2]。目前廣泛采用的解決方案是使用載藥緩釋微球，使VEGF在組織局部以恒定的釋藥速率釋放，保證組織修復(fù)過(guò)程中始終保持一定的VEGF水平，從而促進(jìn)新生微血管的形成。制備的載藥微球尺寸由數(shù)十納米至數(shù)百微米不等，其中0.5～1.0 μm稱為亞微米微球，0.5 μm以下稱為納米微球。體積越小，在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acelluar dermal martrix，ADM)中緩釋時(shí)藥物分布更均勻，但同等材料下緩釋時(shí)間會(huì)縮短，并且制備難度更大[3]。目前國(guó)內(nèi)少有亞微米聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)微球的制備與性質(zhì)研究，本文提供一種PLGA載藥亞微球制作方法，并在其中負(fù)載熒光物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)微球追蹤并研究其體外特性。

1 材料與方法

1.1材料 PLGA(丙交酯∶乙交酯=50∶50；分子量40.6×103,Evonik,德國(guó))，異硫氰酸熒光素4(LWABX021-139911,寶曼生物，中國(guó))，重組人 VEGF 165蛋白(600310，Abbiotec，美國(guó))，VEGF-ELISA試劑盒(ab100663，Abcam，英國(guó))，二氯甲烷(Adamas-01226780，Adamas，中國(guó))，聚乙烯醇(PVA，0520224325，MP，美國(guó))，T25均質(zhì)器(IKA-Laboratechnik，德國(guó))，LS13 320激光粒度分析儀(Beckman Coulter，美國(guó))，真空冷凍干燥儀(LDGZJ28，北京松源華興，中國(guó))，掃描電子顯微鏡(HT7700，日立，日本)，激光共聚焦顯微鏡(LSM510，Carl Zeiss，德國(guó))。

1.2方法

1.2.1PLGA熒光載VEGF微球制備 采用復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法(W/O/W)制備PLGA亞微米微球[4]。0.4 g PLGA溶于10 mL二氯甲烷作為油相(O)，0.2 mg VEGF加2 μg綠色熒光素溶于2 mL去離子水中作為內(nèi)水相(W1)，外水相(W2)為50 mL的PVA(8%，w/v)。將W1 倒入O中，在15 000 r/min速率下均質(zhì)5 min后形成W1/O，迅速倒入W2中形成復(fù)乳(W1/O/W2)，磁力攪拌器固化6 h(400 r/min)。固化后使用去離子水清洗數(shù)次，凍干，獲得微球。

1.2.2微球粒徑測(cè)量及形貌觀察 取少量制備好的PLGA微球懸浮于水中，振蕩使其均勻分散，加入激光粒度分析儀樣品池中，進(jìn)行測(cè)量。Span值表示粒徑分布，Span值越大表明顆粒尺寸越不均一。取適量冷凍干燥的 PLGA 微球溶于適量水中，吸取少量懸液滴于錫箔紙，晾干，表面噴金處理，掃描電子顯微鏡觀察其形貌[5]。將PLGA微球懸浮于水中，在倒置相差熒光顯微鏡下觀察PLGA微球尺寸，以及熒光強(qiáng)度，并在不同時(shí)間觀察微球降解情況。

1.2.3包埋率及裝載率測(cè)量 稱取VEGF緩釋微球凍干粉2 mg溶解在200 μL二甲基亞砜(DMSO)中，萃取VEGF，VEGF的水平通過(guò)定量ELISA試劑盒測(cè)定。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作。VEGF裝載率和包埋率由以下公式計(jì)算[6]：VEGF裝載率(%)=(微球的VEGF質(zhì)量/微球質(zhì)量)×100%；VEGF包埋率(%)=(測(cè)量VEGF裝載率/理論蛋白裝載率)×100%。

1.2.4體外VEGF釋放研究 精確稱取微球2 mg裝于EP管，以磷酸鹽緩沖液(PBS，100 μL)作為釋放介質(zhì)，加入0.1% BSA作為穩(wěn)定劑，0.8%(w/v)甘露醇作為濕潤(rùn)劑，37 ℃恒溫振蕩，分別在1 h、6 h、1 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d收集上清液。上清液中的VEGF水平通過(guò)VEGF-ELISA試劑盒測(cè)定。計(jì)算出累計(jì)釋放量，繪制載VEGF-PLGA微球累計(jì)釋放曲線。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS13.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Excel制作圖表。

2 結(jié) 果

2.1載VEGF熒光PLGA亞微米微球粒徑與形貌觀察 在掃描電鏡下，制備的微球呈圓球形，表面光滑，尺寸大小不一，但粒徑分布范圍較窄(圖1)。激光共聚焦顯微鏡可見(jiàn)微球熒光分布均勻，微球在水中分散度好，無(wú)粘連(圖2、3)。微球粒徑分布見(jiàn)圖4，微球粒徑為0.72 μm，Span值為1.127，表明制備的微球粒徑較為均勻。

圖1 微球掃描電鏡成像

2.2包埋率及裝載率 將2 mg載藥微球完全溶解，萃取出全部VEGF并測(cè)量，由包入微球的VEGF總量與總VEGF量百分比計(jì)算出包封率為51.42%，由包入微球內(nèi)的VEGF量與微球質(zhì)量百分比計(jì)算出載藥率為3.91%。

2.3微球降解觀察 2周之后，部分微球表面開(kāi)始出現(xiàn)膨脹、侵蝕、變形，微球之間出現(xiàn)粘連，另有少量微球崩解，另一部分微球形狀繼續(xù)保持原狀(圖5)。激光共聚焦顯微鏡下微球聚集嚴(yán)重，部分微球膨脹、崩解后導(dǎo)致熒光面積變大(圖6)。

圖2 微球激光共聚焦顯微鏡掃描(白光)

圖3 微球激光共聚焦顯微鏡掃描(綠色熒光)

圖4 VEGF微球粒徑分布圖

2.4微球體外VEGF釋放研究 將PLGA微球置于釋放介質(zhì)中，規(guī)定時(shí)間取出上清液，通過(guò)ELISA法測(cè)定VEGF水平，繪制出累積釋放曲線(圖7)?？煽闯鯬LGA微球在24 h內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)突釋效應(yīng)，在24 h之后VEGF釋放量緩慢地增加，1周之后釋放速度加快，到21 d進(jìn)入平臺(tái)期，到35 d累計(jì)釋放量接近80%。

圖5 兩周后微球崩解掃描電鏡影像

圖6 兩周后微球崩解激光共聚焦影像

圖7 微球體外累計(jì)釋放曲線

3 討 論

本研究所使用的細(xì)胞因子VEGF在生理?xiàng)l件下半衰期短，在體內(nèi)降解速度過(guò)快，需要對(duì)VEGF進(jìn)行緩釋處理，使其在局部緩慢勻速釋放，以達(dá)到臨床應(yīng)用的需要[7]。本研究所采用的微球材料為PLGA。PLGA是緩釋微球材料，其降解速率適中，性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的生物相容性與可降解性，無(wú)毒性、無(wú)致敏性、無(wú)致熱性、無(wú)致畸致癌作用、無(wú)細(xì)胞毒性，被廣泛應(yīng)用[8]。

本研究成功制備的亞微米微球粒徑約為0.72 μm，觀察其藥物緩釋時(shí)間長(zhǎng)(30 d左右)，短期時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)藥物突釋現(xiàn)象。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PLGA制備的微球體積不一，可制備成納米微球或微米微球，直徑由數(shù)百納米至數(shù)百微米不等，包裹藥物或細(xì)胞因子后可使其延長(zhǎng)釋放達(dá)到1～3個(gè)月。其中0.5～1.0 μm稱為亞微米微球，0.5 μm以下稱為納米微球。體積越小，在緩釋時(shí)藥物分布更均勻，但同等材料下緩釋時(shí)間會(huì)縮短，并且制備難度更大[9]。

復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法是目前制備PLGA微球的常用方法，它不需要相分離劑，操作簡(jiǎn)單，工藝相對(duì)成熟[10]。W/O/W 型復(fù)乳可以有效阻礙水溶性藥物進(jìn)入連續(xù)相，能夠提高藥物的包封率。因此，本實(shí)驗(yàn)采用 W/O/W 法制備載 VEGF的熒光PLGA 微球。在實(shí)驗(yàn)中，多種條件可以影響最終制成的微球粒徑，如PLGA濃度、PVA濃度、均質(zhì)化攪拌速度等。其中提高PLGA 濃度，可以使內(nèi)水相黏度變大，提高微球載藥量與包封率，增大微球的粒徑。而當(dāng)PVA 濃度增加，微球粒徑縮小。攪拌速率同樣影響較大，速度過(guò)低，剪切力小，使成球性差，速度過(guò)高會(huì)破壞乳液的穩(wěn)定性，VEGF流失量大[11]。本研究通過(guò)參考文獻(xiàn)[4，12]以及調(diào)整上述試劑濃度[PLGA 40 mg/mL、PVA(8%，W/V)，攪拌速度15 000 r/min]，最終制成粒徑為0.72 μm左右的亞微球。

本研究VEGF釋放結(jié)果表明，微球沒(méi)有出現(xiàn)突釋效應(yīng)，并且隨著時(shí)間VEGF逐漸釋放，實(shí)現(xiàn)了緩釋作用。一般情況下，載藥微球的釋放呈現(xiàn)三相釋放模式，即擴(kuò)散，持續(xù)釋放以及平臺(tái)期。Ⅰ相是指黏附于微球表面的細(xì)胞因子迅速釋放；Ⅱ相是指隨著微球的降解，細(xì)胞因子逐漸釋放；Ⅲ相是指當(dāng)大部分微球出現(xiàn)崩解，細(xì)胞因子釋放基本完畢，速度趨于平穩(wěn)。

因此，本研究制備的PLGA載VEGF亞微米微球，實(shí)現(xiàn)了所期望的微球粒徑，有較好的包埋率與裝載率，并在其中加入了綠色熒光，實(shí)現(xiàn)了微球可視，具有較好的研究與應(yīng)用前景。

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