周春妹， 沈佳瑾， 黃聲雷， 馬 艷，李華茵

（復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科， 上海 200032）

快速、準確鑒定血流感染病原菌是微生物實驗室的一項重要工作。血培養(yǎng)報陽后傳統(tǒng)的轉種和生化表型鑒定方法至少需要48 h，而通過對血培養(yǎng)陽性樣本的前處理，借助基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）可以快速得到細菌鑒定結果，大大縮短報告時間，從而滿足臨床快速診斷的需求。本研究通過對陽性血培養(yǎng)前處理方法改良前后的鑒定結果進行比較，以尋求更高效的血培養(yǎng)直接鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血培養(yǎng)陽性樣本 收集2016年3—9月復旦大學附屬中山醫(yī)院微生物室血培養(yǎng)陽性樣本378份，同一患者的不同血培養(yǎng)瓶均入選本研究。

1.1.2 試劑和儀器 BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)和配套的樹脂血培養(yǎng)瓶、溶血素血培養(yǎng)瓶、真菌血培養(yǎng)瓶及分離膠促凝管均購自美國BD公司。MALDI-TOF MS儀、α-氰基-4-羥基肉桂酸（alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid ，CHCA）基質(zhì)液、甲酸基質(zhì)液、64孔靶板、MS細菌數(shù)據(jù)庫（版本V2.0）及血瓊脂平板購自法國生物梅里埃公司。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甲酸、乙腈、無水乙醇購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 MALDI-TOF MS直接鑒定前處理 選擇鏡檢陽性的血培養(yǎng)樣本進行MALDI-TOF MS直接鑒定前處理，鏡檢陰性的血培養(yǎng)樣本則不再進行MALDI-TOF MS直接鑒定。

1.2.2 改良前的前處理方法 抽取5 mL陽性樣本轉入分離膠促凝管內(nèi)，以1 308×g低速離心10 min，棄去上清，將分離膠邊緣灰白色沉淀物（菌體富集物）挑取后放入含300 μL蒸餾水的Eppendorf管中，加無水乙醇900 μL，混勻。以19 000×g高速離心2 min。徹底去除上清，向沉淀物中加入70%甲酸50 μL和100%乙腈50 μL，混勻。以19 000×g高速離心2 min。取上清1.5 μL備用。

1.2.3 改良后的前處理方法 陽性血培養(yǎng)樣本按照之前的方法先離心，用1 000 μL蒸餾水洗滌分離膠邊緣的灰白色沉淀物，并將菌懸液轉移至 Eppendorf管中。以19 000×g高速離心2 min。棄去上清，沉淀加0.1%SDS 1 000 μL，充分混勻、洗滌。以19 000×g高速離心2 min。棄去上清，向沉淀物中加蒸餾水再次洗滌。高速離心后棄去上清，將沉淀物溶于300 μL蒸餾水和90 0 μL無水乙醇中，后續(xù)的步驟同前。

1.2.4 陽性血培養(yǎng)樣本的常規(guī)轉種與培養(yǎng) 挑取陽性血培養(yǎng)樣本，轉種血瓊脂平板，置35 ℃、CO2環(huán)境中過夜培養(yǎng)。

1.2.5 MALDI-TOF MS鑒定 將標準菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）（由法國生物梅里埃公司提供）涂在靶板的校準點位中，挑取0.5～1個菌落涂在靶板的點位中，取1.5 μL已前處理的上清液（直接鑒定的樣本）滴入靶板的點位中，待干燥。鏡檢或培養(yǎng)為細菌者加1 μL CHCA基質(zhì)液；鏡檢或培養(yǎng)為酵母者加0.5 μL 甲酸基質(zhì)液，室溫干燥后，再加1 μL CHCA基質(zhì)液，室溫干燥。校準點位加1 μL CHCA基質(zhì)液，干燥后放入MALDI-TOF MS儀，儀器自動獲取病原菌全細胞蛋白質(zhì)譜，將待測菌質(zhì)譜與MS細菌數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜進行比較、分析從而獲得鑒定結果。本實驗直接鑒定如出現(xiàn)與菌落鑒定不符合的結果，以純菌落MALDI-TOF MS的鑒定結果為最終結果。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 2.0軟件進行統(tǒng)計分析，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 未使用和使用SDS洗滌的樣本的檢測

未使用SDS洗滌的樣本90例，剔除3例純菌落MALDI-TOF MS無結果的樣本，單種細菌感染的血樣本83例，種鑒定準確率為73.5%，有4例為復數(shù)菌感染。使用SDS洗滌的樣本288例，剔除2例菌落MALDI-TOF MS無結果的樣本，單種細菌感染的血樣本277例，種鑒定準確率為82.7%，有9例為復數(shù)菌感染。

2.2 未使用和使用SDS洗滌的樣本各類病原菌的檢測

使用SDS洗滌樣本后MALDI-TOF MS對革蘭陽性球菌和酵母的鑒定準確率有明顯增加（P＜0.05），見表1。 改良后葡萄球菌的鑒定準確率從62.5%增加至95.6%，鏈球菌的鑒定準確率從33.3%增加至90.0%，一些少見菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、紋帶棒狀桿菌和人蒼白桿菌等都得到很好的鑒定，見表2。

2.3 復數(shù)菌的檢測

本研究收集復數(shù)菌感染共13例。改良前4例，有1例2種菌都得到鑒定結果，還有1例只鑒定出一種病原菌，另有2例無鑒定結果。改良后收集到9例復數(shù)菌感染的血樣本，有6例鑒定正確，有3例只鑒定出1種病原菌，鑒定準確率從25.0%增加至66.6%。見表3。

表1 未使用與使用SDS洗滌的樣本鑒定結果的比較

表2 未使用與使用SDS洗滌的樣本各類病原菌鑒定結果的比較

續(xù)表2

表3 未使用與使用SDS洗滌樣本復數(shù)菌鑒定結果的比較

3 討論

MALDI-TOF MS是一種新興的蛋白質(zhì)組學檢測技術，是微生物鑒定的新技術，因其具有快速、準確和操作簡便等特點而在微生物實驗室得到廣泛應用。通過病原菌富集技術處理陽性血培養(yǎng)樣本后直接用MALDI-TOF MS進行鑒定，將會極大地提高鑒定速度，縮短報告時間，滿足臨床快速診斷的需求。

在陽性血培養(yǎng)樣本直接鑒定中，前處理是關鍵步驟，對鑒定結果有直接影響。有文獻顯示目前富集菌體的前處理方法較多，有分離膠促凝管法、濾膜吸附法和差速離心法等，每種方法都有各自的特點，亦有較好的鑒定效果[1-3]。但限于某些研究方法需要添置特殊儀器或增加研究成本，本研究使用了分離膠促凝管法的前處理方法，該方法不需要另添置儀器，操作也較為簡便。

有文獻顯示，使用分離膠促凝管法富集菌體鑒定對革蘭陽性菌的鑒定準確率為60.0%～79.7%，革蘭陰性菌的鑒定準確率為86.6%～86.9%[4-6]。也有在使用分離膠的基礎上通過方法的改進使鑒定準確率增加的介紹[7]。本研究未使用SDS洗滌的樣本革蘭陽性菌的鑒定準確率為65.7%，革蘭陰性桿菌為92.3%，但在革蘭陽性球菌中除腸球菌屬有較好的鑒定準確率外，葡萄球菌屬和鏈球菌屬的鑒定準確率均不理想，分別僅為62.5%和33.3%，酵母的鑒定準確率則更低，僅11.1%。為得到更好的鑒定準確率，更有效地協(xié)助臨床診斷感染，在本研究后期對前處理方法進行修改，增加了SDS的洗滌過程。SDS是一種溫和去污劑，有相關文獻報道SDS可用于血培養(yǎng)念珠菌陽性的處理，可溶解血液中的血細胞，通過離心和洗滌去除其他干擾因素，純化要鑒定的細菌，增加鑒定的正確率[8]。通過SDS洗滌，葡萄球菌屬的鑒定準確率增加至95.6%，鏈球菌屬的鑒定準確率增加至90.0%，酵母的鑒定準確率也增加至50.0%，其中在23株近平滑念珠菌中有18株得到正確鑒定。而革蘭陰性桿菌的鑒定準確率略有降低，可能和后期出現(xiàn)的15株沙門菌鑒定準確率較低有關。在復數(shù)菌的鑒定中，經(jīng)過SDS洗滌，鑒定準確率也有大幅度增加，9例中有6例正確鑒定出2種病原菌。當然本研究復數(shù)菌的例數(shù)較少，混合菌種類型較少，還需更多的數(shù)據(jù)來證明。

本研究結果表明，在陽性血培養(yǎng)的直接鑒定中，用分離膠促凝管法富集菌體后增加SDS的洗滌處理，操作簡單，對增加MALDI-TOF MS的鑒定準確率有較大幫助，值得在臨床微生物實驗室推廣。

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