張紅楠，張旭輝，吳頔*，李勇*

(1.西南大學園藝園林學院，重慶400715；2.西南大學資源環(huán)境學院，重慶400715)

由核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的菌核病可侵害多種植物，是油菜(Brassicacampestris)植株最為嚴重的病害之一[1-3]。該病害在我國各油菜產區(qū)均有發(fā)生，常年發(fā)病率在10%～40%之間，嚴重時可達70%，極大地影響油菜的產量和品質[4]，給農業(yè)生產和發(fā)展帶來了巨大障礙。由于目前尚無理想的商品化抗病品種[3,5]，農業(yè)上對油菜菌核病的防治主要為化學農藥防治[6]。秦虎強等[7]研究發(fā)現(xiàn)腐霉利、多菌靈、甲基托布津和戊唑醇等4種農藥對油菜菌核病菌具有一定的防治效果，其中50%多菌靈和80%甲基托布津的田間防效在76%左右。但是長期使用殺菌劑很容易產生抗藥性，且不同地區(qū)的核盤菌抗性水平存有差異，同時藥物殘留和環(huán)境污染等問題已不符合農業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的要求[8]。輪作和土壤消毒等農藝措施雖有一定防治效果，但是由于油菜核盤菌寄主范圍廣，菌核在土壤中存活周期較長，使得防治不徹底；此外，輪作和土壤消毒的頻率較高和勞動力要求較大，難以適應中國集約化農業(yè)種植模式的要求[9]。生物防治因其高效持久、環(huán)境友好和無藥物殘留等特點已成為當前國內外防治油菜菌核病的研究熱點，并將逐漸成為植物病害防治的主流方向[10-11]。目前，已報道至少30種以上生防微生物對油菜菌核病具有防治效果，其中主要有芽孢桿菌(Bacillusspp.)[12]、假單胞菌(Pseudomonasspp.)和成團泛菌(Pantoeaagglomerans)[13]、放線菌(Actinomycetesspp.)[14]、木霉菌(Trichodermaspp.)[15]、盾殼霉(Coniothyriumminitans)[16]以及白僵菌(Beauveriabassiana)[17]等。

很多大型真菌的子實體從來不被病菌或昆蟲所侵襲[18]，而且受傷后的子實體能產生大量具有抗菌、殺蟲等效果的活性代謝產物[19]，因此可作為生物防治病害的重要資源。煙管菌(Bjerkanderaadusta)為木腐真菌，有研究發(fā)現(xiàn)，煙管菌能夠有效地防治褐腐病在櫟樹(Quercusrobur)上發(fā)生[20]。Bak等[21]分離到1株煙管菌菌株，研究表明該菌株具有抑菌防病作用，能夠有效防治歐美黑楊(Populuseuramericana)干腐病。國內則僅有汪華等[22]報道了煙管菌對紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)、黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)等具有很好的防治效果。本課題組分離篩選獲得1株對西瓜蔓枯病菌(Didymellabryoniae)具有明顯拮抗作用的煙管菌[23]，豐富了其生防作用研究。但目前尚無煙管菌對油菜核盤菌抑制作用的研究報道，此外，煙管菌最適液體培養(yǎng)條件及實際防病效果等均未見研究。本研究利用前期分離獲得具有生防作用的煙管菌(B.adusta)為出發(fā)菌株，研究活體菌株及其代謝液對油菜核盤菌的防治效果，并在掃描電鏡下觀察其對油菜核盤菌的重寄生作用，進而通過溫室盆栽試驗檢測其實際防病效果，為油菜菌核病生物防治提供又一理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1生防真菌 本課題組于2015年7月在重慶北碚“國家紫色土肥力與肥料效益監(jiān)測基地”(E 106°24′33″，N 29°48′36″)以五點取樣法采集5～20 cm土層的土樣，經分離篩選得到一株拮抗菌株，將其鑒定為煙管菌，命名為煙管菌M-1，其基因登錄號為KX377676[23]。

1.1.2病原真菌 油菜核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)由西南大學植物生態(tài)病理研究所惠贈。

1.1.3培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH 自然；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然；液體基礎培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，MgSO4·7H2O 0.1%，NH4Cl 1.0%， CaCl20.1%，KH2PO40.2%，pH自然；基礎培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，NH4Cl 1.0%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl20.1%，瓊脂1.5%～2.0%，pH自然。

1.1.4其他材料 油菜種子品種為德雜油9號采購自四川綿陽特研種業(yè)有限公司；50%多菌靈可濕粉劑購于威海韓孚生化藥業(yè)有限公司；70%甲基托布津可濕粉劑購于陜西美邦農藥有限公司。用無菌水將兩種農藥粉劑分別配制為0.4 mg·mL-1和80 μg·mL-1的液體藥劑，4 ℃保存?zhèn)溆?；植物栽培土為西南大學二號試驗田紫色土，將其過2 mm篩后高壓蒸汽滅菌2 h。

1.2 試驗方法

1.2.1菌株M-1抑菌效果測定 通過菌餅對峙抑菌試驗[24]測定菌株M-1活體菌對油菜核盤菌的體外抑菌效果。在PDA的平板上相距3 cm的兩點分別接種直徑5 mm的菌株M-1菌餅和油菜核盤菌菌餅，構成兩點對峙，以分別加入3 mL 0.4 mg·mL-1的多菌靈和甲基托布津的平板為農藥處理，以只接種油菜核盤菌的平板為對照組，于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，十字交叉法[23]測量平板中油菜核盤菌菌落相對方向的菌落半徑，計算菌株M-1對油菜核盤菌的抑菌率。每個處理均設3次重復。

抑菌率= (對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑×100%

再通過液體培養(yǎng)液抑菌試驗[25]測定菌株M-1無菌濾液對油菜核盤菌的抑菌效果。使用直徑5 mm的無菌打孔器打取M-1菌株菌餅5塊，接種在盛有100 mL液體基礎培養(yǎng)基的無菌三角瓶中，在28 ℃、150 r·min-1條件下，震蕩培養(yǎng)5 d，用0.22 μm無菌濾器過濾其代謝液至10 mL離心管中，取3 mL無菌濾液與15 mL基礎培養(yǎng)基混合均勻，冷卻后再將油菜核盤菌菌餅接種到此培養(yǎng)基上，以不接拮抗菌菌株M-1液體基礎培養(yǎng)基的無菌濾液作為空白對照，以分別加入3 mL 0.4 mg·mL-1的多菌靈和甲基托布津作為農藥對照。28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，十字交叉法[23]測量油菜核盤菌菌落直徑和其對照平板上的菌落直徑，計算拮抗菌菌株M-1無菌濾液對油菜核盤菌的抑菌率，每個組合3次重復。

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.2.2菌株M-1重寄生作用觀察 在PDA平板中央接種5 mm的油菜核盤菌菌餅，在距其3 cm的上下左右各接種同樣大小的菌株M-1菌餅，于28 ℃暗處恒溫培養(yǎng)90 h后觀察拮抗效果，以單接病原真菌的培養(yǎng)皿為對照組。再按1.2.1菌餅對峙抑菌試驗的操作得到對峙平板，并在兩者之間平鋪一塊無菌錫箔紙至菌絲接觸，參考Shao等[26]的方法制備樣品，進行顯微觀察和掃描電鏡觀察，揭示菌株M-1的重寄生作用。

1.2.3菌株M-1液體培養(yǎng)液熱穩(wěn)定性檢測 按照1.2.1液體培養(yǎng)液抑菌試驗的方法得到菌株M-1無菌濾液，于40、60、80和100 ℃水浴處理30 min，以與室溫相近的水浴溫度處理為對照，隨后操作按照1.2.1的相關方法進行，計算不同溫度水浴處理后菌株M-1液體培養(yǎng)液對油菜核盤菌的抑菌率，每個處理均設3次重復。

1.2.4菌株M-1液體培養(yǎng)條件選擇 通過單因素試驗確定菌株M-1液體培養(yǎng)條件。其液體培養(yǎng)的碳源在乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖中選擇；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，其氮源在硝酸銨、氯化銨、蛋白胨、硝酸鉀、酵母膏和牛肉膏中選擇，無氮源的液體基礎培養(yǎng)基作為空白對照；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，調節(jié)其液體基礎培養(yǎng)基的C/N為1.2∶1、3.6∶1、4.8∶1、6.0∶1、7.2∶1、8.4∶1、12.0∶1和18.0∶1；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，碳源用量分別以5、10、15、20和25 g·L-1添加；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，液體基礎培養(yǎng)基的初始pH分別調節(jié)為3.0、5.0、7.0和9.0，從而確定菌株M-1液體培養(yǎng)最適的pH；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，在20、25、30、35和40 ℃的溫度下進行液體培養(yǎng)，150 r·min-1培養(yǎng)5 d；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，在250 mL三角瓶中按照15%、30%、40%、45%、50%、60%和75%(V/V)的裝瓶量進行液體培養(yǎng)， 150 r·min-1培養(yǎng)5 d；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，于100、140、180和220 r·min-1的條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d；在其他培養(yǎng)條件相同的條件下，搖床震蕩培養(yǎng)5、10、15、20、25和30 d后檢測其抑菌率，其他操作按1.2.1中的相關方法進行，并計算不同條件下菌株M-1對油菜核盤菌的抑菌率。每組處理3次重復，確定液體培養(yǎng)最佳的碳源、氮源、C/N、碳源用量、pH、溫度、裝瓶量、轉速和液體培養(yǎng)時間。

1.2.5響應曲面法優(yōu)化液體培養(yǎng)條件 在確定最佳液體培養(yǎng)條件基礎上，再根據(jù)響應曲面設計原理及方法[27]，進行6因素3水平的響應面分析試驗，每個因素取低、中、高3個水平，分別記做-1、0和+1，為避免掩蓋其他因素的重要性，故某個因素高低水平的差值不能太大，因此，本試驗設定高水平為低水平的1.4～1.8倍。以試驗因子為自變量，以菌株M-1培養(yǎng)液對油菜核盤菌的抑菌率為響應值，探究各因素對抑菌率的影響，確定其液體培養(yǎng)條件的最佳組合。

1.2.6溫室盆栽試驗 盆栽試驗于2016年3月至7月在西南大學1號溫室進行，溫度為28～40 ℃，相對濕度為45%～70%。將剛發(fā)芽的油菜種子移栽至盛有2 kg無菌土的花盆(Φ19 cm×13 cm)中，緩苗20 d，繼續(xù)管理使其正常生長。最適液體培養(yǎng)條件下培養(yǎng)得到菌株M-1菌液后，采用牙簽接種法[28]在生長一致的油菜植株第3、4片老葉及距離根部20 cm處的莖部分別進行接菌處理，試驗設計4組處理，CK水：無菌水處理；CK?。河筒撕吮P菌處理；CT1：同時接種油菜核盤菌和菌株M-1的處理；CT2：接種油菜核盤菌并噴施10 mL 80 μg·mL-1多菌靈。每個處理組15株，各3次重復。溫室生長兩周后根據(jù)Smith 等[29]的分級標準及計算方法統(tǒng)計病情指數(shù)及拮抗菌的防病效果。0級：莖葉處均無病斑或葉片發(fā)病但病葉小于1%；1級：莖或者葉片出現(xiàn)小塊病斑，病葉在1%～25%；2級：莖或者葉片有大塊病斑，病葉在26%～50%；3級：莖或者葉片有大量病斑，葉片枯萎卷曲，病葉在51%～75%；4級：植株出現(xiàn)大量病斑，病葉在76%～90%；5級：病葉占到90%以上或者整株病死。

病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)×相應級數(shù))/(調查植株總數(shù)×最高級數(shù))×100

防病效果=(CK病病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/CK病病情指數(shù)×100%

收獲油菜植株并測定每株葉片數(shù)、株高、根長、莖圍、濕重、烘干后的干重。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用IBM SPSS Statistics 21軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及分析；應用Microsoft Excel 2007進行圖表制作；借助 Design Expert 8.0.6軟件進行響應曲面條件優(yōu)化分析。

2 結果與分析

2.1 菌株M-1抑菌效果

以菌餅對峙抑菌試驗測定菌株M-1體外抑菌效果，表1顯示，菌株M-1對油菜核盤菌的抑菌率達到67.9%，分別是多菌靈處理和甲基托布津處理的3.0和2.2倍，均達到顯著差異水平(P<0.05)。而在液體培養(yǎng)抑菌試驗中，菌株M-1無菌濾液的抑菌活性同樣高于農藥處理，其對油菜核盤菌的抑菌率達到51.8%，分別是多菌靈處理和甲基托布津處理的1.3和2.2倍，不同處理間均達到顯著差異水平(P<0.05)。

2.2 菌株M-1重寄生作用

如圖1所示，恒溫培養(yǎng)90 h后，單接油菜核盤菌的菌落長滿整個平板(圖1A)，而同時接種菌株M-1的病原真菌生長明顯受到抑制， 其菌落四周均出現(xiàn)抑菌帶(圖1B)。顯微觀察發(fā)現(xiàn)， 在菌落交界處兩者的菌絲形態(tài)均發(fā)生變化，菌株M-1菌絲由非拮抗區(qū)的疏松、分枝(圖1C)變?yōu)檗卓箙^(qū)的濃密、筆直、無分枝(圖1D)，而油菜核盤菌的菌絲由非拮抗區(qū)的細且多分枝(圖1E)變?yōu)榇智疑俜种?圖1F)，說明兩者已進入拮抗互作期。在掃描電鏡下則清晰地觀察到菌株M-1菌絲直接穿插、刺透油菜核盤菌菌絲，使后者菌絲膨大、變形甚至破裂，表現(xiàn)出強烈的重寄生作用(圖1G，H)。

2.3 菌株M-1液體培養(yǎng)液熱穩(wěn)定性

由圖2可見，M-1菌株對油菜核盤菌抑菌率最高的溫度處理為40 ℃，80 ℃處理后抑菌率在38.9%，而100 ℃處理后抑菌率仍達到35.4%， 60、80和100 ℃處理間無顯著差異(P>0.05)，并且其抑菌率均在37%左右，說明菌株M-1液體培養(yǎng)液具有熱穩(wěn)定性。

表1 各處理對油菜核盤菌的抑菌率Table 1 Inhibitory rates of different treatment against S. sclerotiorum (%)

注：均值±標準差(n=3). 不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05), 0.4 mg·mL-1多菌靈和甲基托布津為農藥對照, 下同。

Note: mean±SD (n=3). The different lowercase letters represent the existence of significant differences atP<0.05, and 0.4 mg·mL-1carbendazim and thiophanate methyl were as control group, the same below.

圖1 菌株M-1對油菜核盤菌的拮抗作用及重寄生作用 Fig.1 The antagonism and mycoparasitism of B. adusta M-1 against S. sclerotiorum A: 油菜核盤菌; B: 被抑制的油菜核盤菌; C: 生防菌非拮抗區(qū)菌絲; D: 生防菌拮抗區(qū)菌絲; E: 病原菌非拮抗區(qū)菌絲; F: 病原菌拮抗區(qū)菌絲; G，H: 煙管菌M-1對油菜核盤菌的重寄生作用。M-1為煙管菌菌絲，S為油菜核盤菌菌絲。 A: S. sclerotiorum; B: Inhibited S. sclerotiorum; C: B. adusta mycelium not in antagonistic region; D: B. adusta mycelium in antagonistic region; E: S. sclerotiorum mycelium not in antagonistic region; F: S. sclerotiorum mycelium in antagonistic region; G,H: The mycoparasitism of B. adusta M-1 against S. sclerotiorum. M-1 representative B. adusta strain, S representative S. sclerotiorum strain.

2.4 菌株M-1液體培養(yǎng)條件選擇

通過單因素試驗選擇最適液體培養(yǎng)條件，如圖3所示，不同條件對菌株培養(yǎng)液的抑菌率具有不同影響。菌株M-1對油菜核盤菌抑菌率最高時的液體培養(yǎng)碳源為麥芽糖(圖3A)，最適氮源為硝酸銨(圖3B)，對油菜核盤菌的抑菌率分別達到68.8%和66.2%，顯著高于其他處理(P<0.05)。隨著C/N升高，其抑菌率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，C/N為7.2∶1時抑菌率達到最大的100%(圖3C)。20 g·L-1的碳源用量抑菌率達到最高，可確定其為最佳用量(圖3D)。培養(yǎng)液酸堿性對其抑菌率有較大影響，酸性環(huán)境下抑菌率要明顯高于中性和堿性，在pH為5.0時抑菌率最高(圖3E)。培養(yǎng)溫度對抑菌率的影響也表現(xiàn)出先升高后降低的規(guī)律(圖3F)，在25 ℃時抑菌率達到最高的53.8%，由此可確定25 ℃為最適液體培養(yǎng)溫度。裝瓶量為30%(v/v)時抑菌效果最好，50%裝瓶量的抑菌率最低，均與其他處理間達到顯著差異水平(P<0.05)，確定30%為最佳裝瓶量(圖3G)。轉速在140 r·min-1(圖3H)、培養(yǎng)20 d(圖3I)時均達到最大抑菌率，分別為90%和77.8%。

圖2 不同溫度處理對菌株M-1液體培養(yǎng)液抑菌率的影響Fig.2 Effects of different temperature treatments on the inhibitory rate of fermentation broth 不同小寫字母表示差異顯著，下同。The different lowercase letters represent the existence of significant differences at P<0.05, the same below.

2.5 響應曲面法優(yōu)化液體培養(yǎng)條件

根據(jù)單因素水平試驗，進行響應曲面法的Box-Behnken試驗設計。對油菜核盤菌抑菌率的Box-Behnken試驗設計因子與響應值以及回歸方程的方差分析見表2和表3。

圖3 不同液體培養(yǎng)條件對菌株M-1代謝液抑菌率的影響Fig.3 Effect of fermentation broth in different fermentation conditions on the inhibitory rate

代碼Name試驗因子Factor編碼值Codevalue-10+1代碼Name試驗因子Factor編碼值Codevalue-10+1AC/N6．07．28．4D時間Time(d)152025BpH4．05．06．0E轉速Rotationspeed(r·min-1)140180220C裝瓶量Bottlingquantity(%)303540F溫度Temperature(℃)253035

表3 試驗設計回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA analysis of regression equation of test design

借助 Design Expert 8.0.6軟件對以上數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到抑菌率Y對編碼自變量的二次回歸多項方程為：Y=79.10+5.55×A-1.27×B-0.75×C+2.22×D+0.65×E+2.66×F-0.90×A×B-7.80×A×C+0.87×A×D-5.24×A×E+1.08×A×F+6.26×B×C-8.52×B×D+1.61×B×E-2.08×B×F-0.59×C×D-5.69×C×E-7.19×C×F+5.66×D×E+4.91×D×F+0.27×E×F-19.28×A2-13.11×B2-9.23×C2-9.29×D2-23.40×E2-12.69×F2。

圖4 響應曲面中兩兩因子間對響應值的影響Fig.4 The influence between any two factors on the response value in the surface response

以F-檢驗判斷各項變量對響應值的顯著性(表3)可知，擬合的二階模型的F值為3.81，概率P (Prob>F)為 0.0005，小于0.01，說明模擬達到顯著水平。方差分析發(fā)現(xiàn)其二次項對抑菌率的影響有顯著差異，說明各試驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。因此可以用該模型對培養(yǎng)液抑菌率進行分析和預測，也能夠利用該回歸方程確定最適液體培養(yǎng)條件。

根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應曲面分析圖，如圖4顯示，固定其中4個因子而另2個變量因子可以三維模型展現(xiàn)其與響應值(抑菌率)的關系，響應面開口向下，存在最大值。由Design Expert 8.0.6軟件預測出最大值點Y=80.9%，此時對應的最佳條件為：C/N為7.49，pH為4.71，裝瓶量為33.13%，時間為21.79 d，轉速為180 r·min-1，溫度為31.56 ℃，但考慮到實際操作，可確定菌株M-1對油菜核盤菌抑制效果最好的液體培養(yǎng)條件為：C/N為7.5，pH為4.7，裝瓶量為33%，時間為22 d，轉速為180 r·min-1，溫度為32 ℃。培養(yǎng)條件優(yōu)化后，對油菜核盤菌的抑菌率高于未經優(yōu)化的51.8%，抑菌效果大幅增加。

2.6 溫室盆栽試驗

由表4可見，各處理對油菜植株生長情況均有不同。CK水葉片數(shù)與CT2相等，略高于CT1，但3個處理間均未達到顯著差異水平(P>0.05)，CK病葉片數(shù)最少，與其他處理間均有顯著差異(P<0.05)。CT1的株高、根長、莖圍、濕重以及干重均高于CK病，僅根長、濕重和干重高于CT2。對油菜植株的病情指數(shù)和防病效果進行調查發(fā)現(xiàn)，菌株M-1處理的病情指數(shù)顯著低于CK病和多菌靈處理(P<0.05)，而防病效果達到71.4%，高于多菌靈處理，對油菜核盤菌的防病效果好于農藥處理，說明菌株M-1具有田間應用潛力。

表4 盆栽試驗中各處理對油菜生長及防病效果影響Table 4 Effects of different treatments on rapeseed growth and disease control in pot experiment

CK水為無菌水處理；CK病為油菜核盤菌的處理；CT1為接種油菜核盤菌和菌株M-1的處理；CT2為接種油菜核盤菌并噴施10 mL 80 μg·mL-1多菌靈的處理。CK-water was treatment with aseptic water; CK-disease was treatment withS.sclerotiorum; CT1was treatment withS.sclerotiorumand strain M-1 simultaneously; CT2was treatment withS.sclerotiorumand 10 mL 80 μg·mL-1carbendazim simultaneously.

3 討論

利用生防菌進行油菜菌核病的防治已有大量研究，但是煙管菌對油菜核盤菌的生防研究至今未見報道。本研究以所分離、鑒定的煙管菌為出發(fā)菌株，初次探究了其對油菜核盤菌的抑制效果，進一步明確了其生防作用價值。結果表明，不論是活體菌株的體外抑菌還是菌株無菌濾液，對油菜核盤菌均有較好的抑制作用。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在菌落交界處兩者的菌絲均發(fā)生變化，掃描電鏡下顯示菌株M-1菌絲直接穿插、刺透油菜核盤菌菌絲，使后者菌絲膨大、變形甚至破裂，表現(xiàn)出強烈的重寄生作用，而在盆栽試驗中的防病效果達到71.4%，明顯高于農藥處理，充分說明菌株M-1對核盤菌具有較好的生防作用。與一些生防菌類似，煙管菌可通過與病原菌競爭營養(yǎng)物質、寄生于病原菌菌絲以及產生抑菌活性物質等作用機制來抑制或殺死病原菌，達到防病效果[30]。此外，煙管菌為木腐真菌，其子實體能產生大量具有抗菌活性代謝產物[19]，這也可能會對油菜核盤菌的抑制效果起到重要作用。

生防菌寄生病原真菌的過程是通過產生吸器或者類似吸器的結構直接穿透靶標菌絲[31]，或者是通過分泌溶解性及次級代謝產物來識別、接觸并溶解病原真菌菌絲[32]。Ohberg等[33]發(fā)現(xiàn)盾殼霉能夠寄生核盤菌的菌絲和菌核，從而控制由核盤菌引起的作物菌核病。也有研究[34-35]表明，盾殼霉在重寄生過程中，菌絲頂端可以直接穿透并侵入核盤菌的細胞壁。韓立榮等[14]報道了放線菌11-3-1菌株能夠使油菜核盤菌的菌絲體發(fā)生畸形變化，菌絲腫脹、彎曲，菌絲體內原生質濃縮。本研究發(fā)現(xiàn)煙管菌M-1在生防作用中使油菜核盤菌菌絲形態(tài)發(fā)生變化，并可直接穿插、刺透油菜核盤菌菌絲，使后者菌絲膨大、變形甚至破裂，與前人研究基本相符。因此，可認為重寄生作用是生防菌對油菜核盤菌生物防治的主要作用機制之一。

利用微生物抑制油菜核盤菌的生防研究取得了一定進展，但是溫度等環(huán)境因子會嚴重影響其防治效果[36]。楊蕊等[16]研究發(fā)現(xiàn)盾殼霉 Chy-1在改良的查彼液體培養(yǎng)基(Modified Czapek-Dox，MCD)的培養(yǎng)濾液經120 ℃處理后對核盤菌的抑菌活性有所下降，但其抑菌率仍達到49.5%，說明濾液中活性物質具有較強的熱穩(wěn)定性。為確保煙管菌M-1在溫度較高的田間環(huán)境也能發(fā)揮生防作用，本研究檢測了其代謝液的熱穩(wěn)定性，結果表明，其代謝濾液經80 ℃甚至100 ℃處理30 min后，抑菌率仍在35%以上，較好的熱穩(wěn)定性將有利于菌株在實際生產中有效防治油菜菌核病。

抗菌活性物質通常作為生防菌發(fā)揮生物防治作用的物質基礎，其種類和產量均能影響生防菌株的實際應用效果。從盾殼霉培養(yǎng)濾液中鑒定出的內酯類抗生素和絲氨酸蛋白酶對核盤菌具有很強的抑制作用[37-38]，而解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)產生的脂肽類代謝活性物質對油菜核盤菌具有強烈的抑制作用[39]。木霉菌則能夠產生多種非揮發(fā)性代謝抑菌產物，諸如幾丁質酶類、纖維素酶及木聚糖酶等蛋白酶類均參與核盤菌的生防作用[40]。本研究結果表明，菌株M-1無菌濾液對油菜核盤菌具有明顯的抑制作用，說明其代謝液中抑菌物質的活性較高，但究竟是內酯類抗生素、脂肽類、蛋白酶類或其他活性物質在起抑菌作用尚不清楚，后續(xù)將針對其活性成分以及敏感性進行深入研究。

響應曲面法優(yōu)化可以在合理范圍內減少試驗次數(shù)，考察不同變量及其之間的交互作用對相應值的影響，已經廣泛應用于生物工程的條件優(yōu)化中。藍星杰[41]采用此方法優(yōu)化了生防菌株SC11發(fā)酵條件，提升了發(fā)酵液對核盤菌的抑制效果。本研究采用單因素試驗和響應曲面法對菌株M-1液體培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，確定了最佳條件組合：C/N為7.5，pH為4.7，裝瓶量為33%，時間為22 d，轉速為180 r·min-1，溫度為32 ℃，優(yōu)化后的抑菌率可以提升到80.9%。

本研究通過純天然、無害化處理的生物防治手段對油菜菌核病進行了抑菌研究，其生防菌株完全來自自然生物，具有綠色、安全、無污染、無殘留等特點，且在盆栽試驗中的防病效果顯著，但是，油菜植株-油菜核盤菌-煙管菌所構成的生物體系在病害發(fā)生與防治的復雜過程中的作用機制有待進一步深入研究，以便能夠更好地開發(fā)利用該生防菌，從而最大效應地發(fā)揮其生防作用潛力。

4 結論

煙管菌M-1菌株作為生防真菌對油菜核盤菌具有一定的抑制效果，并且對核盤菌具有明顯的重寄生作用，其無菌濾液具有熱穩(wěn)定性。通過單因素和響應曲面法對其液體培養(yǎng)條件優(yōu)化后，確定了最佳條件組合，優(yōu)化后的抑菌率可大幅提升。溫室盆栽中對油菜菌核病的防病效果達到71.4%，高于多菌靈處理。因此，該菌株作為生防菌具有重要應用價值和開發(fā)前景。

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