李彥杰，楊俊年，劉仁華，周大祥,2，甘麗萍，吳應(yīng)梅

(1.重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 萬(wàn)州 404100；2.重慶大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶市基因功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400300)

【研究意義】三峽水庫(kù)175 m蓄水完成后，使其上游形成長(zhǎng)度約660 km，面積約10 000 km2，水位落差達(dá)30 m的周期性冬水夏陸消落帶系統(tǒng)[1]。反季節(jié)性長(zhǎng)期水淹環(huán)境破壞了消落帶固有的生態(tài)系統(tǒng)，使得從三峽大壩到其上游的重慶江津地區(qū)因?yàn)橄鋮^(qū)植被的退化及破壞而產(chǎn)生了如水土流失和環(huán)境污染加劇等眾多問(wèn)題[2-3]。【前人研究進(jìn)展】為了恢復(fù)或重建消落帶生態(tài)系統(tǒng)，學(xué)界在耐淹植物的篩選和選育等方面做了大量的工作，已經(jīng)篩選出一些消落帶適生植物，并從形態(tài)學(xué)、生理生化及分子水平初步研究了部分耐淹植物的抗性機(jī)制[4-6]。狗牙根(Cynodondactylon)為三峽庫(kù)區(qū)消落帶原生植物，表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐淹能力和環(huán)境適應(yīng)能力，如狗牙根通過(guò)莖節(jié)、根及分枝等生長(zhǎng)對(duì)不同水淹環(huán)境環(huán)境作出響應(yīng)[7]。水淹脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的活性氧自由基及酒精發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇大量累積，從而可能對(duì)其細(xì)胞造成傷害[8-10]。研究表明，狗牙根在水淹環(huán)境下表現(xiàn)出較高的抗氧化組分水平及乙醇脫氫酶活性，可有效地降低水淹環(huán)境對(duì)其細(xì)胞傷害[11-12]。水淹生境下誘發(fā)植物形成通氣組織及抗氧化水平上調(diào)等適應(yīng)性機(jī)制均與抗逆基因的表達(dá)有關(guān)[13-14]?？鼓婊虮磉_(dá)有賴于參與逆境調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及TF表達(dá)，故研究水淹生境下狗牙根的TF表達(dá)特性對(duì)揭示植物耐水淹機(jī)制具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)采取實(shí)地水淹處理，基于轉(zhuǎn)錄組分析研究水淹生境下狗牙根參與抗水淹響應(yīng)的TF表達(dá)特性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以期為狗牙根抗水淹分子機(jī)制的探索提供基礎(chǔ)，并為后續(xù)的耐淹植物篩選及育種等提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

三峽庫(kù)區(qū)消落帶適生狗牙根取自重慶市萬(wàn)州區(qū)新田鎮(zhèn)譚紹村的消落帶適生植物篩選示范基地。取長(zhǎng)勢(shì)一致的當(dāng)年生分蘗苗分別作水淹處理，水淹深度30 cm為處理組(A2)，未水淹為對(duì)照組(A1)。處理組水淹15 d，狗牙根已發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)取A1和A2組狗牙根地下莖為樣本，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 測(cè)序樣品的制備及測(cè)序

按照Takara RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue提供的操作流程提取樣品的總RNA，并通過(guò)Nanodrop 分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA的濃度和質(zhì)量。提取的總RNA經(jīng)過(guò)ploy (T)磁珠富集純化mRNA，加Fragmentation Buffer隨機(jī)打斷mRNA，以隨機(jī)引物和發(fā)轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNaseH及DNA聚合酶合成cDNA第二鏈。純化cDNA后作末端修復(fù)，末端加A并連接測(cè)序接頭，電泳篩選一定大小的片段建庫(kù)并基于Illumina HiSeq 4000 測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

測(cè)序所得的raw reads經(jīng)過(guò)去除低質(zhì)量片段、短片段、接頭污染以及未知堿基含量過(guò)高的片段后得到clean read，利用Trinity組裝Unigene，并通過(guò)與Nr、Nt、Swissprot、KEGG、COG、Interpro和GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋Unigenes，未能注釋的Unigene用ESTScan作CDS 預(yù)測(cè)。利用Hmmsearch 將Unigene的ORF比對(duì)到PlntfDB預(yù)測(cè)TF(TF)?；赗SEM計(jì)算A1和A2樣品的TF表達(dá)水平，用PossionDis法檢測(cè)差異表達(dá)TF，篩選標(biāo)準(zhǔn)為Fold Change≥ 2.00 和FDR≤0.001。

1.4 實(shí)時(shí)定量 PCR分析

挑選4個(gè)差異表達(dá)TF基因作實(shí)時(shí)定量 PCR分析驗(yàn)證。取測(cè)序植物樣品按照康為世紀(jì)公司HiFiScript cDNA synthesis kit提供的流程提取RNA及反轉(zhuǎn)錄。選用GAPDH基因作為內(nèi)參，擴(kuò)增所用引物如表1，按照康為世紀(jì)公司Ultra SYBR Mix Kit提供流程，利用Bio-Rad CFX connect Q-PCR作實(shí)時(shí)定量 PCR分析。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃保持10 min； 95 ℃保持15 s，60 ℃保持1 min，設(shè)置40次循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果及Unigene的功能注釋

A1和A2共獲得22.11 G的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)過(guò)濾及去冗余后共獲得147 256條總Unigene，其中A1和A2的Unigene數(shù)目分別為128 031和83 363。將得到的總Unigene分別作Nr、Nt、Swissprot、KEGG、COG、Interpro和GO注釋，7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可注釋總Unigene數(shù)目的72.84 %。按照NR、SwissProt、KEGG、COG的優(yōu)先次序，選擇Unigene的最佳比對(duì)片段作為其CDS。未注釋的總Unigene基于ESTScan作CDS預(yù)測(cè)，Blast和ESTScan可分別預(yù)測(cè)94 849和8135條Unigene，將結(jié)果作為該Unigene的參考注釋。

表1 實(shí)時(shí)定量 PCR 選用基因及其引物Table 1 Genes and primers for qRT-PCR

2.2 狗牙根響應(yīng)水淹脅迫的TF家族及數(shù)目

對(duì)具有編碼TF能力的總Unigene進(jìn)行預(yù)測(cè)，并按照TF家族進(jìn)行分類(圖1)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，具有TF編碼能力的Unigene屬于62個(gè)TF家族，共2928條TF。預(yù)測(cè)數(shù)目較多的TF家族均與植物的抗逆有關(guān)，如MYB、MYB-related、bHLH、AP2-EREBP、NAC和WRKY等，這些家族可能參與狗牙根對(duì)水淹脅迫的形態(tài)學(xué)發(fā)育和生理代謝改變響應(yīng)。

2.3 狗牙根響應(yīng)水淹脅迫的TF表達(dá)水平變化

基于PossionDis法狗牙根在水淹生境下的差異表達(dá)TF基因，以log2FoldChange表示差異倍數(shù)，共篩選出屬于54個(gè)家族的差異表達(dá)TF 785條，共27個(gè)家族的348條TF上調(diào)表達(dá)，34個(gè)家族的437條TF下調(diào)表達(dá)(表2)。其中，WRKY、bHLH、MYB、AP2-EREBP、MYB-related、Trihelix、NAC、MADS和TCP等9個(gè)家族是差異表達(dá)基因數(shù)量最多且表達(dá)量變化幅度最顯著的TF家族，共包含430條差異表達(dá)TF，占總差異表達(dá)總TF的54.78 %，其中上調(diào)表達(dá)189條，下調(diào)表達(dá)241條。9個(gè)家族中，除TCP和Trihelix家族外，其他TF家族對(duì)狗牙根水淹脅迫的響應(yīng)表達(dá)呈明顯下調(diào)，而9個(gè)TF家族對(duì)狗牙根水淹脅迫的響應(yīng)表達(dá)均呈明顯上調(diào)(表3)。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR分析驗(yàn)證

分別從WRKY、bHLH、MYB和AP2-EREBP等4個(gè)TF家族挑選表達(dá)差異表達(dá)倍數(shù)較大的基因作實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參基因，用2△△Ct表示檢測(cè)到的基因表達(dá)量，每個(gè)檢測(cè)基因設(shè)置3次生物重復(fù)。后期數(shù)據(jù)處理中將轉(zhuǎn)錄組和熒光定量PCR檢測(cè)到的某一個(gè)基因表達(dá)量變化分別用log2-ratio表示，其中l(wèi)og2-ratio=log2[處理組表達(dá)量/對(duì)照組表達(dá)量]。基于SPSS 22.0分析轉(zhuǎn)錄組和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的差異表達(dá)基因log2-ratio，結(jié)果顯示爾遜相關(guān)系數(shù)為0.8748，P<0.012，表明轉(zhuǎn)錄組分析的差異基因表達(dá)情況較為可靠(圖2)。

3 小結(jié)與討論

缺氧和光線不足是深水淹對(duì)植物的主要脅迫作用，如缺氧環(huán)境會(huì)破壞植物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)而導(dǎo)致活性氧自由基等在植物細(xì)胞內(nèi)累積而引發(fā)膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，及誘發(fā)植物進(jìn)行無(wú)氧代謝而導(dǎo)致乙醇等細(xì)胞毒害作用物質(zhì)的產(chǎn)生。此外，深水淹生境下，由于氧氣不足也會(huì)引起植物體內(nèi)貯存物質(zhì)的減少，而光照不足導(dǎo)致光合效率低下，使得植物體內(nèi)碳水化合物等不能及時(shí)補(bǔ)充。植物對(duì)深水淹的適應(yīng)性機(jī)制包括形成不定根和通氣組織、下調(diào)代謝速率、提高弱光利用能力和上調(diào)還原性組分水平等。

表2 狗牙根響應(yīng)水淹脅迫的差異表達(dá)TF數(shù)量及變化范圍Table 2 Number and range of differentially expressed TFs in response to flooding stress of bermudagrass

表3 9個(gè)數(shù)目最多的差異表達(dá)TF家族Table 3 Nine of the largest number of differentially expressed transcription factor families

圖2 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)定量PCR分析驗(yàn)證Fig.2 Validation of DEGs by real-time qRT-PCR

TF在植物抗水淹脅迫應(yīng)答中有著重要作用，已有研究表明，WRKY、bHLH、MYB、HSF、AP2-EREBP、MYB-related和NAC等家族的TF參與植物的抗逆響應(yīng)，不同TF表達(dá)水平的變化與植物的脅迫耐受有關(guān)。本研究表明，水淹脅迫會(huì)誘導(dǎo)狗牙根多個(gè)家族的TF表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，相同TF家族中的不同TF表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，這些TF的種類及表達(dá)水平的變化可能與狗牙根對(duì)水淹脅迫響應(yīng)的形態(tài)發(fā)育及代謝改變等適應(yīng)性機(jī)制有關(guān)。研究表明，WRKY、家族TF參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、損傷修復(fù)及水淹等非生物脅迫等[15]。本研究發(fā)現(xiàn)WRKYTF家族中有13條上調(diào)表達(dá)，116條下調(diào)表達(dá)，富集數(shù)量較多，顯示該TF家族的不同成員在狗牙根抗水鹽脅迫中可能同時(shí)調(diào)控多種抗逆基因表達(dá)。bHLH、MYB、AP2-EREBP、MYB-related和Trihelix等家族的TF也廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)這些TF家族均在狗牙根水淹脅迫中差異表達(dá)基因數(shù)目較多且表達(dá)量變化明顯，這可能也與狗牙根對(duì)水淹脅迫的多種適應(yīng)性機(jī)制有關(guān)。NAC、MADS和TCP等家族的轉(zhuǎn)錄TF主要與非生物脅迫中植物的通氣組織形成和不定根發(fā)育等形態(tài)學(xué)改變有關(guān)，這種形態(tài)學(xué)改變可增加水淹等脅迫中細(xì)胞的獲氧能力[18-20]。上述9個(gè)TF家族富集顯著，顯示這些TF可能參與水淹生境下狗牙根的通氣組織形成及不定根的發(fā)育等形態(tài)學(xué)改變。

植物通過(guò)形態(tài)學(xué)及生理代謝等改變對(duì)水淹脅迫作出響應(yīng)，該過(guò)程由多個(gè)基因組成，其調(diào)控與多個(gè)TF的家族成員有關(guān)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析研究了狗牙根對(duì)水淹脅迫的TF響應(yīng)，為進(jìn)一步了解狗牙根對(duì)水淹的適應(yīng)性機(jī)制提供基礎(chǔ)，也為植物的耐水淹研究提供基因資源。

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