朱克誠，劉寶鎖，曹 明，郭華陽，張 楠，張殿昌,2

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510300；2.廣東省海洋生物種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510300；3.廣東省漁業(yè)種質(zhì)保護(hù)中心，廣州 511453)

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子(Myocyte enhancer factor-2，MEF2)屬于MADS(Agamous deficiens serum response factor，MADS)轉(zhuǎn)錄因子家族，是一種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子。在果蠅及線蟲體內(nèi)以單基因形式存在，但是在脊椎動(dòng)物中存在四個(gè)家族成員，分別為MEF2A，MEF2B，MEF2C和MEF2D[1]。這四個(gè)家族成員能夠通過啟動(dòng)子的選擇和對mRNA前體的選擇性拼接產(chǎn)生不同種類的增強(qiáng)因子蛋白[2]。四種MEF2主要參與肌肉發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)作用，其中MEF2C能調(diào)控肌小節(jié)的完整性和胚胎后期骨骼肌的正常發(fā)育[3]。在小鼠MEF2C基因敲除實(shí)驗(yàn)中，會(huì)導(dǎo)致肌小節(jié)溶解[3]或心血管異常發(fā)育到胚胎期9.5天時(shí)死亡[4]。在胚胎發(fā)育時(shí)期，為了調(diào)節(jié)組織特異性基因的表達(dá)，MEF2C能被很多類型的細(xì)胞激活進(jìn)而調(diào)節(jié)肌肉組織的功能，諸如：心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、線粒體細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞[4]。

MEF2C基因最初在人胎兒大腦中發(fā)現(xiàn)[5]，隨后在骨骼肌和心肌也陸續(xù)被報(bào)道[6]。盡管MEF2C基因mRNA在組織中廣泛表達(dá)，但激活的MEF2C主要分布于心肌、腦、骨骼肌和淋巴細(xì)胞組織等。以往該基因的研究主要集中在脊椎動(dòng)物不同組織中的表達(dá)分析[7-10]，很少涉及到無脊椎動(dòng)物中的功能研究。在無脊椎動(dòng)物中，僅僅克隆了長牡蠣(Crassostreagigas)、溫室希蛛(Parasteatodatepidariorum)和美洲鱟(Limuluspolyphemus)等的MEF2C基因，但是沒有組織表達(dá)譜的相關(guān)報(bào)道。目前還未見到華貴櫛孔扇貝MEF2C基因的相關(guān)研究報(bào)道。

華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)隸屬軟體動(dòng)物門瓣鰓綱珍珠目扇貝科，廣泛分布于中國南海、日本、越南以及印度尼西亞等沿海地區(qū)。華貴櫛孔扇貝為暖水性附著型貝類，養(yǎng)殖周期較短、死亡率低、肉質(zhì)鮮美，是一種重要水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類[11]。目前對于華貴櫛孔扇貝的研究多集中在人工育苗、分子輔助育種、殼色和閉殼肌顏色、溫度和鹽度對其酶活和幼貝存活的影響等方面[12-14]。此外，在一些雙殼類物種中，其生長能受到養(yǎng)殖環(huán)境中鹽度的影響[15-16]?？梢婝}度能影響肌肉的生長，間接影響MEF2C基因的表達(dá)水平，而華貴櫛孔扇貝MEF2C基因功能研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)克隆了MEF2C和MEF2C-like基因序列，分析了其時(shí)空表達(dá)和親緣關(guān)系，初步了解以上基因在不同鹽度下的表達(dá)量特征，其結(jié)果可為探索最佳的鹽度生長提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

華貴櫛孔扇貝胚胎和幼貝取自海南三亞某養(yǎng)殖場，全部暫養(yǎng)于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所海南熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心實(shí)驗(yàn)基地，隨機(jī)挑選一定數(shù)量的健康且閉殼肌活力旺盛的個(gè)體[體質(zhì)量(25.11±2.85)g；殼長(5.51±0.15)cm；殼寬(5.12±0.12 cm)]，清洗貝殼表面的污物，早晚各投喂1次亞心型扁藻(Platymonassubcordiformis)，日換水50%。放養(yǎng)在300 L的水泥池內(nèi)，循環(huán)水養(yǎng)殖，溫度為(22±0.5)℃，暫養(yǎng)2周后用于試驗(yàn)。隨機(jī)抽取5個(gè)健康的華貴櫛孔扇貝，冰浴麻醉后取外套膜、腹足、消化腺、鰓、心臟、閉殼肌、性腺，立即放入液氮中速凍，然后放置于-80 ℃冰箱中備用。

針對華貴櫛孔扇貝不同發(fā)育階段(受精卵、囊胚期、原腸胚期、擔(dān)輪幼蟲期和D-型幼蟲期)取樣，每個(gè)時(shí)期至少取20個(gè)個(gè)體；針對華貴櫛孔扇貝不同生長階段(30 phd、40 phd、60 phd、120 phd和180 phd)的閉殼肌取樣，每個(gè)時(shí)期至少取5個(gè)個(gè)體，立即放入液氮中速凍，然后放置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

選擇上述暫養(yǎng)后健康的華貴櫛孔扇貝，隨機(jī)挑選270個(gè)分別放在9個(gè)水泥池中，每池30個(gè)。三個(gè)組設(shè)定的鹽度分別為22 、28 和 34 。試驗(yàn)為期一周，試驗(yàn)結(jié)束后將貝冰浴麻醉后取閉殼肌，立即放入液氮中速凍，然后放置于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄

根據(jù)TRIzol說明書提取華貴櫛孔扇貝外套膜、腹足、消化腺、鰓、心臟、閉殼肌、性腺等組織RNA。RNA的質(zhì)量和總量用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)(ThermoScientific，美國)檢測，并測定RNA的OD值。取2 μg RNA合成 cDNA(用Takara試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。

1.4 MEF2C和MEF2C-like基因克隆

在該實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)中，得到了華貴櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組序列的注釋結(jié)果(未發(fā)表)，從中獲得華貴櫛孔扇貝MEF2C和MEF2C-like基因預(yù)測的序列。針對該序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)引物來分別驗(yàn)證上述基因的ORF序列(表1)。PCR擴(kuò)增總體系為25 μL，其中去離子水18.2 μL，10×Ex buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物各0.5 μL，cDNA模板為1 μL，ExTaq酶為0.3 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性 1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收PCR產(chǎn)物，然后將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體(TaKaRa公司)16 ℃連接過夜，接著轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)中，進(jìn)行陽性克隆篩選并測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

用BLAST program(http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)來搜索氨基酸和核苷酸序列的同源序列；利用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/projects/gorf/)來預(yù)測MEF2C和MEF2C-like基因的ORF；使用ExPASy程序(http://prosite.expasy.org/)和SignaIP 4.1 Server對MEF2C和MEF2C-like氨基酸等電點(diǎn)、分子質(zhì)量和信號(hào)肽等功能基序進(jìn)行預(yù)測；通過使用Clustalw2程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進(jìn)行多重序列比對，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，對MEF2C和MEF2C-like與其他物種的同源性和親緣關(guān)系進(jìn)行比對分析[17]。

1.6 MEF2C和MEF2C-like 基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)用于分析MEF2C和MEF2C-like基因在不同組織和不同時(shí)期的mRNA表達(dá)量。針對MEF2C和MEF2C-like基因的ORF序列，跨內(nèi)含子區(qū)域來設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)。內(nèi)參引物β-actin-F/R參照Lu等[18]，qRT-PCR的程序參照Zhu等[19]。此外，該研究中使用2-ΔΔCT法來分析基因的相對表達(dá)量[20]。MEF2C和MEF2C-like基因的表達(dá)量用平均值±方差來表示(mean ± SE)。用SPSS statistics 18.0 進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性用P<0.05來表示。

2 結(jié)果

2.1 華貴櫛孔扇貝MEF2C和MEF2C-like基因克隆和序列分析

MEF2C和MEF2C-like基因序列已驗(yàn)證。華貴櫛孔扇貝MEF2C基因的cDNA全長為1 506 bp(GenBank no.MF614124)，開放閱讀框?yàn)? 302 bp，編碼433個(gè)氨基酸。預(yù)測的MEF2C蛋白的相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為47×103和8.83，其疏水性平均值(Ggrand average of hydropathicity，GRAVY)為 -0.908。MEF2C信號(hào)肽(SignalP)預(yù)測結(jié)果表明沒有信號(hào)肽存在于推測的氨基酸序列中。此外，MEF2C-like基因ORF全長為1 158 bp(GenBank no.MF614125)，編碼385個(gè)氨基酸。預(yù)測的MEF2C-like蛋白的相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為41×103和8.58，其疏水性平均值(Ggrand average of hydropathicity，GRAVY)為 -0.541。同樣地，MEF2C-like信號(hào)肽(SignalP)預(yù)測結(jié)果表明也沒有信號(hào)肽存在于推測的氨基酸序列中。如MEF2家族中的其他成員，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明兩種MEF2Cs都含有保守的MADS-Box(氨基酸 1-58)和鄰近保守的MEF2結(jié)構(gòu)域(氨基酸59-86)(圖1)。此外，在MEF2C和MEF2C-like中，N-末端較C-末端高度保守。

表1 實(shí)驗(yàn)中所需引物序列Tab.1 Primers used for cloning and expression

圖1 華貴櫛孔扇貝MEF2C(MF614124)和MEF2C-like(MF614124)的氨基酸序列與其它物種MEF2C 和 MEF2C-like的氨基酸多重序列比對Fig.1 Comparison of deduced amino acid sequences of C.nobilis of MEF2C (MF614124)and MEF2C-like (MF614124)with published MEF2C-like MADS 和 MEF2結(jié)構(gòu)域分別標(biāo)記的是紅色和藍(lán)色。表2列出了所有物種的Genebank序列號(hào)。

2.2 進(jìn)化分析

為了探究MEF2C基因的同源性和進(jìn)化特征，搜索的MEF2C直系同源基因數(shù)據(jù)后用MEGA6.0進(jìn)行比對?；卩徫幌噙B法(Neighbor-Joining，NJ)分析結(jié)果表明華貴櫛孔扇貝和長牡蠣親緣關(guān)系最近，其次是蝦夷扇貝等軟體動(dòng)物(圖2)。此外，結(jié)果也顯示了軟體動(dòng)物MEF2C與節(jié)肢動(dòng)物(溫室希蛛和美洲鱟)MEF2C聚為一支，然后無脊椎動(dòng)物(軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物)再與脊椎動(dòng)物聚在一起。這些結(jié)果符合傳統(tǒng)的分類學(xué)。

經(jīng)過Blast對比分析發(fā)現(xiàn)，華貴櫛孔扇貝MEF2C氨基酸序列與長牡蠣、蝦夷扇貝MEF2C氨基酸序列同源性最高，分別為67%和58%；與安水金線鲃MEF2C-like-1和MEF2C-like-2的同源性最低，分別為34%和33%(表2)。

2.3 MEF2C和MEF2C-like基因時(shí)空表達(dá)分析

MEF2C和MEF2C-like基因在胚胎和幼體不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)量類似，隨著發(fā)育時(shí)期的推移，表達(dá)量顯著增加，在D型幼蟲期達(dá)到最高值(圖3A)，隨后表達(dá)量都下降。另外，在不同組織中的表達(dá)量分析結(jié)果表明MEF2C和MEF2C-like基因也具有相似的表達(dá)趨勢，在所有組織中都有表達(dá)，其中在閉殼肌中的表達(dá)量顯著高于其他組織(圖 3B)，外套膜和消化腺次之，腹足和雄性腺中表達(dá)量最低。

圖2 用MEGA6.0 鄰位相連法構(gòu)建的MEF2C氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees of C.nobilis MEF2C relative to the homologues of other species from the amino acid datasets using the MEGA 6.0 software with Neighbor-Joining (NJ)method

表2 預(yù)測的華貴櫛孔扇貝MEF2C氨基酸序列與其他物種MEF2C氨基酸序列的比較Tab.2 Comparison of deduced amino acid region of C.nobilis MEF2C with MEF2C of other species

在華貴櫛孔扇貝閉殼肌不同生長時(shí)期中，MEF2C和MEF2C-like基因的表達(dá)量顯著上升至孵化后60和120 d達(dá)到最大，隨后孵化后180 d顯著下降(圖4)。在不同鹽度養(yǎng)殖的試驗(yàn)中，MEF2C和MEF2C-like基因的表達(dá)量在鹽度為28下顯著高于其他兩個(gè)鹽度組，其中在28 下，MEF2C的mRNA水平分別是22 和34的4.24倍和1.80倍，MEF2C-like的mRNA水平分別是22和34的6.14倍和1.60倍(圖5)。

3 討論

MEF2C是MEF2基因家族成員之一，參與調(diào)控細(xì)胞増殖和肌肉分化的重要調(diào)節(jié)因子，在脊椎動(dòng)物的功能較為清晰，但是在貝類等有殼的水生動(dòng)物中的功能還沒有完全被闡明。華貴櫛孔扇貝MEF2C含有1 302 bp核苷酸，編碼433個(gè)氨基酸；MEF2C-like含有1 074 bp ORF，編碼358個(gè)氨基酸；這兩個(gè)基因的氨基酸同源相似性高達(dá)68%。序列比對分析表明華貴櫛孔扇貝MEF2C和MEF2C-like含有高度保守的MADS和MEF2結(jié)構(gòu)域，這與鴨和哺乳動(dòng)物在N-末端的結(jié)構(gòu)類似[21]。這兩個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域結(jié)合在DNA共有序列CTA(A/T)4TAG上，才能有效地進(jìn)行聚合作用[22]。華貴櫛孔扇貝MEF2C和MEF2C-like包含有脊椎動(dòng)物典型的HJURP-C結(jié)構(gòu)域，可能是由于MEF2C在進(jìn)化過程中脊椎動(dòng)物為了適應(yīng)新環(huán)境而演變出不同的功能。華貴櫛孔扇貝MEF2C氨基酸與其他物種MEF2C氨基酸的同源性范圍為33%～68%，其中與軟體動(dòng)物親緣關(guān)系最近，范圍為58%～68%，這與其他基因在無脊椎動(dòng)物中序列差異性較大觀點(diǎn)一致。與其他后生動(dòng)物的氨基酸序列比對分析結(jié)果說明華貴櫛孔扇貝MEF2Cs與長牡蠣的親緣關(guān)系最近，這可能是因?yàn)槿A貴櫛孔扇貝和長牡蠣都屬于扇貝科。然而脊椎動(dòng)物和軟體動(dòng)物的氨基酸序列差異較大(圖2， 表 2)，這也基本符合傳統(tǒng)生物學(xué)分類的結(jié)果。

圖3 MEF2C 和 MEF2C-like在華貴櫛孔扇貝不同發(fā)育時(shí)期(A)和不同組織(B)中的表達(dá)量Fig.3 Expression patterns of MEF2C and MEF2C-like at different development stages (A)and tissues (B)of C.nobilis P<0.01表示具有顯著差異性。圖4,5同。

圖4 MEF2C 和 MEF2C-like在華貴櫛孔扇貝不同閉殼肌生長時(shí)期的表達(dá)量Fig.4 Expression level of MEF2C and MEF2C-like at different muscle development stages of C.nobilis

MEF2C廣泛表達(dá)于體內(nèi)的各種細(xì)胞中，尤其是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、線粒體細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育的核心元件[23]。MEF2C基因的研究主要集中在脊椎動(dòng)物中，只有少量的研究在軟體動(dòng)物中，尤其是扇貝科。該研究結(jié)果表明隨著發(fā)育時(shí)期的推移，MEF2C表達(dá)量逐漸升高，在D型幼蟲期達(dá)到最高，隨后表達(dá)量顯著下降。這可能是在D型幼蟲期閉殼肌前體開始萌芽形成。此外，組織特異性表達(dá)譜揭示了兩種MEF2Cs在各個(gè)組織中都廣泛表達(dá)，其中顯著表達(dá)于閉殼肌組織中，這與山羊的研究結(jié)果類似[24]。在胚胎形成時(shí)期，MEF2C基因涉及到建立肌源性的細(xì)胞系[3]。Chen等[24]人的研究表明山羊MEF2C的mRNA表達(dá)量在出生后3 d時(shí)達(dá)到最高水平，隨后下降，到30～120 d又是一個(gè)高峰值。在該研究中，MEF2C和MEF2C-like基因的表達(dá)量在60～120 d時(shí)達(dá)到最高峰，可能是因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期是閉殼肌的一個(gè)快速生長時(shí)期，而肌肉發(fā)育調(diào)節(jié)重要的因子MEF2Cs表達(dá)量處于一個(gè)高峰期。

圖5 在不同鹽度下，MEF2C 和 MEF2C-like在華貴櫛孔扇貝閉殼肌中的表達(dá)量Fig.5 Expression patterns of MEF2C and MEF2C-like at different salinity groups of C.nobilis

在養(yǎng)殖過程中影響雙殼類閉殼肌質(zhì)量的因素很多，尤其是鹽度。先前的研究表明最佳的組合是溫度為25.7 ℃/29 ℃，可以使孵化率高達(dá)72.42%[25]。在對華貴櫛孔扇貝幼蟲存活影響實(shí)驗(yàn)中，鹽度為28.03 ，20日齡存活率為48.25%[26]。劉志剛等[27]在針對華貴櫛孔扇貝幼貝生長的研究中表明最適生長鹽度為21.9～34.0 之間。翡翠貽貝稚貝階段，鹽度為20～25時(shí)生長速度最快[16]。然而，MEF2C涉及到肌肉發(fā)育的正調(diào)控。在該研究中，MEF2C和MEF2C-like基因的mRNA表達(dá)量在鹽度為28中顯著高于其他鹽度組，說明在此鹽度是華貴櫛孔扇貝生長的最適鹽度，這與之前的研究結(jié)果類似[16，25，27]?？梢姡瑸榱藵M足華貴櫛孔扇貝快速生長的需求，28鹽度是最佳的生長條件。

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