賴燈妮，覃 思，趙玲艷，鄧放明*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

Nrf2（NF-E2-related factor2）是調(diào)控細(xì)胞抵抗外來異物和氧化損傷、維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2的缺失或激活障礙導(dǎo)致氧化應(yīng)激源的細(xì)胞毒性增強(qiáng)，引起細(xì)胞功能障礙、凋亡甚至死亡，從而與許多疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系[1-3]。因此，激活Nrf2信號(hào)通路有利于人體健康和疾病的預(yù)防。但是隨著研究的深入，有研究者發(fā)現(xiàn)Nrf2的激活可能阻礙癌癥的治療，如在某些癌癥的化療和放療中，Nrf2的激活增強(qiáng)了癌細(xì)胞的抗藥性[4-7]，所以如何在癌細(xì)胞中抑制Nrf2的活性也是目前的研究熱點(diǎn)之一。

果蔬中含有豐富的多酚化合物，其酚羥基中鄰位酚羥基極易被氧化，且有較強(qiáng)捕捉活性氧等自由基的能力，因此能夠清除自由基和淬滅活性氧[8]。目前有近1 000 種果蔬多酚化合物被證明利于人體健康和預(yù)防疾病（如癌癥、糖尿病、神經(jīng)性疾病等）[9]。果蔬多酚化合物能顯著調(diào)控Nrf2/Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）信號(hào)通路，然而其作用的分子機(jī)制尚未闡明。本文系統(tǒng)介紹了Nrf2/Keap1信號(hào)通路及其調(diào)節(jié)方式，討論了Nrf2化學(xué)預(yù)防腫瘤和促進(jìn)癌癥發(fā)生的雙重作用，詳細(xì)總結(jié)和分析了關(guān)于果蔬中多酚類物質(zhì)對(duì)Nrf2/Keap1的激活或抑制作用的研究進(jìn)展和基本規(guī)律。

1 Nrf2信號(hào)通路及其調(diào)節(jié)

1.1 Nrf2/Keap1信號(hào)通路及其調(diào)節(jié)

Nrf2是細(xì)胞調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，屬于CNC（cap’-n’-collar）轉(zhuǎn)錄因子家族成員[10]。Nrf2含有7 個(gè)不同的功能區(qū)（圖1），分別命名為Neh1到Neh7（Nrf2-ECH homology）。Neh1區(qū)中CNC-bZIP（leucime zipper bZIP）亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，bZIP與Maf蛋白（包括MafG、MafK、MafF）形成異二聚體。此二聚體是Nrf2識(shí)別抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）上DNA基序（GCTGAGTCA）并與之結(jié)合、啟動(dòng)下游抗氧化基因轉(zhuǎn)錄的重要物質(zhì)。Neh2區(qū)上的DLG和ETGE基序是Nrf2與胞漿蛋白Keap1結(jié)合區(qū)，DLG和ETGE缺失或突變影響Nrf2與Keap1結(jié)合，負(fù)調(diào)控Nrf2信號(hào)通路。在Neh1與Neh2之間，存在Neh4、Neh5、Neh7和Neh6，Neh3在靠近Neh1的末端且結(jié)構(gòu)復(fù)雜。Neh4和Neh5與共激活因子CREB結(jié)合蛋白（cyclic AMP-response elememt binding protein (CREB) binding protein，CBP），促使CBP協(xié)同參與激活Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性并增強(qiáng)下游抗氧化基因的表達(dá)。Neh6存在著綁定F-box蛋白家族β-TrCP（β-transducing repeats-containing proteins）的區(qū)域和DSGIS目的區(qū)域，合成糖原酶激酶（glycogen synthase kinase 3，GSK3）β和磷酸化Nrf2上的兩個(gè)位點(diǎn)，Ser335和Ser338，形成與β-TrCP連接泛素酶的結(jié)構(gòu)，獨(dú)立于Keap1起負(fù)調(diào)控作用。Neh7存在著一個(gè)視黃受體（retinoic X receptor α，RXRα）的一個(gè)綁定區(qū)域，與RXRα相互作用[11]。

目前認(rèn)為Nrf2/Keap1信號(hào)通路由3 個(gè)部分組成：Keap1、Nrf2、ARE[12-16]。Keap1是Keap1-Cullin 3（Cul3）-Ring box1（Rbx1）E3泛素連接酶的底層調(diào)節(jié)蛋白，與Nrf2結(jié)合并且抑制其活性。ARE是機(jī)體內(nèi)重要的保護(hù)性順式應(yīng)答元件，其核心序列是5’-TA/CANNA/GTGAC/TNNNGCAG-3’，存在于大部分細(xì)胞保護(hù)基因的近端啟動(dòng)子區(qū)域，是抗氧化蛋白和Ⅱ相脫毒酶基因上游的一段轉(zhuǎn)錄調(diào)控片段[17]。

圖1 Nrf2結(jié)構(gòu)功能示意圖Fig.1 Functional structure of Nrf2

在一般正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中Nrf2中Neh2片段上的ETGE和DLG位點(diǎn)與Keap1結(jié)合。Keap1和Cul-Rbx-E3泛素連接酶偶聯(lián)Neh2賴氨酸殘基從而使Nrf2被泛素化標(biāo)記，最后被引導(dǎo)進(jìn)入蛋白酶體進(jìn)行降解。因此，正常情況下細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白含量較低[12,18]。在氧化應(yīng)激和親電反應(yīng)中，Keap1中半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)改變從而不能與Neh2偶聯(lián)，因此不能泛素化降解掉Nrf2。這樣會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中Nrf2大量積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，然后在分子伴侶Maf的協(xié)助下與ARE結(jié)合形成二聚體，啟動(dòng)Ⅱ相脫毒酶和抗氧化蛋白相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白的合成，從而提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力[19]。當(dāng)半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)恢復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，Keap1又能與Nrf2形成泛素化體系，從而酶解掉Nrf2以恢復(fù)其正常水平[20-21]。

目前調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1信號(hào)通路主要有兩種假說：鉸鏈和門閂模式和Cul3-Keap1解偶聯(lián)模式（圖2）。

圖2 Nrf2/Keap1信號(hào)調(diào)節(jié)模型Fig.2 Regulatory model of Nrf2/Keap1 signaling pathway

1.1.1 鉸鏈和門閂模式

在鉸鏈和門閂模式中，Keap1連接Nrf2中高親和性ETGE位點(diǎn)形成二聚體，稱為“打開”結(jié)構(gòu)。隨后Keap1與Nrf2中DLG位點(diǎn)結(jié)合形成“關(guān)閉”結(jié)構(gòu)。在生理狀態(tài)下，Nrf2/Keap1關(guān)閉結(jié)構(gòu)使得Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中被泛素化標(biāo)記從而被蛋白酶降解，解鏈的Keap1則進(jìn)入下一個(gè)與Nrf2結(jié)合的循環(huán)。但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧自由基和電子修飾Keap1中IVR區(qū)半胱氨酸殘基結(jié)合從而使其結(jié)構(gòu)變化。雖然結(jié)構(gòu)變化的Keap1依舊能連接Nrf2的ETGE和DLG位點(diǎn)，但是與E2泛素結(jié)合酶卻不能在一條直線上連接，因此Nrf2不被降解并得到積累[22-24]。

1.1.2 Cul3-Keap1解偶聯(lián)模式

Cul3-Keap1解偶聯(lián)模式中，一些誘導(dǎo)劑（如叔丁基對(duì)苯二酚或二十五烯酸影響Cul3和Keap1結(jié)合。Keap1中BTB區(qū)的C151是這個(gè)模式中的關(guān)鍵位點(diǎn)，它結(jié)構(gòu)的改變使Cul3不能與之偶聯(lián)從而Nrf2不被泛素化。在兩種模式中Nrf2是否泛素化是其積累和核轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵[25-27]。

1.2 獨(dú)立于Keap1的Nrf2調(diào)節(jié)通路

雖然Keap1是調(diào)節(jié)Nrf2-ARE通路的重要因素，但其他因素也影響Nrf2通路，主要包括蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子以及表觀遺傳調(diào)節(jié)。

1.2.1 蛋白激酶

蛋白激酶是依賴一類胞內(nèi)信使，且在蛋白質(zhì)磷酸化過程中起中介和放大作用并協(xié)助完成信號(hào)傳遞的酶。磷酸化是影響Nrf2信號(hào)通路的重要因素，其中主要的蛋白激酶包括PKC蛋白激酶C、PI3K磷脂酰肌醇激酶、MAPKs絲裂酶原激活蛋白酶（細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/p38）[28]。研究發(fā)現(xiàn)果蔬多酚化合物的木犀草素、花色苷、表兒茶素能夠磷酸化ERK；原花青素B2、表兒茶素能夠磷酸化p38；蘇木查爾醇能夠磷酸化JNK；阿魏酸、表兒茶素以及黑茶茶多酚能夠磷酸化PI3K通路并激活Nrf2通路。早期研究發(fā)現(xiàn)Nrf2中Ser40、Ser568位點(diǎn)磷酸化使Nrf2表達(dá)增強(qiáng)，但Ser215、Ser408、Ser577位點(diǎn)磷酸化卻抑制著Nrf2通路的激活[29-31]。PKC磷酸化Nrf2中Ser40位點(diǎn)，使Nrf2與Keap1分離，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)入胞核[32]。目前針對(duì)MAPKs調(diào)控Nrf2的研究結(jié)果充滿爭(zhēng)議，有研究結(jié)果表明MAPKs對(duì)Nrf2有正向調(diào)控作用，Nrf2誘導(dǎo)劑叔丁基對(duì)苯二酚和萊菔硫烷抑制MAPKs的ERK和p38活性，降低ARE相關(guān)基因的表達(dá)[33]。而有些報(bào)道則發(fā)現(xiàn)MAPKs對(duì)Nrf2有負(fù)向調(diào)控作用，在A549細(xì)胞中ERK抑制劑抑制Nrf2的Ser40磷酸化從而阻止其核轉(zhuǎn)錄，p38抑制劑SB203580促進(jìn)Nrf2與Keap1解偶聯(lián)從而使其泛素化，在HepG2細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)p38負(fù)調(diào)控Nrf2[34-36]。PI3K激酶控制Nrf2的激活，PI3K激酶的抑制劑阻止Nrf2的核轉(zhuǎn)移和氧化應(yīng)激蛋白的誘導(dǎo)[37]。從上述文獻(xiàn)可以看出：部分蛋白激酶的磷酸化是多酚調(diào)控Nrf2信號(hào)通路的前提和必要條件；其中，果蔬多酚化合物磷酸化PKC蛋白激酶從而激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，而磷酸化MAPKs激酶的果蔬多酚化合物對(duì)Nrf2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)目前尚未有一致的報(bào)道，磷酸化PI3K激酶的果蔬多酚則激活Nrf2信號(hào)通路。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子是指能夠結(jié)合在某基因上游特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能調(diào)控其基因的轉(zhuǎn)錄。這些轉(zhuǎn)錄因子一般由DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域（包括激活域或抑制域）、寡聚化位點(diǎn)以及核定位信號(hào)等4 個(gè)功能區(qū)域組成。轉(zhuǎn)錄因子功能差異主要由激活域和抑制域決定，其中包括激活因子和抑制因子[38]。

Nrf2的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，它們是獨(dú)立于Keap1調(diào)控Nrf2通路的因子。例如Maf蛋白通過改變Nrf2亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)以及同源延伸區(qū)從而影響其二聚化，敲掉Maf蛋白會(huì)影響Nrf2的激活以及抗氧化蛋白的誘導(dǎo)[39]。另外，核內(nèi)共同激活因子3（amplified in breast 1，AIB1）通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性影響Nrf2的激活[40]。其中Nrf2激活因子包括重組人Jun二聚化蛋白2（Jun dimerization protein 2，JDP2）、Jun、CBP、BRG1、p21[41-44]。而Nrf2抑制因子包括cFos、p53、p65、Fra1、Bach1、C/EBPα、ATF1、ATF3 ER、SFERRβ、PPAR-Y、RAR-α[45-48]。

1.2.3 表觀遺傳學(xué)調(diào)控

表觀遺傳學(xué)是在細(xì)胞核內(nèi)DNA序列沒有改變的情況下基因功能可逆的可遺傳改變[49]。正常細(xì)胞CpG島處于非甲基化或低甲基化。研究表明在人體和小鼠中Nrf2啟動(dòng)子上CpG甲基化抑制Nrf2的表達(dá)[50-51]。在BEAS-2B細(xì)胞中，Keap1啟動(dòng)子的CpG甲基化負(fù)調(diào)節(jié)Keap1的表達(dá)[52]。組蛋白乙酰化由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylases，HDACs）兩個(gè)家族的酶調(diào)控。HDACs對(duì)于Nrf2的調(diào)控首先發(fā)現(xiàn)于炎癥模型中。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）通過刺激HDACs降低組蛋白H3和H4的乙?；瘜?dǎo)致Nrf2通路失活，然而通過HDACs抑制劑此過程可逆[53]。在BEAS-2B細(xì)胞中或者在HDAC2敲除的細(xì)胞中，HDACs抑制劑可使得Nrf2通路失活，這說明HDACs調(diào)節(jié)Nrf2是一個(gè)復(fù)雜的過程[50]。

由于Nrf2在生理學(xué)上的重要作用，Nrf2的調(diào)控機(jī)制的研究已成為腫瘤學(xué)和藥物學(xué)研究的熱點(diǎn)。Nrf2不僅受Keap1調(diào)控，而且受獨(dú)立于Keap1的蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子以及表觀遺傳學(xué)等因素的調(diào)控。在某些情況下，Nrf2獨(dú)立于Keap1的調(diào)控機(jī)制在慢性疾病中起著至關(guān)重要的作用。因此，研究多重調(diào)控Nrf2的機(jī)制在治療慢性疾病中有著深遠(yuǎn)的意義。

2 Nrf2/Keap1信號(hào)通路的雙重功效：癌癥的化學(xué)預(yù)防和促進(jìn)作用

Nrf2對(duì)癌癥有化學(xué)預(yù)防和促進(jìn)癌癥進(jìn)程的雙重作用：一方面，Nrf2對(duì)健康機(jī)體癌變的化學(xué)預(yù)防有著至關(guān)重要的作用[54]；另一方面，Nrf2異常表達(dá)和持續(xù)性活躍能促進(jìn)癌變進(jìn)程，或者減弱針對(duì)癌癥的化療和放療效果[55]。因此尋求一種在正常機(jī)體激活Nrf2信號(hào)通路且在腫瘤中抑制Nrf2信號(hào)通路的多酚化合物是目前研究的熱點(diǎn)。

2.1 Nrf2/Keap1對(duì)癌癥的化學(xué)預(yù)防作用

目前認(rèn)為Nrf2/Keap1的激活是細(xì)胞抗氧化還原反應(yīng)和抑制腫瘤的關(guān)鍵步驟。在敲除基因Nrf2-/-小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，利用化學(xué)毒素刺激小鼠，發(fā)現(xiàn)肺部、肝臟和腎臟中出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷。乙酰氨基酚刺激Nrf2-/-小鼠從而引起急性肝臟毒性[56]；丁羥甲苯或氧過多誘導(dǎo)Nrf2-/-小鼠導(dǎo)致其肺部損害[57-58]。另外，Nrf2-/-小鼠更易得氧化相關(guān)的疾病和癌癥[59]。研究發(fā)現(xiàn)人體Nrf2的啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性使得Nrf2的表達(dá)下降，從而使肺癌患病幾率提高，具體地來說，Nrf2基因的上游啟動(dòng)子區(qū)域（rs6721961）的變異削弱了Nrf2與ARE結(jié)合力從而使得肺癌患病率顯著上升[60]。因此激活Nrf2被認(rèn)為是癌癥化學(xué)預(yù)防的有效途徑。大量的研究表明Nrf2-ARE的激活劑通過誘導(dǎo)Nrf2/Keap1的表達(dá)和提高抗氧化水平從而達(dá)到抵御相關(guān)疾病的目的[61-62]。

2.2 Nrf2/Keap1促進(jìn)癌癥的作用

2.2.1 Nrf2/Keap1促進(jìn)癌癥發(fā)展

以往對(duì)Nrf2/Keap1的研究都集中于它對(duì)細(xì)胞的抗氧化性和解毒功能，認(rèn)為其在癌癥預(yù)防中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而最新研究發(fā)現(xiàn)Nrf2持續(xù)異常激活將促進(jìn)癌癥發(fā)生同時(shí)阻礙癌癥治療，如化療和放療作用[63]。在肝、肺、乳腺、膀胱、卵巢、胰腺、子宮癌的研究中發(fā)現(xiàn)Nrf2的表達(dá)增強(qiáng)[64-66]。Nrf2/Keap1的激活受到不同因素影響，如磷脂酰肌醇激酶（PI3K/Akt）、抗細(xì)胞凋亡蛋白（B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2））、自噬通路、炎癥因子（核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB））以及致癌基因（kRas和bRaf）[64,67]。

Nrf2/Keap1上調(diào)節(jié)下游抗氧化、解毒酶的表達(dá)以及抑制細(xì)胞凋亡的功能對(duì)癌細(xì)胞起到保護(hù)和增殖作用[68]。如癌細(xì)胞中Nrf2通過PI3K/Akt通路、表皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和新陳代謝[69]。此外，Nrf2/Keap1直接誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL干擾癌細(xì)胞的凋亡[70]。肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Nrf2持續(xù)異常激活與腫瘤的新陳代謝密切相關(guān)[66]，然而敲除Nrf2的癌細(xì)胞能夠減緩細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及腫瘤的新陳代謝[67]。

2.2.2 Nrf2/Keap1抗化療和放療的作用

治療癌癥過程中，化療和放療起著非常重要的作用。在腫瘤細(xì)胞中Nrf2/Keap1的異常激活阻礙著化療和放療的作用[71]。RNA干擾技術(shù)使Nrf2表達(dá)沉默或者Keap1過量表達(dá)導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)藥物或者化療放療的敏感性[4]。目前研究者對(duì)腫瘤細(xì)胞Nrf2的異常激活從而阻礙化療和放療的現(xiàn)象提出了多種假設(shè)：1）Nrf2下游抗氧化蛋白和解毒酶如HO-1和GST阻礙細(xì)胞的死亡從而起到抗化療和放療的作用[72]；2）Nrf2誘導(dǎo)抗藥物蛋白（MRPs）削弱藥物對(duì)癌細(xì)胞的作用[73]；3）Nrf2與細(xì)胞凋亡之間的交互作用[32]；4）Nrf2誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的蛋白酶，從而達(dá)到保護(hù)癌細(xì)胞的目的[74]；5）一些抗癌藥物通過與Keap1的Cys151位點(diǎn)結(jié)合，激活Nrf2抑制某些蛋白酶從而達(dá)到抗化療的作用[75]。

目前Nrf2作為預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)治療癌癥是否有效的生物指標(biāo)，Nrf2/Keap1是否高水平表達(dá)已經(jīng)成為臨床治療中藥物有效與否的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)Nrf2的研究在臨床診斷和治療中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

3 果蔬中多酚化合物調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1通路

表1 果蔬中幾種典型多酚對(duì)Nrf2/Keap1通路的影響Table1 Regulatory effect of typical dietary polyphenols on Nrf2/Keap1 signaling

多酚化合物廣泛存在于水果、蔬菜等植物性食物中，具有抗炎癥、腫瘤、氧化以及治療心血管疾病和骨質(zhì)疏松等多種生物活性。多酚類植物化合物中能激活或者促進(jìn)Nrf2的表達(dá)的，稱為激活劑；而抑制或者削弱Nrf2的表達(dá)的稱為抑制劑[76]。但是隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)不同劑量的果蔬多酚在不同細(xì)胞或動(dòng)物模型中，調(diào)控Nrf2信號(hào)通路效果復(fù)雜多變。在體外實(shí)驗(yàn)中多酚化合物調(diào)控Nrf2信號(hào)通路的劑量效應(yīng)基本呈現(xiàn)倒U型曲線，即低劑量時(shí)多酚類化合物能夠激活Nrf2信號(hào)通路，當(dāng)劑量超過閾值則抑制Nrf2信號(hào)通路（表1）。

3.1 木犀草素

木犀草素是一種天然3,4,5,7-四羥基黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜和水果中，如芹菜、胡椒、青椒、蘋果皮和洋蔥的葉子等。在肺癌細(xì)胞A549中，木犀草素通過獨(dú)立于Keap1信號(hào)通路降低Nrf2的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)從而下調(diào)Nrf2-ARE信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)1 μmol/L的木犀草素刺激A549細(xì)胞30 min后Nrf2的mRNA水平降低了34%，且提高了A549對(duì)藥物的敏感性。然而利用RNA干擾技術(shù)使Nrf2基因在細(xì)胞中表達(dá)沉默后，木犀草素誘導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性消失[77]。在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW620中，木犀草素通過降低NQO1/HO-1/GSTα1/GSTα2的表達(dá)從而抑制Nrf2通路[78]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)通過木犀草素治療的小鼠的Nrf2蛋白含量降低，肝臟和腸的腫瘤變小[78]。這說明在肺癌細(xì)胞A549、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW620以及在小鼠模型中，木犀草素作為Nrf2的抑制劑通過使Nrf2表達(dá)下降從而達(dá)到提高抗癌藥物敏感性的作用。在神經(jīng)性細(xì)胞PC12中，木犀草素通過獨(dú)立于Keap1的磷酸化通路ERK增強(qiáng)Nrf2-ARE信號(hào)通路以及下游HO-1的mRNA的表達(dá)[79]。在肝癌細(xì)胞HepG2中，木犀草素通過獨(dú)立于Keap1的磷酸化通路PI3K增強(qiáng)Nrf2的表達(dá)[80]。用1.2 mg/（kg·d）木犀草素喂養(yǎng)氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的小鼠腸癌模型中發(fā)現(xiàn)Nrf2表達(dá)增加從而達(dá)到治療腫瘤的目的[81]。這說明木犀草素作為Nrf2的激活劑，促進(jìn)Nrf2在細(xì)胞中的表達(dá)。

在體外實(shí)驗(yàn)中，可以發(fā)現(xiàn)1～10 μmol/L的木犀草素刺激癌細(xì)胞A549、HCT116和SW620后，降低了細(xì)胞中Nrf2蛋白的表達(dá)[75,78]。但是1.56～6.25 μmol/L的木犀草素刺激癌細(xì)胞HepG2后，發(fā)現(xiàn)其Nrf2蛋白的表達(dá)增強(qiáng)了[80]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中：用40 mg/kg的木犀草素喂養(yǎng)小鼠，發(fā)現(xiàn)抑制了Nrf2蛋白的表達(dá)[78]；而用1.2 mg/kg的木犀草素喂養(yǎng)小鼠后，發(fā)現(xiàn)激活了Nrf2蛋白的表達(dá)[81]。但是0～20 μmol/L的木犀草素刺激正常細(xì)胞PC12，激活了Nrf2蛋白的表達(dá)[79]（表1）。從以上數(shù)據(jù)可以看出，高劑量的木犀草素在癌細(xì)胞和體外實(shí)驗(yàn)中都是Nrf2的抑制劑，而低劑量的木犀草素則是Nrf2的激活劑。然而，木犀草素在正常細(xì)胞中對(duì)Nrf2的影響則沒有以上規(guī)律。在腸道中木犀草素以糖苷或硫酸鹽形式被吸收，雖然木犀草素在血漿中的含量較低且持續(xù)時(shí)間較短，但依舊表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性。

3.2 芹黃素

芹黃素是一種天然的4,5,7-三羥基黃酮類化合物，廣泛存在于芹菜等果蔬中。大量文獻(xiàn)報(bào)道芹黃素的作用機(jī)理是通過PI3K/Akt通路抑制Nrf2[80-82]。芹黃素在肝癌細(xì)胞BEL-7402中通過負(fù)調(diào)控PI3K/Akt通路降低Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)從而提高其對(duì)抗腫瘤藥物敏感性[82]。芹黃素刺激胚胎成纖維細(xì)胞通過下調(diào)PI3K/PKC/p38/ERK通路使Nrf2以及下游蛋白HO-1表達(dá)下降[83]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過芹黃素治療肝癌小鼠發(fā)現(xiàn)其腫瘤變小[82]。研究發(fā)現(xiàn)芹黃素刺激肝癌細(xì)胞HepG2通過PI3K通路增強(qiáng)Nrf2蛋白表達(dá)[80]。芹黃素通過CpG去甲基化削弱DNA的甲基化和組蛋白脫乙?；?，從而激活皮膚表皮JB6P+細(xì)胞Nrf2的表達(dá)[84]。芹黃素刺激肝細(xì)胞通過增強(qiáng)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2與ARE的綁定與磷酸化ERK2從而提高GSH蛋白的表達(dá)[85]。

在體外實(shí)驗(yàn)中，10～20 μmol/L芹黃素刺激肝癌細(xì)胞BEL-7402發(fā)現(xiàn)抑制Nrf2表達(dá)[82]，但是1.56～6.25 μmol/L芹黃素刺激肝癌細(xì)胞H e p G 2激活N r f 2表達(dá)[80]。5～40 μmol/L芹黃素刺激胚胎成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn)抑制Nrf2信號(hào)通路[83]。0.00～6.25 μmol/L芹黃素刺激上皮細(xì)胞JB6P+、5～25 μmol/L芹黃素刺激肝細(xì)胞Hepatocyte發(fā)現(xiàn)都激活Nrf2的表達(dá)[84-85]（表1）。從以上數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)：無論是在癌細(xì)胞還是正常細(xì)胞中芹黃素激活Nrf2的劑量都低于抑制Nrf2的劑量；芹黃素作為Nrf2的激活劑，刺激癌細(xì)胞的劑量比正常細(xì)胞的低。

木犀草素和芹黃素是日常飲食中微量的小分子物質(zhì)。分子結(jié)構(gòu)上木犀草素比芹黃素多一個(gè)羥基，因此木犀草素的抗氧化能力較強(qiáng)。大鼠口服單一劑量菊花提取物（200 mg/kg），其中木犀草素和芹黃素含量分別為5.2%和7.6%。芹黃素和木犀草素吸收達(dá)到最高值分別為237.6、23.03 μg·h/mL且均小于4 h（芹黃素3.9 h，木犀草素1.1 h）。這兩種多酚類化合物72 h后在糞便和尿液中總回收率低于Ⅱ相代謝產(chǎn)物50%。芹黃素和木犀草素的分布體積、腎清除率以及消除半衰期分別為13.78 L/kg、0.856 9 L/（kg/h）、3.4 h和65.12 L/kg、8.473 L/（kg/h）、2.7 h，且在濃度1.56～6.25 μmol/L范圍內(nèi)，木犀草素顯示出更強(qiáng)激活Nrf2的能力[80]。

3.3 表兒茶素

表兒茶素主要存在于茶葉、蓮子皮、葡萄等果蔬中，主要通過抑制活性氧簇和丙二醛的產(chǎn)生和提高GSH-Px活性從而達(dá)到抗氧化和抗腫瘤的作用。高濃度的表兒茶素在肺癌細(xì)胞A549中通過抑制Nrf2-ARE的綁定和下游蛋白HO-1蛋白的表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[86]。從肉桂中提取的表兒茶素通過下調(diào)Nrf2調(diào)節(jié)酶從而抑制肺癌細(xì)胞A549中Nrf2的過量表達(dá)，且提高細(xì)胞對(duì)阿霉素和依托泊苷藥物的敏感性和細(xì)胞內(nèi)的藥物累積[87]。這些結(jié)果表明表兒茶素通過降低Nrf2的過量表達(dá)從而有效降低肺癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的耐藥性。目前發(fā)現(xiàn)抑制Nrf2的過量表達(dá)是協(xié)助治療肺癌的一種新方法。

通過表兒茶素誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)GST和NQO1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，這暗示著Nrf2表達(dá)上調(diào)[88]。在狗腎細(xì)胞MDCK中，表兒茶素通過誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核中Nrf2的表達(dá)增強(qiáng)使得抗氧化酶活性增加，利用干擾siRNA技術(shù)敲除基因Nrf2從而表兒茶素的作用消失[89]。在宮頸癌細(xì)胞HeLa中，表兒茶素增強(qiáng)Nrf2信號(hào)通路以及下游蛋白HO-1的表達(dá)以提高對(duì)藥物順鉑的敏感性[90]。表兒茶素刺激HUVEC增強(qiáng)Nrf2和HO-1的表達(dá)[91]。這些結(jié)果表明表兒茶素作為Nrf2的激活劑，可以起到抗氧化和輔助治療癌癥的作用。

在體外實(shí)驗(yàn)中，高劑量的表兒茶素（大于200 μmol/L）處理A549細(xì)胞，能夠抑制其Nrf2的表達(dá)[86]，而低劑量的表兒茶素處理細(xì)胞則能夠激活Nrf2的表達(dá)[87]。如表1所示，以25～50 μmol/L的表兒茶素刺激內(nèi)皮細(xì)胞，25 μmol/L表兒茶素刺激MDCK和宮頸癌細(xì)胞，以及50～200 μmol/L的表兒茶素刺激HUVEC，這些低劑量的表兒茶素均能激活細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)[88,90-91]。

3.4 花色苷

自然狀態(tài)下，花色素常與各種糖原結(jié)合形成糖苷的形式，稱為花色苷。目前已知近百種花色素，較為常見的花色素有6 種，即矢車菊素、飛燕草素、天竺葵素、牽牛色素、芍藥色素和錦葵色素。目前研究認(rèn)為花色苷作為Nrf2的激活劑，還沒有相關(guān)抑制Nrf2的活性的報(bào)道。紫色馬鈴薯中提取的花色苷誘導(dǎo)DMN處理的HepG2細(xì)胞，通過激活Nrf2途徑從而上調(diào)HO-1、GST和NAD(P)H表達(dá)[92]。Shih等[93]發(fā)現(xiàn)矢車菊素、飛燕草色素、錦葵色素不僅可以激活Nrf2作用于ARE，誘導(dǎo)Ⅱ相抗氧化蛋白谷胱甘肽還原酶、GSH-Px、NQO1等的表達(dá)，從而抑制半胱天冬酶-3的活性，而且能抑制LPS、IFN-γ誘導(dǎo)的NF-κB活化，通過作用于PI3K和MAPKs途徑，抑制前列腺素E2和一氧化氮的產(chǎn)生。花色苷在人體上皮細(xì)胞中通過ERK1/2通路激活Nrf2從而達(dá)到抗氧化作用[94]（表1）。

3.5 阿魏酸

阿魏酸含有不飽和雙鍵和羥基的酚酸結(jié)構(gòu)，是蘋果、咖啡等果蔬中主要的多酚化合物。它主要的功效為抗氧化和清除自由基、抑制血栓形成、抗血小板凝聚等。在巨噬細(xì)胞Raw264.7中，阿魏酸主要通過降低Nrf2的表達(dá)從而下調(diào)NF-κB的核轉(zhuǎn)錄，且通過IKK/NF-κB的信號(hào)通路達(dá)到抗炎癥的作用[95]。研究表明HUVEC中通過阿魏酸激活PI3K和ERK信號(hào)通路使得Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，且增強(qiáng)下游蛋白GSH和NAD(P)H表達(dá)[96]。在淋巴球細(xì)胞中阿魏酸顯著上調(diào)HO-1的mRNA以及蛋白水平，誘導(dǎo)Nrf2的核轉(zhuǎn)運(yùn)[97]。

0.2 ～5.0 μmol/L阿魏酸刺激HUVEC、0.001～0.100 μmol/L刺激淋巴細(xì)胞都是激活Nrf2的表達(dá)[96-97]，但是100 μmol/L阿魏酸刺激巨噬細(xì)胞則是抑制Nrf2的表達(dá)[95]（表1）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)體外實(shí)驗(yàn)低劑量的阿魏酸在正常的細(xì)胞中是Nrf2的激活劑，高劑量的阿魏酸則為其抑制劑。

目前發(fā)現(xiàn)果蔬中的多酚化合物大部分雙向調(diào)節(jié)Nrf2，在體外實(shí)驗(yàn)中，同種多酚化合物作為Nrf2抑制劑濃度普遍比激活劑濃度高。推測(cè)果蔬多酚化合物雙向調(diào)節(jié)Nrf2劑量呈倒U型曲線，即當(dāng)濃度低于閾值對(duì)于Nrf2起到激活作用，但超過閾值則起抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)攝入50 mg多酚化合物糖苷配基時(shí)，總代謝物在血漿中的濃度為0～4 μmol/L，尿排泄為攝入劑量的0.3%～43.0%，且不同的多酚化合物的代謝濃度不同：其中吸收最好的多酚是沒食子酸和異黃酮，其次是兒茶素、黃烷酮和槲皮素糖苷，但具有不同的動(dòng)力學(xué)；吸收最少的多酚是原花色素、沒食子?；膬翰杷睾突ㄇ嗨豙98]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中多酚類物質(zhì)被動(dòng)物或人體吸收后的血清濃度與大部分體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型起作用的濃度相差較大，這可能是目前制約多酚在人體臨床上應(yīng)用的最大原因。

4 結(jié) 語

果蔬多酚化合物不僅雙向調(diào)控Nrf2/Keap1信號(hào)通路，并且調(diào)控炎癥通路、細(xì)胞凋亡和自噬，Nrf2/Keap1和其他通路之間的交互作用的機(jī)制研究能夠給預(yù)防和治療慢性疾病帶來新方法。所以Nrf2/Keap1與炎癥通路、細(xì)胞凋亡和自噬之間的交互作用也是目前研究的熱點(diǎn)。NF-κB和Nrf2之間的相互作用影響細(xì)胞黏附分子和谷胱甘肽的體內(nèi)平衡[99]。NF-κB的異常激活與炎癥和疾病的產(chǎn)生有著密不可分的聯(lián)系[100]。Nrf2是重要的轉(zhuǎn)錄和免疫調(diào)節(jié)因子，它通常能抑制或者抵消NF-κB信號(hào)。例如敲除Nrf2的小鼠引起炎癥的幾率更大[101]。最新研究發(fā)現(xiàn)NF-κB能夠直接抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄水平，NF-κB與Nrf2位點(diǎn)存在CBP競(jìng)爭(zhēng)從而影響Nrf2信號(hào)通路的表達(dá)[102]。

一系列研究發(fā)現(xiàn)Nrf2通過誘導(dǎo)Ⅱ相酶表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與自噬。由于Keap1是Nrf2信號(hào)通路泛素化的必要元件，任何影響Keap1的因素都影響Nrf2-ARE通路。Keap1與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的PGAM5（phosphoglycerate mutase 5）、ProTα、FAC1（fetal Alz-50 clone1）、P62（SQSTM1）蛋白結(jié)合，勢(shì)必會(huì)引起Nrf2信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡之間的交互作用[103]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2阻礙LPS誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬[104]。

應(yīng)用Nrf2調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化平衡，已經(jīng)成為疾病預(yù)防以及靶位點(diǎn)治療的新策略。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Nrf2在癌癥治療上有雙重作用，Nrf2的抑制劑和激活劑在預(yù)防和治療癌癥上具有重要的意義。多酚化合物作為日常飲食果蔬中富含的成分，對(duì)于誘導(dǎo)抗氧化蛋白和Ⅱ相代謝酶的表達(dá)、減輕氧化應(yīng)激損傷起著積極有效的作用。大量的研究表明果蔬多酚化合物作用于Nrf2轉(zhuǎn)錄、翻譯、降解以及細(xì)胞核運(yùn)輸階段（圖3），但是其具體的分子機(jī)制以及劑量效應(yīng)仍需要更加深入的闡明。這對(duì)拓展果蔬多酚化合物最新的研究領(lǐng)域和范圍具有重要意義。

圖3 Nrf2轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)機(jī)理Fig.3 Mechanisms of Nrf2 transcription, translation and expression

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