(河北省滄州水文水資源勘測局,河北 滄州 061000)

葉綠素a含量是評價(jià)湖泊富營養(yǎng)化程度的重要參數(shù)之一。因此，探討其檢測分析方法的實(shí)用性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文對研磨法與反復(fù)凍融法測定大浪淀水庫中葉綠素a的含量進(jìn)行了比對分析，結(jié)果表明：反復(fù)凍融法是最佳的分析方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 水樣采集

水樣來自河北省滄州市大浪淀水庫。大浪淀水庫于1997年建成，是河北省第一座平原水庫，屬大(2)型，總投資2.8億元，蓄水面積16.738km2，設(shè)計(jì)總庫容1.003億m3，每年可向市區(qū)供水8121萬m3，是滄州市居民用水的主要水源地。

1.2 主要試劑

90%丙酮溶液、1%碳酸鎂懸濁液。

1.3 儀器和設(shè)備

可見分光光度計(jì)、低溫冰箱、離心機(jī)、抽濾裝置、研缽、微孔濾膜、培養(yǎng)皿、具塞玻璃離心管。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將一定量水樣用玻璃纖維膜過濾，收集藻類，分別使用研磨法和反復(fù)凍融法對藻類細(xì)胞進(jìn)行破碎，用90%的丙酮溶液提取葉綠素，根據(jù)葉綠素光譜特征依次測定750nm、664nm、 647nm、 630nm波長下的吸光度，計(jì)算葉綠素a的含量。

1.5 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

此次操作設(shè)計(jì)了兩組實(shí)驗(yàn)。一組實(shí)驗(yàn)是由同一檢測人員分析同一樣品的多個平行樣，且樣品的取樣體積均相等,檢驗(yàn)研磨法和反復(fù)凍融法的重現(xiàn)性，結(jié)果見表1。另一組實(shí)驗(yàn)是由不同的檢測人員用不同的提取方法測定葉綠素a，檢驗(yàn)不同檢測人員分析結(jié)果的精密度，結(jié)果見表2。

表1 研磨法和反復(fù)凍融法比對測定結(jié)果 單位：μg/L

2 實(shí)驗(yàn)分析與討論

2.1 兩種方法對比試驗(yàn)

兩種方法結(jié)果比對分析，表明兩種提取方法有顯著性差異，反復(fù)凍融法的方差明顯低于研磨法。由標(biāo)準(zhǔn)偏差可以看出，反復(fù)凍融法和研磨法的平行樣品之間差異顯著性不大，反復(fù)凍融法實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性高于研磨法，反復(fù)凍融法避免了研磨法因多次轉(zhuǎn)移樣品帶來的操作誤差。

表2 不同檢測人員研磨法和反復(fù)凍融法測定結(jié)果比對 單位：μg/L

由表2可以看出，研磨法測定樣品的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差相差較大，而反復(fù)凍融法測定樣品的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差相差不大。這說明對于不同的檢測人員利用研磨法測定樣品，測定結(jié)果差異較大；而不同的檢測人員利用反復(fù)凍融法測定樣品，測定結(jié)果無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)證明：采用反復(fù)凍融法，只要檢測人員按照實(shí)驗(yàn)要求去做，就不會因?yàn)闄z測人員不同而影響測定結(jié)果，而利用研磨法，檢測人員研磨時(shí)的力度、方法、轉(zhuǎn)移樣品是否完全都會影響測定結(jié)果。因此，反復(fù)凍融法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有因?yàn)闄z測人員的更換而出現(xiàn)大幅度的波動，精確度高。兩種方法結(jié)果比對分析，表明:兩種提取方法有顯著性差異，反復(fù)凍融法的方差明顯低于研磨法。由標(biāo)準(zhǔn)偏差可以看出，反復(fù)凍融法和研磨法的平行樣品之間差異顯著性不大，反復(fù)凍融法實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性高于研磨法，反復(fù)凍融法避免了研磨法因多次轉(zhuǎn)移樣品帶來的操作誤差。

2.2 破碎液的顯微觀察

葉綠素a含量的測定，關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于能否將葉綠素從細(xì)胞中有效提取出來，多次冷熱交替的反復(fù)凍融法，提高了細(xì)胞的破碎率。在觀察細(xì)胞破碎的實(shí)驗(yàn)中，為了便于觀察和計(jì)數(shù)，采用了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的柵藻，稀釋到一定濃度，進(jìn)行凍融和研磨，在顯微鏡下觀察破碎情況，計(jì)算破碎率，結(jié)果表明反復(fù)凍融法的破碎率在90%以上，而研磨法的破碎率僅為50%～60%。

3 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)過程中，使用的玻璃器皿和比色皿均應(yīng)清潔、干燥，但不要用酸浸泡和洗滌。分析時(shí)均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的A級玻璃量器，分析純試劑和純水。整個實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在暗處進(jìn)行，因?yàn)槿~綠素提取液對光非常敏感，極易發(fā)生光和作用。有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：樣品置于暗處，24h內(nèi)基本不分解，弱光條件下，1h內(nèi)基本不分解，光照條件下會很快分解，因此，提取后的樣品應(yīng)盡快測定，提取操作等應(yīng)在低溫、暗處進(jìn)行。

4 試驗(yàn)結(jié)果分析與討論

a.根據(jù)實(shí)驗(yàn)比對，反復(fù)凍融法的相對偏差遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于研磨法的相對偏差，說明反復(fù)凍融法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有出現(xiàn)大幅波動，精確度高，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)只要掌握好凍融的時(shí)間和室溫，細(xì)胞的破碎程度也不會因?yàn)闄z測人員的不同而有明顯變化。而研磨法的細(xì)胞破碎程度與檢測人員有很大關(guān)系，由于檢測人員研磨時(shí)的力度、方法均有差異，因而，使用研磨法，檢測人員不同，細(xì)胞的破碎程度會有明顯差異。同時(shí)隨著研磨時(shí)間延長，樣品暴露在自然陽光下的時(shí)間增加，葉綠素的破壞程度會有所加大。

b.反復(fù)凍融和研磨兩種方法在測定所需的時(shí)間上無明顯差異，但是反復(fù)凍融法減少了檢測人員接觸丙酮的時(shí)間和次數(shù)，保護(hù)了檢測人員的身體健康，同時(shí)反復(fù)凍融法所需要的儀器少，故適合大批量的樣品分析。

c.反復(fù)凍融法操作簡單，減少了樣品的轉(zhuǎn)移次數(shù)，降低了樣品的損失，同時(shí)提高了細(xì)胞的破碎率，避免了研磨不完全而帶來的人為誤差，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和精確性。

d.在處理大批量的樣品時(shí)，反復(fù)凍融法所需的實(shí)驗(yàn)器材遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于研磨法，大大提高了工作效率。

e.對葉綠素a測定值的評價(jià)。結(jié)果表明：用反復(fù)凍融法處理水樣具有安全、高效的特性,750nm 處吸光度值容易達(dá)到0.005。

5 結(jié) 語

反復(fù)凍融法所需儀器設(shè)備少，操作簡便，減少污染，準(zhǔn)確度高，適用于大批量樣品檢測，因此反復(fù)凍融法測定葉綠素a具有一定的實(shí)用價(jià)值。

[1] 趙辛.葉綠素a方法改進(jìn)的探討[J].福建分析測試,2007(16):31-32.

[2] 林少君.浮游植物中葉綠素a提取方法的比較與改進(jìn)[J].生態(tài)科學(xué),2005(1)：9-11.

[3] 韓桂春.淡水中葉綠素a測定方法的探討[J].中國環(huán)境監(jiān)測,2005(2)：55-57.