王麗亞，楊清銳(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤74000；山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院)

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種以慢性炎癥為主的全身性疾病，主要累及骶髂關(guān)節(jié)和脊柱中軸關(guān)節(jié)[1]。富含半胱氨酸酸性分泌蛋白(SPARC)是Termine等[2]在1981年于牛骨中初步鑒定的一種非膠原成分，是一種富含半胱氨酸的小分子糖蛋白，也被稱作骨連接蛋白、基底膜40蛋白(BM40)。SPARC作為一種可由許多細(xì)胞分泌的非結(jié)構(gòu)性細(xì)胞外間質(zhì)蛋白，與骨形成、傷口愈合、血管生成和胚胎發(fā)育等均存在密切關(guān)系[3]。SPARC可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分泌，影響樹突狀細(xì)胞遷移和T細(xì)胞啟動(dòng)抗原特異性免疫反應(yīng)，增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)活性，進(jìn)而抑制免疫炎癥反應(yīng)[4,5]。Sharma等[6]首先發(fā)現(xiàn)，SPRAC是引起脊柱關(guān)節(jié)病的固有免疫系統(tǒng)的組成部分。但目前尚缺乏SPARC與AS關(guān)系的相關(guān)研究。本研究觀察AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞、血清SPARC表達(dá)變化，并探討其在AS病情進(jìn)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年12月～2016年11月山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科收治的AS患者70例作為觀察組，男66例、女4例，年齡(33.36±9.39)歲，病程(8.23±6.57)年?；颊呔?984年修訂的紐約AS診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，排除其他自身免疫性疾病、肝臟和腎臟疾病、感染、惡性腫瘤和血管疾病等。選擇同期體檢健康志愿者70例作為對(duì)照組，男60例、女10例，年齡(31.01±8.27)歲。兩組性別構(gòu)成比、年齡具有可比性。本研究通過(guò)山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，受試者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離及SPARC mRNA表達(dá)檢測(cè) 收集兩組空腹肘靜脈血3 mL，采用Ficoll梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，從界面收集細(xì)胞，Hank液洗滌3次。加入細(xì)胞裂解液，采用TRIzol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，SPARC上游引物：5′-TCGCCTGAGGCTGTAACTGA-3′，下游引物：5′-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3′，引物長(zhǎng)度：406 bp；內(nèi)參β-actin 上游引物：5′-GGCTACAGCTTCAC-CACCAC-3′，下游引物：5′-AGGAAGGAAGGCTG-GAAGAG-3′，引物長(zhǎng)度：212 bp。采用Roche480實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，SYBR Green 10 μL，DEPC 7.2 μL，cDNA 2.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共39個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算SPARC mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 血清SPARC表達(dá)檢測(cè) 采用ELISA法。收集兩組空腹肘靜脈血3 mL于含有血清分離膠的無(wú)菌促凝試管中。靜置半小時(shí)后采用離心機(jī)1 000 r/min離心20 min，取上層血清，- 80 ℃冰箱保存。采用抗人SPARC ELISA試劑盒檢測(cè)血清SPARC蛋白表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.4 觀察組外周血單個(gè)核細(xì)胞、血清SPARC表達(dá)與病情相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析 記錄觀察組Bath強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)指數(shù)(BASDAI)，并檢測(cè)其血細(xì)胞沉降率(ESR)及CRP。BASDAI包括疲勞、脊柱痛、外周關(guān)節(jié)痛、局限性壓痛以及晨僵持續(xù)時(shí)間和程度共6個(gè)項(xiàng)目，每個(gè)項(xiàng)目10分，6個(gè)項(xiàng)目總分除以5即為BASDAI。抽取觀察組晨起空腹肘靜脈血，采用魏式法檢測(cè)ESR，免疫比濁法檢測(cè)CRP。采用Spearman相關(guān)分析法分析觀察組外周血單個(gè)核細(xì)胞、血清SPARC表達(dá)與BASDAI、ESR、CRP的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞、血清SPARC表達(dá)比較 觀察組外周血單個(gè)核細(xì)胞中SPARC mRNA相對(duì)表達(dá)量為22.706±2.704，對(duì)照組為24.035±2.590，兩組比較P<0.01。觀察組血清SPARC表達(dá)為(1 287.690±486.101)ng/dL，對(duì)照組為(1 490.530±503.459)ng/dL，兩組比較P<0.01。

2.2 觀察組外周血單個(gè)核細(xì)胞SPARC表達(dá)與BASDAI、ESR、CRP的關(guān)系 觀察組BASDAI為(4.76±1.48)分，ESR為(31.39±18.02)mm/h，CRP為(28.53±15.70)mg/L。觀察組外周血單個(gè)核細(xì)胞SPARC表達(dá)與BASDAI、ESR、CRP均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為- 0.372、- 0.362、- 0.399，P均<0.01)。

2.3 觀察組血清SPARC表達(dá)與BASDAI、ESR、CRP的關(guān)系 觀察組血清SPARC表達(dá)與BASDAI、ESR、CRP均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為- 0.285、- 0.332、- 0.560，P<0.05或<0.01)。

3 討論

SPARC是一種能結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)中糖和膠原等物質(zhì)的特殊型分泌性糖蛋白，其本身并不參與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組成，而是通過(guò)與細(xì)胞膜受體、蛋白酶和生長(zhǎng)因子等相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞形態(tài)和黏附性，從而發(fā)揮多種生物學(xué)活性[7，8，11]。目前發(fā)現(xiàn)，SPARC能夠抑制細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、抑制某些細(xì)胞因子生成；可參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、血管生成、傷口愈合、腫瘤遷移等生理病理過(guò)程，參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[3,6]。研究發(fā)現(xiàn)，SAPRC基因純合子突變與成骨不全癥密切相關(guān)，可導(dǎo)致人類發(fā)生嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松[12]；成骨障礙患者的成骨細(xì)胞中SPARC表達(dá)明顯減低[13]。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)，SPARC基因敲除小鼠較野生型小鼠骨密度明顯降低，并且小梁骨骨量丟失更快，說(shuō)明SPARC是影響骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞活性的重要因子。

研究證實(shí)，免疫炎癥性反應(yīng)在AS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。TNF-α是公認(rèn)的參與AS發(fā)病的促炎因子之一[15]，其不僅直接參與關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥反應(yīng)，也可促進(jìn)破骨細(xì)胞的溶骨作用，增加骨吸收，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生，造成關(guān)節(jié)破壞及關(guān)節(jié)強(qiáng)直[16]。研究表明，SPARC與TGF-β相互作用，可抑制TNF-α產(chǎn)生，進(jìn)而減輕體內(nèi)炎癥反應(yīng)并促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化[7]。本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血單個(gè)核細(xì)胞、血清SPARC表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，且均與疾病活動(dòng)指標(biāo)BASDAI、ESR及CRP呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示SPARC可抑制AS患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，在一定程度上與疾病活動(dòng)密切相關(guān)。許敬人等[16]發(fā)現(xiàn)，提高AS伴骨質(zhì)疏松患者血清SPARC水平有助于減輕其免疫炎癥反應(yīng)，同時(shí)可改善脊柱、關(guān)節(jié)活動(dòng)功能，增加骨生成，減少骨吸收，最終提高骨密度。

綜上所述，AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞、血清SPARC表達(dá)均降低，SPARC表達(dá)檢測(cè)有助于判斷患者病情活動(dòng)，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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