張媛，譚曉明，?；荻Y(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院 清遠市人民醫(yī)院，廣東清遠511518)

細(xì)胞縫隙連接(GJ)是相鄰細(xì)胞之間的特殊蛋白質(zhì)連接通道，介導(dǎo)細(xì)胞間的物質(zhì)交換和信號傳遞[1]。GJ由特殊的通道蛋白——連接蛋白(Cx)組成，由GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)在同步細(xì)胞活動、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等方面發(fā)揮重要作用[2]。骨細(xì)胞的GJ主要由Cx43組成[3]。研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松與Cx43有密切關(guān)系[4]；Cx43及其組成的GJ能夠促進成骨細(xì)胞的分化[5]。因此，GJ可能是藥物導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的相關(guān)靶點。環(huán)磷酰胺是臨床常用的氮芥類化療藥物，

廣泛應(yīng)用于各種實體瘤和免疫性疾病等。骨髓抑制及骨質(zhì)疏松是環(huán)磷酰胺在治療過程中導(dǎo)致的最主要的不良反應(yīng)，許多腫瘤患者在使用環(huán)磷酰胺化療后發(fā)生骨量丟失、骨密度下降，從而繼發(fā)骨質(zhì)疏松[6,7]。2017年1～5月，本研究觀察了環(huán)磷酰胺對小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1 GJ功能的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其是否與Cx43表達有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：小鼠MC3T3-E1細(xì)胞株購自美國ATCC細(xì)胞庫。主要試劑：環(huán)磷酰胺、抗Cx43、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購自美國Sigma公司，DMEM高糖、0.25%胰酶、FBS購自美國Gibco公司，Calcein acetoxymethyl ester(calcein-AM)購自美國Invitrogen公司，CCK-8試劑盒(WST-8)購自日本Dojindo公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器：倒置顯微鏡(CKX41)購自日本Olympus公司；熒光正置顯微鏡(DP73)購自日本Olympus公司；酶標(biāo)儀(SPECTROstar Nano)購自德國BMG Labtech公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS)，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞，以3 000個/孔的密度接種至96孔板，每孔100 μL。隨機分為觀察組和對照組，每組3個復(fù)孔。觀察組分別加入濃度為0.02、0.2、2 μg/mL的環(huán)磷酰胺0.1 μL，對照組加入等體積二甲基亞砜。

1.3 細(xì)胞相對存活率檢測 采用CCK-8法。參照1.2的方法進行分組處理，空白對照孔僅加入等量培養(yǎng)液。作用24 h后，更換培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。設(shè)對照組存活率為100%，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度(OD)值，計算細(xì)胞相對存活率。細(xì)胞相對存活率(%)=(觀察組OD450-空白對照孔OD450)/(對照組OD450-空白對照孔OD450)×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細(xì)胞GJ功能檢測 采用細(xì)胞接種熒光示蹤法。將熒光指示劑Calcein-AM與天然表達Cx43的MC3T3-E1細(xì)胞共同孵育，制得“供體細(xì)胞”。參照1.2的方法進行分組處理，至細(xì)胞達到生長融合狀態(tài)。將孵育綠色熒光染料的“供體細(xì)胞”以1∶50的密度接種到兩組細(xì)胞(即“受體細(xì)胞”)中。培養(yǎng)4 h，熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)一個供體細(xì)胞周圍含有綠色熒光受體細(xì)胞數(shù)，以此評價細(xì)胞GJ功能。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 Cx43蛋白表達檢測 采用Western blotting法。參照1.2的方法進行分組處理，作用4 h。細(xì)胞生長融合至90%時棄掉培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液，超聲破碎后離心提取總蛋白。取定量后的蛋白25 μg經(jīng)上樣緩沖液變性處理，SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)于PVDF膜上。5%牛奶室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃搖床過夜(Cx43稀釋倍數(shù)為1∶2 000，β-tublin稀釋倍數(shù)為1∶10 000)，加入二抗室溫孵育1 h。采用Bio Imaging system(Gene Genius)對膠片進行灰度掃描分析。Cx43蛋白相對表達量以Cx43蛋白與內(nèi)參β-tublin蛋白灰度值的比值表示。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞相對存活率比較 加入濃度為0.02、0.2、2 μg/mL環(huán)磷酰胺的觀察組細(xì)胞相對存活率分別為(100.5±5.5)%、(101.0±12.0)%、(97.5±8.5)%，對照組為100%；加入不同濃度環(huán)磷酰胺的觀察組與對照組比較P均>0.05，觀察組不同濃度間比較P均>0.05。

2.2 兩組細(xì)胞GJ功能比較 加入濃度為0.02、0.2、2 μg/mL環(huán)磷酰胺的觀察組一個供體細(xì)胞周圍含有綠色熒光受體細(xì)胞數(shù)分別為(5.2±0.11)、(4.7±0.19)、(3.9±0.34)個，對照組為(7.5±0.24)個；加入不同濃度環(huán)磷酰胺的觀察組與對照組比較P均<0.05，觀察組不同濃度間比較P均>0.05。

2.3 兩組Cx43表達比較 加入濃度為0.02、0.2、2 μg/mL環(huán)磷酰胺的觀察組Cx43相對表達量分別為0.82±0.05、0.86±0.09、0.82±0.06，對照組為0.90±0.06；加入不同濃度環(huán)磷酰胺的觀察組與對照組比較P均>0.05，觀察組不同濃度間比較P均>0.05。

3 討論

環(huán)磷酰胺是臨床常用的氮芥類化療藥物，廣泛應(yīng)用于各種實體瘤和免疫性疾病等的治療。骨髓抑制及骨質(zhì)疏松是環(huán)磷酰胺最主要的不良反應(yīng)，許多腫瘤患者在使用環(huán)磷酰胺化療后繼發(fā)骨質(zhì)疏松[6,7]。環(huán)磷酰胺可明顯抑制骨形成，導(dǎo)致骨量減少、骨顯微結(jié)構(gòu)退化等典型骨質(zhì)疏松癥表現(xiàn)，其發(fā)生機制還未闡明。目前認(rèn)為與以下因素有關(guān)：①核因子κB受體活化因子配體/骨保護素(RANKL/OPG)。RANKL/OPG在骨重塑過程中發(fā)揮重要作用，OPG由成骨細(xì)胞合成和分泌，可以抑制破骨細(xì)胞的分化并減弱骨吸收；RANKL/OPG與骨質(zhì)疏松的形成密切相關(guān)[8]；②DNA修復(fù)途徑。環(huán)磷酰胺代謝過程中產(chǎn)生的大量活性氧自由基造成DNA損傷，從而影響DNA修復(fù)途徑[9,10]。因此，細(xì)胞中RANKL/OPG信號和DNA修復(fù)途徑在環(huán)磷酰胺導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制中具有關(guān)鍵作用。

成骨細(xì)胞促進骨形成，破骨細(xì)胞促進骨吸收，二者之間的精細(xì)平衡在維持骨的代謝穩(wěn)態(tài)中具有至關(guān)重要的作用。GJ是相鄰細(xì)胞間形成的一種能夠開放和關(guān)閉的膜通道結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)細(xì)胞間直接的信號交流，某些信號分子可以通過GJ在細(xì)胞間進行傳遞。研究表明，成骨細(xì)胞富含Cx43組成的GJ[3]。Cx43在維持骨細(xì)胞功能方面發(fā)揮多個重要作用，包括促進成骨細(xì)胞的增殖、分化及骨愈合等[11]。研究證實，糖皮質(zhì)激素通過下調(diào)成骨細(xì)胞Cx43表達而誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松，甲狀旁腺素、雙磷酸鹽作用于成骨細(xì)胞后均可引起Cx43表達及其組成的GJ功能變化[12,13]。Cx43及其組成的GJ能夠促進成骨細(xì)胞的分化，影響破骨細(xì)胞融合及其功能，Cx43通過調(diào)控細(xì)胞間第二信使如磷酸激酶傳遞以及信號通路，進而調(diào)控成骨細(xì)胞生成和細(xì)胞存活[11,14]。成骨細(xì)胞間由Cx43組成的GJ能夠減輕氧化應(yīng)激對其產(chǎn)生的細(xì)胞損傷[15]，機械刺激骨細(xì)胞后，Cx43組成的半通道能夠調(diào)控NAD+、前列腺素E2和ATP的釋放，從而保護骨細(xì)胞[16～18]。雙磷酸鹽通過Cx43半通道進入破骨細(xì)胞，從而抑制破骨細(xì)胞形成[19]。因此，研究環(huán)磷酰胺對成骨細(xì)胞GJ的影響對闡明其導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的機制具有重要意義。

為了排除藥物的細(xì)胞毒性對GJ功能的影響，本研究首先采用CCK-8法觀察了不同濃度環(huán)磷酰胺對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，加入0.02、0.2、2 μg/mL環(huán)磷酰胺的觀察組細(xì)胞相對存活率與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，觀察組不同濃度間比較無統(tǒng)計學(xué)差異；說明環(huán)磷酰胺在0.02～2 μg/mL濃度范圍對MC3T3-E1細(xì)胞的毒性作用較小。Calcein-AM進入細(xì)胞后，其上所帶的乙酰甲酯被細(xì)胞內(nèi)脂酶水解而形成發(fā)綠色熒光的calcein，不能透過細(xì)胞膜，但能經(jīng)GJ傳遞至相鄰細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，加入濃度為0.02、0.2、2 μg/mL環(huán)磷酰胺的觀察組一個供體細(xì)胞周圍含有綠色熒光受體細(xì)胞數(shù)均低于對照組，觀察組不同濃度間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；說明環(huán)磷酰胺在0.02～2 μg/mL濃度范圍內(nèi)可降低MC3T3-E1細(xì)胞的GJ功能。同時本研究顯示，加入0.02、0.2、2 μg/mL環(huán)磷酰胺的觀察組細(xì)胞Cx43相對表達量與對照組比較，觀察組不同濃度間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；說明環(huán)磷酰胺降低MC3T3-E1細(xì)胞GJ功能的機制與Cx43蛋白表達無關(guān)。

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