李歡，熊靜，楊樹(shù)龍，洪芬芳

(南昌大學(xué)，南昌330006)

肝臟缺血再灌注損傷是肝臟缺血再灌注后肝臟功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷加重的病理過(guò)程,細(xì)胞凋亡是其病理特征之一。線粒體是聯(lián)系細(xì)胞凋亡和氧自由基的中心環(huán)節(jié)，對(duì)缺血、缺氧非常敏感，肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，線粒體膜結(jié)構(gòu)的破壞是其導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要原因。同時(shí)，線粒體也是肝臟缺血再灌注損傷期間活性氧產(chǎn)生的主要細(xì)胞器，活性氧的大量產(chǎn)生超過(guò)機(jī)體清除能力，機(jī)體的氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。研究[1]發(fā)現(xiàn)，線粒體通路、氧化應(yīng)激在肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸過(guò)程中起重要作用，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中涉及的具體機(jī)制復(fù)雜多樣，是研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)?，F(xiàn)就線粒體通路、氧化應(yīng)激在肝臟缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡中作用機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 線粒體通路在肝臟缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制

由誘變劑﹑化療藥物和電離輻射造成的細(xì)胞內(nèi)不可修復(fù)的基因組損傷會(huì)激活凋亡的內(nèi)源通路，即線粒體通路。肝臟發(fā)生缺血再灌注時(shí)，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其具體的機(jī)制涉及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開(kāi)放、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白釋放和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)家族蛋白的調(diào)控作用等。

1.1 MPTP開(kāi)放 MPTP是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一組蛋白復(fù)合體，是一種非特異性通道，其分子組成尚未完全清楚。肝臟缺血再灌注引起MPTP開(kāi)放，水分子和其他小分子內(nèi)流，導(dǎo)致線粒體腫脹破裂，此時(shí)線粒體內(nèi)的一些酶和凋亡誘導(dǎo)蛋白因子釋放，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前的研究發(fā)現(xiàn)，ATP、ADP、活性氧簇、高濃度Ca2+均對(duì)MPTP有調(diào)控作用。Grossini等[2]提出，左西孟旦可通過(guò)與NO產(chǎn)生和線粒體ATP敏感性鉀通道功能相關(guān)的機(jī)制，發(fā)揮抗缺血再灌注損傷作用。L-Nω-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)和5HD的預(yù)處理可消除其所有作用。氟比洛芬是環(huán)氧合酶(COX-1和COX-2)非選擇性抑制劑。Fu等[3]證實(shí)，在肝缺血再灌注前使用氟比洛芬，可通過(guò)抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的失活來(lái)改善線粒體和肝細(xì)胞損傷，這為臨床應(yīng)用氟比洛芬保護(hù)肝功能提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。Cai等[4]研究表明，紅景天苷預(yù)處理可通過(guò)GSK-3β/核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)依賴(lài)的抗氧化反應(yīng)和隨后增加通透性轉(zhuǎn)換孔阻力發(fā)揮對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。然而，使用羧基蒼術(shù)苷開(kāi)放通透性轉(zhuǎn)換孔可逆轉(zhuǎn)該保護(hù)作用。Sirtuin 1是一個(gè)能調(diào)節(jié)線粒體生物合成的酶。Khader等[5]在大鼠缺血再灌注60 min后，給予Sirtuin 1激動(dòng)劑藥物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可恢復(fù)線粒體的質(zhì)量和膜電位，一定程度上減輕了肝臟缺血再灌注損傷。硫化氫預(yù)處理顯著抑制MPTP開(kāi)放，從而阻止線粒體相關(guān)的細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡[6]。

1.2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白釋放 肝臟缺血再灌注時(shí)，線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，很多凋亡相關(guān)蛋白因?yàn)榫€粒體膜通透性改變釋放到胞質(zhì)中，直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白有細(xì)胞色素c(Cyt-c)、凋亡誘導(dǎo)因子、核酸內(nèi)切酶G、線粒體促凋亡蛋白Smac、Omi/HtrA2等。其中與細(xì)胞凋亡關(guān)系最密切的是Cyt-c的釋放。Cyt-c從線粒體釋放后，線粒體呼吸鏈、電子傳遞受阻，細(xì)胞能量供應(yīng)減少，促進(jìn)凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)構(gòu)象變化并發(fā)生同源寡聚化。Cyt-c、dATP、Apaf-1和proCaspase-9組成聚合體，稱(chēng)為凋亡體，凋亡體活化后促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Lin等[7]在探討miR-183在缺血后處理中的保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-183在大鼠的肝組織缺血后有強(qiáng)大的作用。miR-183可以抑制Apaf-1的表達(dá)，中斷凋亡體的形成，抑制凋亡。Strifler等[8]在假設(shè)大量甲烷吸入可影響缺血再灌注后肝線粒體的呼吸活性前提下設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明常氧再灌注損傷伴有明顯的線粒體膜功能損害、Cyt-c活性增加、活性氧生成增加和細(xì)胞凋亡。然而升高的甲烷攝入量能顯著防止線粒體功能障礙，減少肝細(xì)胞的氧化損傷。

1.3 Bcl-2家族蛋白的調(diào)控作用 在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制中，Bcl-2家族成員具有重要的調(diào)控作用。一方面，Bcl-2家族蛋白可以精確地改變線粒體通透性，形成孔道，使線粒體內(nèi)容物流出；另一方面，它能夠誘導(dǎo)線粒體MPTP的開(kāi)放，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白釋放。Yang等[9]在兔模型中發(fā)現(xiàn)，奧曲肽預(yù)處理下調(diào)了線粒體代謝酶如NADH2脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性，減輕了肝臟缺血再灌注損傷。此前他們的研究顯示，奧曲肽的保護(hù)機(jī)制可能與內(nèi)毒素水平降低、炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的下調(diào)、肝細(xì)胞凋亡的抑制以及線粒體介導(dǎo)的Bcl-2/Bax凋亡途徑的調(diào)節(jié)有關(guān)[10]。據(jù)此，奧曲肽可能有助于減少肝臟手術(shù)或移植后的肝損傷，并有希望作為肝臟缺血再灌注損傷的治療藥物。

2 氧化應(yīng)激在肝缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制

當(dāng)細(xì)胞在受到物理、化學(xué)、生物等刺激時(shí)，為了適應(yīng)或抵抗刺激，細(xì)胞可產(chǎn)生大量高活性的活性氧簇。細(xì)胞中的活性氧過(guò)度產(chǎn)生和(或)抗氧化防御機(jī)制減弱,導(dǎo)致活性氧的生成和清除之間的平衡失調(diào)，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)[11]。正常情況下機(jī)體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),對(duì)機(jī)體并無(wú)有害影響。隨著對(duì)病理生理機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)隨著氧的涌入，氧自由基大量產(chǎn)生和過(guò)剩，進(jìn)而誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致肝臟缺血再灌注損傷非常重要的病理機(jī)制之一[12]。活性氧簇過(guò)度產(chǎn)生依賴(lài)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的Ca+傳遞，不僅直接造成肝細(xì)胞氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；還可引起脂質(zhì)過(guò)氧化，使機(jī)體產(chǎn)生一系列脂質(zhì)過(guò)氧化物，同時(shí)影響機(jī)體凋亡相關(guān)標(biāo)志物的水平，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。另外，一些氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)分子如HO-1、Nrf2等可通過(guò)某些機(jī)制改善機(jī)體的損傷。

2.1 脂質(zhì)過(guò)氧化 脂質(zhì)過(guò)氧化是指氧化生物膜的過(guò)程?；钚匝醮乜膳c肝細(xì)胞膜磷脂的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈反應(yīng)生成丙二醛(MDA)和4-羥基壬烯酸(HNE)等脂質(zhì)過(guò)氧化物，從而改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)被破壞，增加了膜的通透性;膜脂質(zhì)過(guò)氧化還促進(jìn)前列腺素、血栓素、白三烯等生物活性物質(zhì)的形成，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[13]。

研究[14]發(fā)現(xiàn)，活性氧所致的氧化應(yīng)激是造成細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。超氧化物歧化酶(SOD)為機(jī)體主要的氧自由基清除酶之一。肝臟有效血流量下降造成內(nèi)源性氧自由基清除劑SOD下降,同時(shí)SOD合成減少,氧自由基清除不足,反過(guò)來(lái)又進(jìn)一步抑制SOD的活性。SOD活性下降引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化物在金屬離子存在下催化裂解，使MDA產(chǎn)生增多, MDA對(duì)細(xì)胞有毒性作用,可與蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián),誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

異丙酚和七氟醚是臨床常用麻醉藥，在器官缺血再灌注中有保護(hù)作用。Xu等[15]發(fā)現(xiàn)異丙酚和七氟醚可通過(guò)降低MDA、NO和SOD的釋放而減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而保護(hù)肝臟缺血再灌注損傷。香芹酚，精油中常用的食品添加劑，具有抗菌、抗腫瘤和抗抑郁的作用。Suo等[16]研究表明，香芹酚可通過(guò)顯著降低SOD活性和MDA含量，并恢復(fù)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和谷胱甘肽(GSH)的含量，對(duì)缺血再灌注損傷大鼠有抗氧化保護(hù)作用。該結(jié)果表明，香芹酚能減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷，其抗氧化和抗凋亡活性值得進(jìn)一步研究。Cahova等[17]通過(guò)二甲雙胍治療急性應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清AST、ALT活性和脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二甲雙胍在降低線粒體性能的同時(shí)，可保護(hù)肝臟缺血再灌注損傷。他們提出二甲雙胍作用的有益效果是基于三個(gè)機(jī)制：提高抗氧化酶活性、降低線粒體活性氧簇的產(chǎn)生、減輕缺血后的炎癥。

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 當(dāng)機(jī)體活性氧簇的增加超出了機(jī)體的抗氧化能力時(shí)，可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，大量的活性氧簇產(chǎn)生并且釋放，作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+通道，使Ca2+增加，其進(jìn)入線粒體后干擾電子呼吸鏈，導(dǎo)致更多的活性氧簇產(chǎn)生[18]。如此反復(fù)，惡性循環(huán)，誘發(fā)和加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而誘發(fā)炎癥或細(xì)胞凋亡。

Sun等[19]發(fā)現(xiàn)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)治療可顯著降低活性氧簇水平和活性氧簇誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷。NAC處理的小鼠對(duì)活性氧簇介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有明顯的抑制作用。此外，NAC治療能顯著降低再灌注后Caspase-3活性和細(xì)胞凋亡，這與Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達(dá)有關(guān)。同樣，NAC處理顯著抑制H2O2或TG處理的肝細(xì)胞的LDH釋放。該研究提出NAC抑制活性氧簇介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡通路的關(guān)鍵。此外，Wang等[20]提出，NAC也可通過(guò)影響JNK信號(hào)通路防止肝臟缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的自噬和凋亡，其機(jī)制可能涉及清除活性氧簇，減少JNK和p-JNK，間接升高Bcl-2水平及改變Beclin 1和Bcl-2的平衡。Xu等[21]證實(shí)葡萄籽原花青素(GSP)具有抗氧化、抗炎作用，并可以通過(guò)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路調(diào)節(jié)保護(hù)肝臟缺血再灌注損傷，具有抗凋亡作用。

2.3 凋亡相關(guān)標(biāo)志物水平變化 肝臟缺血再灌注損傷可使血清中ALT、AST、GGT水平增加，GSH和p-Akt減少，使壞死肝中MDA、TNF-α、Caspase-3水平增加，Bcl-2的表達(dá)降低，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

茶多酚(TPS)是一類(lèi)具有較強(qiáng)抗氧化性的物質(zhì)。Tao等[22]研究結(jié)果表明，TPS預(yù)處理可減輕小鼠缺血再灌注損傷后ALT和AST活性的上調(diào)。此外，GSH在去除人體組織中的活性氧方面起抗氧化劑的作用，而氧化型谷胱甘肽可以通過(guò)谷胱甘肽還原酶轉(zhuǎn)化為GSH。在本研究中，TPS通過(guò)抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化損傷及肝細(xì)胞凋亡，從而減輕肝臟缺血再灌注損傷。Xu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺(Gln)預(yù)處理后肝組織形態(tài)明顯改善，GSH、Caspase-3 mRNA水平升高，MDA、SOD、IL-1β和TNF-α水平下降，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞間黏附分子-1和Bax蛋白表達(dá)下調(diào)。Gln預(yù)處理顯著改善了肝臟缺血再灌注損傷后梗阻性黃疸大鼠的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，其保護(hù)作用是通過(guò)抑制活性氧的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)以及減少肝細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的。

研究[24]表明，維生素D處理組大鼠ALT、AST、GGT、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、Bcl-2、cyt-c及Caspase-3水平明顯低于I/R組，GSH-Px和Bcl-2水平高于I/R組。組織學(xué)檢查顯示，與I/R組相比，維生素D組損傷肝組織較少，凋亡征象改善。維生素D補(bǔ)充劑主要通過(guò)減輕由氧化再灌注損傷介導(dǎo)的炎癥-細(xì)胞凋亡反應(yīng)來(lái)改善肝缺血再灌注損傷。

Huang等[25]研究了異甘草酸鎂(MgIG)對(duì)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的人類(lèi)肝L02細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MgIG治療顯著降低凋亡細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，并減輕了肝細(xì)胞損傷。MgIG還可對(duì)抗缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，因?yàn)樗行У販p少了MDA表達(dá)，并升高了SOD和GSH-Px活性。LO2細(xì)胞經(jīng)MgIG處理后，p-AKT和p-ERK蛋白的表達(dá)增加，表明MgIG的保護(hù)作用可能激活了Akt和ERK信號(hào)通路。

2.4 氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)分子變化 ①血紅素加氧酶-1(HO-1)。HO-1又稱(chēng)熱休克蛋白-32，是一種微粒體酶。HO-1在氧化應(yīng)激、炎癥等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激損傷時(shí)可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。Fang等[26]對(duì)缺血再灌注損傷大鼠使用PEG-hemin治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，PEG-hemin治療可改善大鼠肝血流量，顯著提高HO-1的表達(dá)和酶活性；HO-1通過(guò)活性氧簇機(jī)制改善了肝臟功能，減少了肝細(xì)胞凋亡和炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生。②轉(zhuǎn)錄因子Nrf2。Nrf2介導(dǎo)的信號(hào)通路是抗氧化的關(guān)鍵信號(hào)通路[27]。正常情況下，絕大部分Nrf2與胞質(zhì)kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)結(jié)合，以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，通常Nrf2表達(dá)量維持在較低水平，但在氧化應(yīng)激的作用下可與Keap1解離而進(jìn)入胞質(zhì)。MnDPDP預(yù)處理的肝臟表現(xiàn)出Nfr2和HIF-1α途徑的激活，導(dǎo)致更高的CAT和HO-1活性[28]。MnDPDP還增加了總氮氧化物產(chǎn)生，其源自組成型一氧化氮合酶的較高表達(dá)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的較低表達(dá)。Chi等[29]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素(SFN)預(yù)處理能通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕肝臟缺血再灌注損傷，減輕氧化應(yīng)激，維持Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的正?；钚?，從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。硫化氫可以改善肝臟缺血再灌注損傷，但確切的機(jī)制仍不清楚。Shimada等[30]研究提出硫化氫鈉通過(guò)涉及Nrf-2機(jī)制和Akt-p70S6k加速肝再生的機(jī)制，發(fā)揮直接和間接的抗氧化活性并加強(qiáng)促生存、抗凋亡、抗炎的作用，改善肝臟缺血再灌注損傷。

綜上所述，線粒體通路和氧化應(yīng)激是肝臟缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制，其具體的作用途徑也逐漸清晰，這為臨床治療提供了強(qiáng)有力的理論支持，可以指導(dǎo)臨床針對(duì)這一損傷機(jī)制制訂肝臟缺血再灌注損傷的預(yù)防和治療方案，比如預(yù)處理給藥抑制MPTP開(kāi)放或者抑制活性氧的過(guò)度產(chǎn)生等，但具體的實(shí)施方案還有待更多的實(shí)驗(yàn)研究。