吳 凱

（晉中市農(nóng)業(yè)委員會，山西晉中 030600）

全球人口將在2050年突破90億，而目前主要農(nóng)作物的產(chǎn)量已經(jīng)無法滿足人口的快速增長帶來的對糧食的巨大需求[1]，加上世界耕地面積不斷減少、全球變暖可能引發(fā)的氣候異?；虿∠x害暴發(fā)等因素，農(nóng)作物育種在未來幾十年內(nèi)面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]。因此，充分利用目前作物基因組學(xué)取得的研究成果，將先進的分子生物技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，從本質(zhì)上推動作物育種領(lǐng)域的綠色革命，對緩解甚至解決全球糧食安全問題具有重要意義。

1 育種分子標(biāo)記

作物分子育種的核心是基于分子標(biāo)記的輔助選擇（marker-assisted selection，MAS），分子標(biāo)記最早始于以限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）為代表的第1代分子標(biāo)記，隨后發(fā)展出目前應(yīng)用最廣的第2代標(biāo)記——簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats，SSR）標(biāo)記，在育種領(lǐng)域發(fā)揮了巨大作用，但隨著育種精度要求的不斷提高，以及小麥等多倍體作物分子育種工作的開展，SSR標(biāo)記開始出現(xiàn)局限性。一是SSR序列在基因組中的分布不均勻且是有限的，其與目標(biāo)基因連鎖不緊密，容易在分子輔助選擇過程中丟失；二是SSR標(biāo)記依賴于凝膠電泳技術(shù)，用于規(guī)模育種中則通量低、代價高；三是SSR標(biāo)記在多倍體中的亞基因組特異性較差，會影響圖譜構(gòu)建或基因定位結(jié)果的準(zhǔn)確性。

隨著測序和組裝技術(shù)的進步，越來越多的農(nóng)作物物種已經(jīng)繪制全基因組草圖?；诨蚪M數(shù)據(jù)，科研人員診斷、開發(fā)了第3代新型標(biāo)記——單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標(biāo)記，SNP標(biāo)記具有密度高、遺傳穩(wěn)定的特點，而且?guī)缀醵家远任欢鄳B(tài)性存在[3]，檢測時無須象RFLP，SSR那樣對片段的長度作出測量，極易實現(xiàn)自動化。

2 芯片技術(shù)平臺

SNP芯片技術(shù)就是將第3代SNP標(biāo)記固定在載體上形成密集的寡核苷酸探針陣列，再與目標(biāo)DNA進行等位基因特異性反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)后信號的有無和強弱確定SNP位點的多態(tài)性，該技術(shù)可以對作物全基因組實現(xiàn)快速、高密度的掃描，特別是對育種工作中的大量群體樣本進行基因型鑒定時，單個檢測位點成本很低，是一種高集成、高通量、微型化和自動化的檢測SNP的手段。目前，芯片基因型鑒定平臺采用的是Illumina公司的BeadArray技術(shù)和Affymetrix公司的Axiom技術(shù)。

Illumina BeadArray技術(shù)是將特定寡核苷酸覆蓋到微珠上，將其嵌入到裝有樣本DNA的、能與其互相匹配的微孔中發(fā)生雜交，再通過熒光掃描實現(xiàn)對SNP的高通量識別和分型。BeadArray技術(shù)可以分析更高密度的陣列，即能分析更多的SNP位點?；陔p色單堿基探針，每個樣本可以同時掃描3 000到500多萬個SNP位點。Affymetrix則采用了基于光蝕刻的GeneChip陣列與等位基因特異性寡聚體進行雜交，該寡聚體包含了能與SNP完全匹配的探針[4]。AffymetrixAxiom技術(shù)基于雙色和30-mer探針的連接測定，可同時分析384個樣品的50K個SNP位點。

3 芯片技術(shù)在育種中的應(yīng)用

水稻是最早完成全基因組測序的農(nóng)作物，因此，其芯片研發(fā)工作也起步最早。目前，已經(jīng)開發(fā)出6K，44K，50K和1M等滿足不同育種用途的SNP芯片（表1）。在其他糧食作物中，玉米3K/50K/600K、大豆180K、馬鈴薯20K芯片也先后研發(fā)成功。小麥9K/90K/660K、大麥9K、燕麥6K和黑麥600K等麥類作物芯片也已用于生產(chǎn)。而在經(jīng)濟作物中，目前已研制出花生58K、棉花63K和向日葵25K芯片用于育種（表1）。

芯片技術(shù)已被廣泛用于育種領(lǐng)域中的各個環(huán)節(jié)中，并且根據(jù)各環(huán)節(jié)實際需求開發(fā)出了不同大小的芯片以及鑒定平臺。例如，在全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide Association Studies，GWAS）和連鎖作圖中需要對數(shù)千個樣本掃描數(shù)萬個標(biāo)記，而在標(biāo)記輔助回交（Marker-assisted Backcrossing，MABC）中只需要對樣本掃描數(shù)百個與目標(biāo)基因緊密連鎖的標(biāo)記。因此，在作物分子育種中，一般先利用高密度芯片快速準(zhǔn)確地定位目標(biāo)基因，對于多基因控制的農(nóng)藝性狀則確定其數(shù)量性狀位點，而在接下來的回交育種和輪回選擇等工作中，可使用更具有針對性的、基于競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）的SNP芯片對后代單株進行選擇。此外，研究人員還開發(fā)出了基于芯片技術(shù)的分子育種工具MBDT（Marker-assisted Backcross BreedingTool）。該工具包括數(shù)據(jù)驗證、表型分析、連鎖圖譜構(gòu)建、QTL分析、基因組顯示和MABC所需樣本量，使目前先進的分子育種技術(shù)操作簡單化、結(jié)果直觀化，將大大提高傳統(tǒng)育種家使用SNP芯片的比例，推動農(nóng)業(yè)作物進入以科學(xué)理論為基礎(chǔ)的分子育種時代。

4 存在問題和展望

在水稻、玉米等二倍體模式作物中，對基因組以及基因功能的研究較為深入，分子育種也取得了很好的成果。而在燕麥等冷門作物或者小麥等具有復(fù)雜基因組的多倍體作物中，基于全基因組水平的功能基因挖掘與驗證工作才剛剛起步，在利用芯片技術(shù)選育品種過程中很可能會出現(xiàn)2個問題。

第1個問題是作物基因型與預(yù)期表型不一致，這也是限制分子育種應(yīng)用的一個重要因素。闡明控制作物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等重要農(nóng)藝性狀的基因及其調(diào)控機制，是分子育種的理論基礎(chǔ)，對此，科研人員開展多方面的研究，如泛基因組重測序、與模式作物比較基因組學(xué)分析、育種環(huán)節(jié)結(jié)合目標(biāo)基因功能驗證、引入轉(zhuǎn)錄組學(xué)/蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)的研究成果等等，以期減少或消除基因型與表型不一致的情況。

第2個問題是芯片標(biāo)記信息不全面。由于芯片標(biāo)記主要是基于已測序作物品種的基因組序列開發(fā)的，而在育種過程中常常會引入作物的農(nóng)家品種、野生品種甚至近緣種的優(yōu)異基因組片段，因此，現(xiàn)有育種芯片可能無法識別作物不同遺傳資源中的特有變異類型，最終限制了外源片段的導(dǎo)入。例如，早期基于B73和Mo17這2個溫帶玉米自交系測序草圖開發(fā)的SNP芯片，無法識別出熱帶玉米基因組中的優(yōu)異等位變異[24]，為此，已有機構(gòu)開始對包括熱帶自交系在內(nèi)的玉米品種進行大規(guī)模重新測序，以期開發(fā)出信息量完整的SNP芯片用于育種。

在接下來的10 a內(nèi)，隨著組學(xué)技術(shù)的進一步發(fā)展和功能研究的不斷深入，SNP芯片的成本將繼續(xù)降低，功能標(biāo)記的準(zhǔn)確性和覆蓋品種的完整性則會大幅提升，鑒定平臺和育種軟件的簡潔化、智能化將使芯片技術(shù)在傳統(tǒng)育種家以及發(fā)展中國家大范圍普及，世界農(nóng)業(yè)將真正進入科學(xué)、高效的分子育種時代。

參考文獻：

［1］RAY D K，RAMANKUTTY N，MUELLER N D，et al.Recent patterns ofcrop yield growth and stagnation[J].Nat Commun，2012，3：1293.

［2］ABBERTON M，BATLEY J，BENTLEY A，et al.Global agricultural intensification during climate change:a role for genomics[J].Plant Biotechnol J，2015，14（4）：1095-1098.

［3］ BROOKES A J.The essence of SNPs[J].Gene，1999，234（2）：177-186.

［4］MATSUZAKI H，DONG S，LOI H，et al.Genotyping over 100，000 SNPs on a pair of oligonucleotide arrays[J].Nat Methods，2004，1（2）：109-111.

［5］ CAVANAGH C R，CHAO S M，WANG S C，et al.Genome-wide comparative diversity uncovers multiple targets of selection for improvement in hexaploid wheat landraces and cultivars[J].Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（20）：8057-8062.

［6］WANG Y，CHENG X，SHAN Q，et al.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance topowderymildew[J].Nat Biotechnol，2014，32（9）：947-951.

［7］趙光耀，孔秀英，高麗峰，等.小麥基因組特異SNP分析與高通量芯片開發(fā) [C]//第五屆全國小麥基因組學(xué)及分子育種大會會議論文集，合肥：中國作物協(xié)會，2014.

［8］COMADRAN J，KILIAN B，RUSSELL J，et al.Natural variation in a homolog of Antirrhinum CENTRORADIALIS contributed to spring growth habit and environmental adaptation in cultivated barley[J].Nat Genet，2012，44（12）：1388-1392.

［9］TINKER N A，CHAO S，LAZO G R，et al.A SNP genotyping array for hexaploid oat[J].Plant Genome，2014，7：3.

［10］ BAUER E，SCHMUTZER T，BARILAR I，et al.Towards a whole-genome sequence for rye （Secale cereale L.）[J].Plant J，2017，89（5）：853-869.

［11］ YU H，XIE W，LI J，et al.A whole-genome SNP array（RICE6K）for genomic breeding in rice[J].Plant Biotech J，2014，12（1）：28-37.

［12］ TUNG C W，ZHAO K，WRIGHT M，et al.Development of a research platform for dissecting phenotype-genotype associations in rice（Oryza spp.）[J].Rice，2010，3（4）：205-217.

［13］ SINGH N，JAYASWAL P K，PANDA K，et al.Single-copy gene based 50K SNP chip for genetic studies and molecular breeding in rice[J].Sci Rep，2015，5：11600.

［14］ MCCOUCH S R，ZHAO K，WRIGHT M，et al.Development of genome-wide SNP assays for rice [J].Breed Sci，2010，60：524-535.

［15］ LEE Y G，JEONG N，KIM J H，et al.Development，validation and genetic analysis of a large soybean SNP genotyping array[J].Plant J，2015，81（4）：625-636.

［16］PANDEY MK，AGARWAL G，KALE S M，et al.Development and evaluation of a high density genotyping'Axiom_Arachis'array with 58K SNPs for accelerating genetics and breeding in groundnut[J].Sci Rep，2017，7：40577.

［17］HULSE-KEMP AM，LEMMJ，PLIESKE J，et al.Development ofa 63KSNP arrayfor cotton and high-densitymappingofintraspecific and interspecific populations ofGossypium spp.[J].G3（Bethesda），2015，5（6）：1187-1209.

［18］GANAL MW，DURSTEWITZ G，POLLEY A，et al.A large maize（Zea mays L.）SNP genotyping array：development and germplasm genotyping，and genetic mappingtocompare with the B73 reference genome[J].PLoSOne，2011，6（12）：e28334.

［19］ROUSSELLE Y，JONES E，CHARCOSSET A，et al.Study on essential derivation in maize：III.Selection and evaluation of a panel of single nucleotide polymorphism loci for use in European and North American germplasm [J].Crop Sci，2015，55 （3）：1170-1180.

［20］ UNTERSEER S，BAUER E，HABERER G，et al.A powerful tool for genome analysis in maize:development and evaluation of the high density 600k SNP genotyping array[J].BMC Genomics，2014，15（1）：823.

［21］XUC，RENY，JIANY，et al.Development ofa maize 55KSNP arraywith improved genome coverage for molecular breeding[J].Mol Breed，2017，37（31）：20.

［22］VOSP G，UITDEWILLIGENJ G，VOORRIPSR E，et al.Development and analysis of a 20K SNP arrayfor potato（Solanum tuberosum）：an insight into the breeding history[J].Theor Appl Genet，2015，128（12）：2387-2401.

［23］ LIVAJA M，UNTERSEER S，ERATH W，et al.Diversity analysis and genomic prediction of Sclerotinia resistance in sunflower using a new25KSNP genotypingarray[J].Theor Appl Genet，2016，129（2）：317-329.

［24］XU Y，LI P，ZOU C，et al.Enhancing genetic gain in the molecular breedingera[J].J Exp Bot，2017，68（11）：2641-2666.