戴小英，劉新亮，邱鳳英，章 挺，李 江

（江西省林業(yè)科學(xué)院 國家樟樹工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330032）

黃樟Cinnamomum porrectum(Roxb) Kosterm俗稱油樟、大葉樟，為樟科Lauraceae樟屬Cinnamomum常綠闊葉大喬木，是南方珍貴的用材和經(jīng)濟(jì)樹種，在我國主要分布于廣東、廣西、福建、江西、湖南、貴州、云南等地[1-2]。黃樟木材屬硬木類，硬度中等堅(jiān)重，具有紋理美觀細(xì)致，不易開裂變形，耐腐防蟲，材性穩(wěn)定，氣味芳香等優(yōu)良特性，是木地板、高檔家具制作以及室內(nèi)裝飾的優(yōu)質(zhì)材料；其葉中富含精油成分，可提制多種香精，供食品、醫(yī)藥和日用化工用，是重要的天然精油植物資源；其干形通直，樹冠分枝勻稱，四季青翠，生長迅速，是極具發(fā)展前景的園林綠化和行道樹種[3-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃樟母樹結(jié)實(shí)量小，種子在幼期易被鳥蟲侵害，加之種子繁殖的后代性狀分化較大，母本優(yōu)良性狀難以通過有性繁殖保存，為黃樟優(yōu)良品系的選育和推廣帶來了較大困難[6]。組織培養(yǎng)具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)大的優(yōu)點(diǎn)，不受繁殖材料和季節(jié)的限制，可在短時間內(nèi)獲得大量無性系。因此，組織培養(yǎng)是保持黃樟優(yōu)良性狀的重要途徑，研究黃樟的組培快繁技術(shù)對我國黃樟產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。目前，關(guān)于樟Cinnamomum camphora(Linn) Presl的組織培養(yǎng)研究已經(jīng)取得了一定的成果，但對黃樟的組織培養(yǎng)未見報(bào)道[7-9]。本研究在借鑒前期樟的組織培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)上，以黃樟秋稍帶腋芽莖段為外植體，建立并優(yōu)化黃樟莖段的離體培養(yǎng)體系，以期為黃樟的快速繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

供試材料采自江西省國家林業(yè)局樟樹工程中心黃樟基因庫（27°53′N，116°47′E）的 3 年生黃樟母樹。9月采集當(dāng)年萌發(fā)飽滿隱芽新枝，去頂、剪取頂芽以下3～4個帶腋芽莖段，用洗潔精溶液浸泡10 min后，毛筆刷洗去枝條表面污垢，將莖段剪成1～2個芽一節(jié)，放置流水下沖洗30 min。在超凈工作臺上用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒45 s，用0.1%的升汞消毒6～8 min，無菌水沖洗3次，消毒處理后的材料插入啟動培養(yǎng)基。

1.2 啟動培養(yǎng)基的篩選

以1/2MS、MS、改良MS（NH4NO30.8 g/L、Ca(NO3)2·4H2O 0.2 g/L）、B5、ER培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，均添加4.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA的條件下進(jìn)行莖段誘導(dǎo)試驗(yàn)，篩選出最佳基本培養(yǎng)基種類。將滅菌的帶腋芽莖段接種到不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每處理接種10瓶，每瓶接種2個莖段，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后，觀察記錄出芽數(shù)和生長狀況，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率：

誘導(dǎo)率=分化不定芽數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.3 繼代培養(yǎng)

1.3.1 激素組合對不定芽增殖的影響

待啟動培養(yǎng)中腋芽長度為2～3 cm時，切取健壯無污染芽體轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以啟動培養(yǎng)篩選出基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用改良MS培養(yǎng)基為繼代的基本培養(yǎng)基，附加一定濃度的激素組合（2.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L ZT、0.2 mg/L KT、0.2 mg/L NAA、0.5 mg/L IAA），進(jìn)行激素組合篩選試驗(yàn)。每個處理接種10瓶，每瓶接種2個芽，3個重復(fù)。

1.3.2 激素濃度配比對不定芽增殖的影響

在激素組合篩選的基礎(chǔ)上，以改良MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加一定濃度的6-BA（0.5, 1.0,2.0, 3.0）、KT（0, 0.2, 0.5, 1.0）、NAA（0, 0.05,0.1, 0.5）組合，并采用三因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(45)，進(jìn)行激素濃度配比試驗(yàn)。每個處理接種10瓶，每瓶接種2個芽，重復(fù)3次。觀察記錄出芽數(shù)和生長狀況，計(jì)算芽增殖倍數(shù)：

芽增殖倍數(shù) = 一個周期培養(yǎng)后芽數(shù) / 接種芽數(shù)。

1.4 生根培養(yǎng)

選取繼代培養(yǎng)35 d后長勢較好的、長度為2～3 cm的不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)。以改良1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IAA（0.2、0.5、1.0）和IBA（0.2、0.5、1.0），將兩者進(jìn)行正交試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)L9(34)。每處理接種10瓶，每瓶3株，重復(fù)3次。25 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)量和生長狀況。

1.5 培養(yǎng)條件

誘導(dǎo)、增殖和生根的培養(yǎng)基均添加30 g/L蔗糖和3.0 g/L卡拉膠，生根培養(yǎng)基添加0.2 g/L活性炭，pH為7.0。培養(yǎng)條件為溫度(25±2) ℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，光照時間14 h/d。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)（Duncan’s新復(fù)極差法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對黃樟不定芽誘導(dǎo)的影響

5種基本培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)黃樟腋芽的萌發(fā)，但在不同的培養(yǎng)基中黃樟莖段出芽時間、出芽率和萌芽后生長情況均有差異（見表1）。由表1可知，改良MS培養(yǎng)基中莖段的起始出芽時間為7d，出芽率為76.7%，均高于其他4種培養(yǎng)基，且芽體長勢正常，葉綠、健壯（見圖1）。MS培養(yǎng)基的出芽率僅次于改良MS培養(yǎng)基，為66.7%，與改良MS培養(yǎng)基差異未達(dá)到顯著水平（P＜0.05），但其起始出芽時間（10 d）晚于改良MS培養(yǎng)基（見圖1）。B5培養(yǎng)基的出芽率最低，為45.0%，起始出芽時間較晚，為12 d。因此，黃樟帶腋芽莖段最佳啟動培養(yǎng)基為改良MS + 4.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基。

表1 不同基本培養(yǎng)基對莖段不定芽誘導(dǎo)的影響?Table 1 Effect of different basic mediums on the induction of stem in Cinnamomum porrectum

圖1 黃樟莖段初芽誘導(dǎo)Fig. 1 Bud induction of stem in C. porrectum

2.2 不同激素的組合對不定芽誘導(dǎo)的影響

黃樟莖段腋芽啟動生長后，為了形成一個多芽多枝的叢狀結(jié)構(gòu)培養(yǎng)體，需利用外源的細(xì)胞分裂素及生長素誘導(dǎo)單芽分化為多個不定芽。本試驗(yàn)在改良MS中添加一定濃度的6-BA、ZT、KT、NAA、IAA，進(jìn)行激素組合試驗(yàn)（見表2）。由表2可知，在不添加激素的情況下（組合11），莖段萌發(fā)出的單芽繼續(xù)生長，但未分化出新的不定芽。添加6-BA的培養(yǎng)基（組合1～6）中誘導(dǎo)不定芽率明顯高于其他不添加6-BA的培養(yǎng)基，說明添加6-BA有利于黃樟莖段不定芽的誘導(dǎo)。在添加6-BA的 基礎(chǔ)上，添加NAA可提高誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率。添加6-BA、ZT、NAA激素（組合2）的培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽率最高，達(dá)到了86.7%，與其他激素組合的差異均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05），且誘導(dǎo)不定芽較多，生長健壯。添加KT與NAA組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽率最低，為20.0%，且誘導(dǎo)的不定芽較少。因此，添加6-BA、ZT和NAA激素組合的培養(yǎng)基為誘導(dǎo)不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基。

表2 不同激素組合對黃樟不定芽誘導(dǎo)影響?Table 2 Effect of different hormone combination on budding of C. porrectum

2.3 激素濃度配比對黃樟不定芽再生的影響

黃樟腋芽經(jīng)初期誘導(dǎo)后可獲得大量莖芽，繼代多次后，發(fā)現(xiàn)苗易發(fā)生芽密集、頂芽壞死、芽圓頭型、愈傷組織過多、叢生芽玻化、褐化、單芽不生長、葉片生長量小、莖細(xì)小等問題，直接影響組培苗擴(kuò)繁速度及植株再生狀況。為使無菌體系達(dá)到穩(wěn)定、高效增殖，本試驗(yàn)以2.1和2.2獲得的培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，采用三因素四水平正交試驗(yàn)進(jìn)一步研究激素濃度配比對不定芽再生的影響（見表3）。對誘導(dǎo)芽增殖倍數(shù)結(jié)果進(jìn)行極差分析發(fā)現(xiàn)R6-BA＞RZT＞RNAA，表明6-BA對不定芽誘導(dǎo)率的影響最大。表4方差分析結(jié)果表明，6-BA對黃樟不定芽增殖影響存在顯著性差異，而ZT、NAA作用不顯著。

當(dāng)繼代培養(yǎng)基中6-BA為0.5 mg/L時，繼代3次幾乎無新芽，芽體出現(xiàn)明顯愈傷，因此低濃度的6-BA不利于誘導(dǎo)黃樟不定芽再生。隨著6-BA濃度的升高，不定芽增值系數(shù)也不斷升高；處理9的不定芽生長旺盛，具有較高的芽增值系數(shù)，此時6-BA濃度為2.0 mg/L。由表3直觀分析可知，6-BA 4個水平的均值大小依次為：k4＞k3＞k2＞k1，表明水平4（3.0 mg/L）最適于不定芽增殖；但是當(dāng)6-BA濃度為3.0 mg/L時，芽苗生長狀態(tài)開始變差，芽密集、細(xì)小略呈畸形（見圖2）。當(dāng)NAA濃度為1.0 mg/L時，叢生芽基部出現(xiàn)大量愈傷組織，繼代多次后基部擴(kuò)展到莖上后慢慢發(fā)黑直接影響芽體正常生長，故高濃度NAA易造成愈傷組織生長旺盛、細(xì)胞團(tuán)組織松散、不利細(xì)胞分化形成苗。因此，綜合各項(xiàng)指標(biāo)，黃樟不定芽增殖的最優(yōu)激素配比為（處理9）：改良MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA（見圖3）。

表3 黃樟不定芽誘導(dǎo)增殖正交試驗(yàn)結(jié)果?Table 3 Results of orthogonal design of different hormone on cluster buds proliferation

表4 激素處理對黃樟不定芽增殖正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal design on cluster buds proliferation

圖2 3.0 mg/L 6-BA條件下的繼代苗Fig. 2 Subcultured seedlings under 3.0 mg/L 6-BA

圖3 繼代苗(處理9)Fig. 3 Subcultured seedlings (Treatment 9)

2.4 激素組合對組培苗生根的影響

在繼代瓶苗中選擇高度3～4 cm、2～3片葉、莖干粗壯的單芽插入添加不同激素的改良1/2 MS培養(yǎng)基中，接種25 d后生根率、始發(fā)根時間、平均生根數(shù)、根系長度及生長狀況見表5。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加激素時，幼苗不生根；單獨(dú)添加一種激素時，幼苗生根率均低于60%；添加高質(zhì)量濃度（1.0 mg/L）IBA或IAA時，根系生長狀況較差，容易先形成愈傷后發(fā)根。因此，生根培養(yǎng)基中同時添加兩種激素有利于幼苗生根和生長，且添加激素濃度不宜過高。處理5的幼苗生根率和平均生根數(shù)最高，始發(fā)根時間最早，且平均根長最長（見圖4）；處理8的生根率、平均生根數(shù)和根長均僅次于處理5，兩者差異未達(dá)到顯著水平（P＜0.05），但其根基略帶愈傷，生長狀況明顯差于處理5。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，最適宜黃樟組培苗生根的培養(yǎng)基為改良1/2 MS+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA。

表5 不同質(zhì)量濃度IBA和IAA組合對黃樟組培苗生根的影響Table 5 Effects of different combinations of IBA and IAA on the rooting of cultured seedlings

圖4 黃樟組培生根苗(25 d)Fig. 4 Rooting culture of C. porrectum (25 d)

3 結(jié)論與討論

植物的組織培養(yǎng)技術(shù)能夠保持母本的優(yōu)良性狀，是大量繁殖和保存珍稀、瀕危、芳香和藥用植物種質(zhì)資源的有效途徑[10-11]。一般情況下，直接誘導(dǎo)外植體不定芽發(fā)生與誘導(dǎo)愈傷再分化相比，誘導(dǎo)不定芽芽體健壯，且組培苗變異程度低[12-13]。常新民等[14]的研究表明，用組培繁殖的芳樟醇型樟的葉精油含量和成分基本保持親本的特性，而用種子繁殖則發(fā)生較大的變異。本研究首次以帶腋芽莖段為外植體建立離體快繁體系，且以莖段、莖尖誘導(dǎo)不定芽的方式進(jìn)行繁殖，此方法是保持黃樟母本性狀的有效途徑，擴(kuò)繁的后代遺傳性狀較為穩(wěn)定。

本研究表明，5種基本培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)黃樟腋芽的萌發(fā)，但是在1/2MS、MS基本培養(yǎng)基中出現(xiàn)莖尖生長死亡，或停止生長情況；這兩種基本培養(yǎng)基中含鈣量較低，較低的Ca2+濃度加上培養(yǎng)容器內(nèi)高濕環(huán)境，易造成Ca2+供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致腋芽生長不良。這與其他一些木本植物組織培養(yǎng)時缺鈣時的表現(xiàn)一致，如加拿大紫荊Cercis canadensis、黃連木Pistacia chinensis、俄羅斯矮杏Prunus tenella等，培養(yǎng)基中較低濃度的Ca2+容易造成植物頂部葉片邊緣發(fā)黑、卷曲，嚴(yán)重時會導(dǎo)致莖尖死亡[15-17]。B5培養(yǎng)基中苗木生長出現(xiàn)玻璃化的原因是由于此培養(yǎng)基中K+含量高，容易引起莖段內(nèi)外散透壓不平衡，從而造成水分吸收過多，引起苗木玻璃化，呈現(xiàn)水漬狀。ER培養(yǎng)基種苗木生長出現(xiàn)畸形可能是由于培養(yǎng)基中較低的微量元素濃度較低，對黃樟的細(xì)胞分化和形態(tài)生成產(chǎn)生很大影響，從而出現(xiàn)畸形苗。改良MS培養(yǎng)基在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上增加0.2 g/L Ca(NO3)2·4H2O，NH4NO3濃度降低至0.8 g/L，相對于其他培養(yǎng)基，降低了NH4+濃度，形成了適宜黃樟腋芽生長的NO3-/NH4+濃度比。另外，改良MS培養(yǎng)基中增加了Ca2+濃度，為黃樟蒸騰流內(nèi)供應(yīng)新鮮的Ca2+來源，有利于消除莖枝矮化和?；F(xiàn)象，因此苗木生長更健壯。

植物生長激素的種類和水平對其生長發(fā)育起到關(guān)鍵作用，組織培養(yǎng)中添加一定的外源激素有利于外植體的分化和增殖，促進(jìn)不定根的誘導(dǎo)[18]。在黃樟莖段的培養(yǎng)過程中，本試驗(yàn)首先對外源細(xì)胞分裂素及生長素進(jìn)行初步篩選，通過對比6-BA、ZT、KT、NAA、IAA 5種激素對黃樟不定芽誘導(dǎo)的影響，6-BA對不定芽的誘導(dǎo)起到主要作用，添加6-BA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽率明顯高于ZT、KT，結(jié)果與李乾振等試驗(yàn)過程采用ZT、KT取代6-BA對樟的不定芽誘導(dǎo)效果及芽苗質(zhì)量均不如6-BA的結(jié)果是一致的[19]。適宜黃樟不定芽增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基為改良MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA，采用激素的種類和濃度范圍與鄭紅建對樟的莖段不定芽增殖培養(yǎng)的研究結(jié)果一致[20]。本研究在繼代過程中發(fā)現(xiàn)，不定芽基部切口位置易形成大量的膨大白色愈傷組織，隨繼代次數(shù)增加愈傷組織由白色或淡黃色向黑色逐步轉(zhuǎn)變，3～4代后黑色覆蓋整個基部并向周圍擴(kuò)散，芽體褐化且分化受阻，已分化的芽體生長不良（見圖5）。產(chǎn)生此現(xiàn)象是愈傷組織褐化阻礙營養(yǎng)供給還是次生代謝物對器官組織具有毒害作用，有待于進(jìn)一步研究和探討，這與官錦燕等研究牛樟組織培養(yǎng)與植株再生出現(xiàn)情況一致[21]。本研究在繼代轉(zhuǎn)接時采取切除愈傷組織的辦法，防止黃樟愈傷褐化對芽體繁殖帶來傷害，在一定程度上降低了黃樟擴(kuò)繁速度，增加了育苗成本，為黃樟工廠化生產(chǎn)帶來一定影響。在以后的研究中，有待進(jìn)一步尋求愈傷發(fā)生抑制劑及防褐化吸附劑來優(yōu)化繼代培養(yǎng)基配方。

圖5 不定芽基部愈傷褐化(繼代多次)Fig. 5 Browning on the bottom of cluster buds(subcultured after several times)

莖芽生根是植物實(shí)現(xiàn)快繁的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)和瓶頸問題，組培苗生根效果的好壞直接影響其移栽成活率，而植物組培過程中，激素的種類和濃度是影響組培苗生根的重要因素[22]。吳幼媚等在樟的組培快繁生根階段發(fā)現(xiàn)，一定濃度的IAA和IBA組合有利于組培苗的生根[23]，本研究用改良MS培養(yǎng)基添加IBA和IAA，通過不同質(zhì)量濃度篩選出適宜組培苗生根的最佳激素組合為 0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA。經(jīng)觀察，黃樟組培苗生根與其莖枝的生長狀態(tài)有一定關(guān)聯(lián)，莖枝桿粗壯和葉多、大的組培苗生根所需時間短，根系數(shù)量多且一致性強(qiáng)，這是由于組培苗木質(zhì)化程度高的莖枝分生能力強(qiáng)、生長速度快，光合能力、抗蒸騰能力和適應(yīng)能力強(qiáng)。因此，黃樟組培誘導(dǎo)生根時應(yīng)選用生長粗壯、葉生長量大、莖稈紅色的莖枝，小枝、弱枝可經(jīng)壯苗后備用。

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