鄧正煒，張亞東，趙世昌

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200120；2.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院南院骨科，上海 201400；3.上海市第六人民醫(yī)院骨創(chuàng)傷外科，上海 200030)

低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是組織細(xì)胞在低氧狀態(tài)下激活相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的核心調(diào)節(jié)因子之一，在骨發(fā)育和代謝過程中起到十分關(guān)鍵的作用。現(xiàn)將激活HIF1-α信號(hào)通路的方法、作用機(jī)制和潛在應(yīng)用價(jià)值加以綜述。

1 低氧誘導(dǎo)因子-1α與骨代謝

組織細(xì)胞缺血、缺氧狀態(tài)下表達(dá)的HIF-1α是誘導(dǎo)低氧基因和維持細(xì)胞內(nèi)氧環(huán)境穩(wěn)定的核心轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控血管生成、炎性細(xì)胞及干細(xì)胞歸巢、細(xì)胞分化、糖代謝等眾多生理病理反應(yīng)[1]。機(jī)體內(nèi)多數(shù)組織器官在生理?xiàng)l件下都維持20%左右的氧分壓，而骨骼及骨髓腔處的低氧狀態(tài)的氧分壓只有1%～7%，因此骨骼內(nèi)的多種細(xì)胞在生理狀態(tài)下都表達(dá)為HIF-1α[2]。HIF-1α通過調(diào)控下游的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、促血管新生蛋白因子-2(angiopoietin-2)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)等一系列靶標(biāo)因子從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血管形成過程進(jìn)行調(diào)控。在正常氧分壓的情況下，HIF-1α被低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶(hypoxia inducible factor proline hydroxylase，HIF-PH)羥基化，從而使其泛素化并降解，在缺氧情況下，HIF-PH被抑制使得HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)積累進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生命活動(dòng)。常規(guī)HIF-PH抑制劑可以抑制HIF-PH活性進(jìn)而激活HIF-1α促進(jìn)細(xì)胞的募集、分化和血管形成[3]。

首先，HIF-1α高表達(dá)可以提供良好的血供和充分的氧氣，促進(jìn)VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)血管的生長(zhǎng)，也有利于促進(jìn)骨生長(zhǎng)的部分細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)因子的分泌。HIF-1α對(duì)血管誘導(dǎo)作用和對(duì)干細(xì)胞歸巢引導(dǎo)作用具有強(qiáng)控制力，可以從根本上改善骨折周圍軟組織的生長(zhǎng)條件。HIF-1α在低氧信號(hào)中是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，能夠增加和調(diào)節(jié)氧含量和營(yíng)養(yǎng)代謝從而維持能量和氧化還原平衡[4]。同時(shí)，激活HIF-1α促進(jìn)骨代謝的臨床和動(dòng)物模型中，組織工程骨(tissue engineering bone，TEB)因其特性突出、可修飾性強(qiáng)等特點(diǎn)而廣泛被研究應(yīng)用[5]。目前，常見的激活HIF-1α通路的方法包括：HIF-PH抑制劑植入、基因干預(yù)、材料功能性(孔徑大小、表面修飾、組織相容性、生物降解性[6]、力學(xué)強(qiáng)度等)改造、3D打印技術(shù)和中醫(yī)藥干預(yù)等。

2 激活HIF-1α通路促進(jìn)骨修復(fù)在骨組織工程中的應(yīng)用

激活HIF-1α通路可以促進(jìn)骨代謝及骨修復(fù)。激活HIF-1α最常見的方法為使用HIF-PH抑制劑，它們包括CoCl2、去鐵胺(deferoxamine，DFO)[7]、二甲基乙二酰氨基乙酸(dimethyloxallyl glycine，DMOG)、含羞草素(L-mimosine，L-mim)[8]等。目前研究顯示，銅離子植入、基因的敲低或過表達(dá)、組織工程骨的加工和藥物添加等方式均可一定程度上提高HIF-1α表達(dá)。激活HIF-1α的方法包括以下幾類。

2.1 HIF-PH抑制劑

2.1.1 鈷離子(Co2+) 介孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glass，MBG)添加鈷離子(Co2+)可以激發(fā)支架對(duì)低氧做出反應(yīng)。Quinlan等[9]將MBG分別與鈷(Co2+)一起并入玻璃網(wǎng)絡(luò)中制備了復(fù)合型Co2+/MBG/膠原蛋白-粘多糖支架，能顯著增強(qiáng)VEGF的生成和表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管形成。Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)Co-MBG復(fù)合生物支架顯著提高了VEGF蛋白的分泌，提高了HIF-1α、骨相關(guān)基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)中的表達(dá)，促進(jìn)了BMSCs的附著和增殖。同時(shí)Co2+肌肉注射也可以激活生命體對(duì)低氧做出反應(yīng)[11]。Huang等[12]用CoCl2/生理鹽水腹膜全身給藥處理脛骨骨折的大鼠，發(fā)現(xiàn)CoCl2顯著促進(jìn)骨折愈合、提高機(jī)械強(qiáng)度并增強(qiáng)骨折活體修復(fù)——CoCl2處理大鼠的HIF-1α、VEGF、runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor，2RUNX2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)在mRNA/蛋白質(zhì)水平表達(dá)提高。各類研究表明，Co2+可以通過抑制HIF-PH活性進(jìn)而顯著提高血管生成基因、成骨基因表達(dá)和OCN、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的分泌以及類管狀細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的形成，從而促進(jìn)骨修復(fù)。

2.1.2 DFO DFO作為常用的HIF-PH抑制劑，體內(nèi)和體外均可以在不依賴氧濃度的條件下提高HIF-1α表達(dá)，促使機(jī)體對(duì)低氧作出反應(yīng)。Chen等[13]研究表明，大部分水凝膠纖維支架可在14d內(nèi)降解完全，并可持續(xù)釋放DFO 72h，DFO通過Fe2+螯合物作用減弱HIF-PH活性，使得HIF-α表達(dá)上調(diào)明顯增加新血管化、細(xì)胞增殖和血管形成。Li等[14]將成熟雄性激素性股骨頭壞死(steroid-induced necrosis of the femoral head，ONFH)新西蘭白兔隨機(jī)分為雙側(cè)核減壓組、局部DFO給藥組和對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)DFO組的HIF-1α、VEGF、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、OCN的表達(dá)都較其他組高，改善了新生骨體積和血管分布。Jia等[15]將含有DFO的聚乳酸羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)支架移植到嚴(yán)重骨質(zhì)疏松性股骨缺損/正常人中，發(fā)現(xiàn)DFO增強(qiáng)了MSCs的成骨分化，上調(diào)了MSCs中血管生成因子的mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的血管生成——DFO通過激活HIF-1α信號(hào)通路可促進(jìn)MSCs的成骨分化和血管生成從而加速骨質(zhì)疏松性骨缺損的愈合?？傊珼FO能夠通過Fe2+螯合物作用減弱HIF-PH活性，使得HIF-α表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)骨修復(fù)。

2.1.3 DMOG DMOG能顯著增強(qiáng)骨相關(guān)基因的表達(dá)并促進(jìn)血管生成活性。Zhu[16]和Ding[17]等發(fā)現(xiàn)DMOG通過激活HIF-1α的表達(dá)，顯著地增加了脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)中VEGF的生成，并提高了ADSCs的成骨分化潛能，增強(qiáng)了ADSCs的血管生成和成骨活性，明顯改善了壞死區(qū)的血管化和骨再生。Woo等[18]在MC4前成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，DMOG和丁酸合成產(chǎn)物協(xié)同增強(qiáng)前成骨細(xì)胞應(yīng)答和成骨細(xì)胞分化，加速骨再生的過程——這主要與α硫酸鈣增加了HIF-1α、VEGF、BSP等表達(dá)相關(guān)。Zhang等[19]在DMOG處理的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)持續(xù)激活的HIF-1α，顯著增強(qiáng)了人類多功能干細(xì)胞-MSCs(human pluripotent stem cells，hiPSC-MSCs)中血管生成相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)，這主要與DMOG通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B通路有關(guān)。類似地，Peng等[20]發(fā)現(xiàn)DMOG增強(qiáng)了MSC成骨分化通過激活HIF-1α從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)?？傊?，DMOG能夠在MBG支架中抑制HIF-PH活性，顯著誘導(dǎo)HIF-1α、VEGF和骨相關(guān)基因表達(dá)，從而促進(jìn)骨修復(fù)。

2.1.4 L-mim L-mim是HIF-PH抑制劑，可以激活HIF-1α通路，從而提供良好的血供和充分的氧氣，促進(jìn)VEGF、成骨相關(guān)細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而有效促進(jìn)骨組織修復(fù)。Janjic等[21]對(duì)人類牙髓原代細(xì)胞進(jìn)行單層、球狀培養(yǎng)來探討L-mim對(duì)牙髓再生的影響，發(fā)現(xiàn)L-mim通過激活HIF-1α增加了血管生成素樣4(angiopoietin-like 4，Angptl4)、血管生成素在蛋白水平的合成和Angptl4在mRNA水平的表達(dá)。Warnecke等[22]在血管生成的海綿模型中，局部反復(fù)注射L-mim可顯著增加組織由邊緣向中心血管化的趨勢(shì)，體外和體內(nèi)試驗(yàn)均說明了L-min可通過影響林希氏基因(von Hippel-Lindau，pVHL)來誘導(dǎo)激活HIF-1α促進(jìn)血管化進(jìn)而快速適應(yīng)缺氧環(huán)境，為缺損骨組織局部提供良好的血供及營(yíng)養(yǎng)，可以有效促進(jìn)骨修復(fù)。

2.1.5 銅離子(Cu2+)及其化合物 銅、鈷作為第八元素具有類似的化學(xué)性質(zhì)，Cu2+是否具有與Co2+相似的性質(zhì)引起了廣泛關(guān)注。Wu等[23]將Cu2+植入大孔和有序中間孔道的MBG中，制備了兩種Cu-MBG支架。在人類BMSCs中，發(fā)現(xiàn)兩種Cu-MBG和它們的離子萃取物均可以刺激HIF-1α和VEGF表達(dá)；并改善ALP、OPN和OCN等的表達(dá)，促進(jìn)了人類BMSCs的成骨分化。Zhang等[24]采用粒徑約30納米的結(jié)晶氧化銅/氧化亞銅納米離子得到水溶性石墨烯氧化銅納米復(fù)合材料(GO-Cu)，并將GO-Cu作用于覆蓋多孔的磷酸鈣支架，制備了表面分布均勻、持續(xù)釋放Cu2+的復(fù)合支架。體外實(shí)驗(yàn)表明，GO-Cu涂層增強(qiáng)了大鼠BMSCs的附著力和成骨分化；并通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶1/2信號(hào)通路上調(diào)BMSCs中HIF-1α的表達(dá)，從而促進(jìn)VEGF和BMP-2的分泌，增加了血管生成和成骨形成，進(jìn)一步促進(jìn)骨修復(fù)。

2.1.6 其他金屬離子及其化合物 Xiang等[25]采用鈰氧化物納米顆粒(cerium oxide nanoparticles，CNPs)修飾TEB支架，發(fā)現(xiàn)CNPs可以提高細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞膜與納米粒子表面相互作用可以激活MSCs的鈣通道，提高細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量，增強(qiáng)了HIF-1α的穩(wěn)定性，進(jìn)而加強(qiáng)VEGF表達(dá)。同時(shí)，VEGF旁分泌可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的增殖、分化和管腔形成，顯著改善TEB體內(nèi)的血管分布。Li等[26]通過加入鋰(Li)制作了多孔凝膠/納米鋰-羥基磷灰石/明膠微粒/(Li-nHA/GMs/rhEPO)支架，該支架具有良好的機(jī)械抗壓強(qiáng)度，能夠連續(xù)控制Li和重組促人紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)的釋放，改善糖皮質(zhì)激素治療后BMSCs和血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，增加成骨細(xì)胞和血管生成因子的表達(dá)，通過激活Wnt信號(hào)通路從而上調(diào)HIF-1α/VEGF的表達(dá)。已知的一些金屬離子及化合物可以通過增強(qiáng)并上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，對(duì)其下游基因進(jìn)行調(diào)控從而促進(jìn)骨修復(fù)；其他未知的是否也具有類似的功能還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.2 基因改造 在骨骼發(fā)育的過程中，通過細(xì)胞非自治機(jī)制激活骨骼模型，可協(xié)調(diào)骨形成的時(shí)間、方向和程度。Chen等[27]將SOX-9基因(sry related high-mobility group box gene-9，SOX-9)轉(zhuǎn)染入三維漸進(jìn)多孔聚乳酸-聚乙醇酸共聚物PLGA，形成PLGA/Sox-9復(fù)合支架，該支架協(xié)同上調(diào)HIF-1α表達(dá)，刺激了ADSCs的軟骨分化，從而使得ADSCs獲得了與軟骨細(xì)胞相關(guān)的生物學(xué)特性。Wang[28]和Wan等[29]研究表明，選擇性刪除pVHL基因?qū)崿F(xiàn)了老鼠體內(nèi)HIF-1α高表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)了VEGF高表達(dá)，明顯促進(jìn)了高密度、血管化長(zhǎng)骨的形成。Zou等[30]采用基因點(diǎn)突變法將基因Lenti-CA5、Lenti-WT(野生型，HIF-1α)和Lenti-LacZ轉(zhuǎn)染植入大鼠BMSCs中，構(gòu)造了一種有效的HIF-1α(CA5)的活性形式，并與鈣鎂磷酸水泥支架結(jié)合在一起，以修復(fù)大鼠的顱蓋骨缺陷。結(jié)果表明，HIF-1α的過表達(dá)顯著促進(jìn)了成骨標(biāo)志相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)具有局部高密度的強(qiáng)健新骨形成。最近的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，對(duì)HIF-1α通過相關(guān)的基因或靶點(diǎn)進(jìn)行基因的敲低或過表達(dá)是一種有效的激活HIF-1α手段，但機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

2.3 材料功能性改造 支架自身強(qiáng)度可以保持較高的孔隙度進(jìn)而對(duì)低氧缺氧作出反應(yīng)，并激活許多支持血管生成的基因[10]。有序的介孔通道結(jié)構(gòu)和高比表面能夠有效地傳輸抗生素藥物進(jìn)而提高抗生素的生物利用率[11，28]。材料不同的MBG支架可以通過化學(xué)鍵作用實(shí)現(xiàn)對(duì)HIF-PH抑制劑的持續(xù)釋放來降低細(xì)胞毒性、延長(zhǎng)其半衰期，激活HIF-1α并誘發(fā)后續(xù)的血管生成。同時(shí)，3D打印技術(shù)通過對(duì)生物材料的分層精確堆積可以控制外形、調(diào)節(jié)內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)、大小、分布達(dá)到有利于骨形成的效果和解決移植的孔隙率和血管化問題。Zhang等[31]通過3D打印和旋轉(zhuǎn)涂層成功制備的介孔MBG修飾-β-磷酸三鈣(MBG-β-TCP)支架，具有分層孔隙結(jié)構(gòu)和功能支撐表面，明顯增強(qiáng)MBG-β-TCP支架的抗壓強(qiáng)度和礦化能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，該復(fù)合支架可提升兔BMSCs的成骨相關(guān)基因表達(dá)和蛋白分泌；同時(shí)也可以提高了HUVECs的附著和血管生成相關(guān)基因表達(dá)?？傊牧瞎δ苄愿脑炜梢约せ頗IF-1α和其他相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨修復(fù)。

2.4 中醫(yī)藥 最近研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可以激活HIF-1α從而影響缺血性相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展。紅景天[32]激活HIF-1α進(jìn)而誘導(dǎo)EPO表達(dá)來調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)缺氧的反應(yīng)；木通皂苷[33]上調(diào)HIF-1α/VEGF通路促進(jìn)血管生成和傷口愈合；梓醇和葛根素[34]上調(diào)細(xì)胞外蛋白調(diào)節(jié)激酶/磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白/HIF-1α信號(hào)通路來達(dá)到減少梗死體積、保護(hù)血管完整性和抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的效果；芪參益氣滴丸[35]能夠下調(diào)miR-223-3p從而抑制核糖體S6蛋白激酶抗體/HIF-1α信號(hào)通路來促進(jìn)缺血心肌血管生成的能力。隨著研究的進(jìn)一步深入，HIF-1α的作用也不斷被闡釋。Wu等[36]在探討再生障礙性貧血患者的骨髓間血管生成的差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)“陰虛證”患者與“陽虛證”患者相比，VEGF和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)表達(dá)降低，而HIF-1α表達(dá)升高。Yuan等[37]在研究補(bǔ)腎通絡(luò)湯對(duì)血管生成和骨吸收的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎通絡(luò)湯顯著降低了在股骨干骺端降鈣素受體和組織蛋白酶K的mRNA和蛋白水平，并抑制了卵巢切除大鼠的骨吸收。在動(dòng)物模型中，補(bǔ)腎通絡(luò)湯降低了骨質(zhì)疏松癥的破骨細(xì)胞活化和骨吸收主要與激活HIF-1α增加VEGF表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管生成功能和抑制NF-κB配體(RANKL/OPG)信號(hào)通路有關(guān)。中醫(yī)藥在促進(jìn)骨修復(fù)自古有之，近代研究發(fā)現(xiàn)激活HIF-1α通路是中醫(yī)藥促進(jìn)骨修復(fù)有利證據(jù)，但這只是作用機(jī)制中的冰山一角，更多的作用途徑有待挖掘。

3 結(jié)論與展望

組織工程骨可以通過激活HIF-1α改善其血液灌注不足進(jìn)而促進(jìn)骨代謝/修復(fù)。HIF-HP抑制劑、基因改造、材料粒徑、結(jié)構(gòu)改變、功能性表面修飾和中醫(yī)藥的使用等均可激活HIF-1α，從而促進(jìn)一系列血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)，通過改善血管舒張、血管滲透性、內(nèi)皮細(xì)胞出芽、增殖、遷移等方式促進(jìn)骨再生。HIF-PH抑制劑激活HIF-1α通路目前研究最為普遍，但存在著作用機(jī)制不全面、系統(tǒng)性不強(qiáng)和臨床證據(jù)不足的缺陷；同時(shí)基因改造技術(shù)作為前沿技術(shù)有待進(jìn)一步研究和臨床驗(yàn)證。

復(fù)合骨支架通過激活HIF-1α促進(jìn)骨修復(fù)只是骨組織工程的一種途徑，但其過程卻涵蓋了骨修復(fù)和成血管化的多個(gè)方面，其作用十分關(guān)鍵。根據(jù)骨損傷的具體情況和患者的經(jīng)濟(jì)情況選擇合適的生物支架，骨損傷有望做到個(gè)性化的治療，因人制宜。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和個(gè)性化治療的顯著特點(diǎn)，目前研究從一定程度上揭示了其可以激活HIF-1α促進(jìn)骨代謝，但中醫(yī)藥治療存在臨床應(yīng)用實(shí)例不足等問題、以及在對(duì)激活HIF-HP抑制劑從而誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)的作用機(jī)制方面仍不明確，這可以作為未來研究的重要切入點(diǎn)。