文/周慶民 徐 馨* 馮萬宇 張 艷 寧秀云

（1 黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所；2 訥河市動物防疫站）

奶牛乳房炎是目前奶牛養(yǎng)殖業(yè)中危害最嚴(yán)重、造成損失最大的疾病之一[1～3]，嚴(yán)重阻礙奶牛業(yè)健康發(fā)展，危及人類食品安全[4～6]。奶牛乳房炎發(fā)病率高，發(fā)生范圍廣泛[7～9]。奶牛乳房炎發(fā)病初期，臨床癥狀不明顯，眼觀無法判斷[10～12]，但乳汁中體細(xì)胞增多，通過對乳汁中體細(xì)胞數(shù)的檢測可以診斷奶牛乳房炎是否發(fā)生，做到早期發(fā)現(xiàn)，及時治療[13，14]。多年以來，對奶牛乳房炎早期診斷研究很多[15～21]，相應(yīng)研究出來很多方法，但都存在不足，為了更準(zhǔn)確、更快速、更方便地診斷出早期奶牛乳房炎，進(jìn)行了深入詳細(xì)的研究，研制了奶牛乳房炎早期診斷試劑盒，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

材料：乳汁采自齊梅生物科技股份有限公司良種乳牛繁育基地。

試劑：甲基綠（購自廣州威佳科技有限公司）、碘化鉀（購自濟(jì)南嘉?；び邢薰荆⒈姿幔ㄙ徸蕴旖蚴泻闩d化學(xué)試劑制造有限公司）、醋酸鈉（購自南方醫(yī)科大學(xué)試劑中心）。

1.2 試劑盒的制備

1.2.1 裂解液的制備

配置5 mol/L的碘化鉀（KI）溶液作為細(xì)胞裂解液，直接、快速裂解體細(xì)胞及其核膜，釋放DNA。

1.2.2 染色液的制備

醋酸鹽緩沖液（pH值4.8）：取冰醋酸2.4 mL，醋酸鈉8.16 g，溶解于498 mL蒸餾水，配置成0.2 mol/L的醋酸鹽緩沖液。

甲基綠染色液的制備：取上述醋酸鹽緩沖液400 mL，加入精密稱取的甲基綠粉末8 g，充分溶解，配置成2%甲基綠染色液。

1.2.3 檢測方法

以移液槍吸取待檢奶牛乳汁樣品50 μL，加入100 μL KI裂解液，靜置2 min后加入甲基綠染色液，3 min后比對比色卡，根據(jù)待檢樣品顏色判定奶牛體細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 判斷結(jié)果

依照1.2.3檢測方法操作后，對乳樣進(jìn)行結(jié)果判定，判定結(jié)果見表1。

1.2.5 試劑盒的保存期檢測

將同一批次制備的奶牛乳房炎早期診斷試劑盒39 個，各取半數(shù)分別置于4 ℃和室溫狀態(tài)下保存，每月分別取1 個試劑盒，對己知陰性（－）、弱陽性（+）和強(qiáng)陽性（+++）乳汁樣品進(jìn)行判定，以確定試劑盒的最佳保存條件和保存期限。

1.2.6 試劑盒的可重復(fù)性（穩(wěn)定性）試驗(yàn)

取8 種不同批次（批號分別為160211、160311、160411、160511、160611、160711、160811、160911）的密閉試劑盒各兩盒，對己知陰性（－）、弱陽性（+）和強(qiáng)陽性（+++）乳汁樣品進(jìn)行檢測，驗(yàn)證同批次（批內(nèi)）和不同批次（批間）制備的試劑盒判定的試驗(yàn)結(jié)果是否具有可重復(fù)性（穩(wěn)定性）。

表1 判定結(jié)果

表2 保存期檢測試驗(yàn)結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 保存期檢測試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)的0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 天分別取同一批次同時保存的密封試劑盒，對己知陰性（－）、弱陽性（+）和強(qiáng)陽性（+++）乳汁樣品進(jìn)行檢測，判定的試驗(yàn)結(jié)果與已知陰性、陽性比對，結(jié)果見表2。由表可知，無論室溫還是4℃保存的試劑盒360 天內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，故而保質(zhì)期定為1 年。

2.2 穩(wěn)定性檢測試驗(yàn)結(jié)果

取批次160211、160311、160411、160511、160611、160711、160811、160911的密閉試劑盒各兩盒，對己知陰性（－）、弱陽性（+）和強(qiáng)陽性（+++）乳汁樣品進(jìn)行檢測，判定的試驗(yàn)結(jié)果與已知陰性、陽性比對，結(jié)果見表3。由表可知，無論相同批次還是不同批次的試劑盒保質(zhì)期內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果均準(zhǔn)確，說明該試劑盒檢測結(jié)果可重復(fù)，試劑盒穩(wěn)定性較高。

3 討論

3.1 甲基綠對DNA能夠染色，其染色后顯色的程度反映出DNA的量，DNA的量又反映出乳汁中體細(xì)胞的數(shù)量，乳汁中體細(xì)胞的數(shù)量又反映出奶牛乳房炎發(fā)生的程度，因此，本試驗(yàn)甲基綠染色的顏色也會由淺到深變化，這樣可以根據(jù)顏色變化程度而判斷乳汁中體細(xì)胞數(shù)量范圍，以及奶牛乳房炎發(fā)生程度。

3.2 KI溶液是一種常用化學(xué)試劑，很穩(wěn)定；甲基綠在醋酸鹽緩沖液作用下，也十分穩(wěn)定，因此，這兩種診斷液可長時間保存并保持穩(wěn)定，其對奶牛乳汁中體細(xì)胞的DNA作用穩(wěn)定，在4 ℃或室溫狀態(tài)下長期保存判斷結(jié)果一致。

4 結(jié)論

奶牛乳房炎早期診斷試劑盒的制備原理，是以KI裂解乳汁中體細(xì)胞細(xì)胞膜及其核膜，釋放出DNA，然后利用甲基綠染料對DNA進(jìn)行染色，通過染色后顯色的綠色深淺正反饋DNA含量的多少，從而反映乳汁中體細(xì)胞數(shù)量的多少，進(jìn)而快速判定出奶牛乳房炎發(fā)生的程度。

表3 穩(wěn)定性檢測試驗(yàn)結(jié)果（n=2）

試劑盒操作簡便、判定迅速，5 min即可判斷出結(jié)果；便于攜帶和現(xiàn)場應(yīng)用，為檢測和防控乳房炎提供了一種新的方法和手段。另外，該試劑盒保質(zhì)期長，穩(wěn)定性好。通過4 ℃和常溫條件下的長期保存，證實(shí)該試劑盒判定結(jié)果與已知樣品一致，且4 ℃和常溫下均可保質(zhì)1 年以上。

以碘化鉀法直接裂解體細(xì)胞DNA，快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、高效。但應(yīng)注意裂解后必須及時染色和判定，因?yàn)闀r間過長會容易引起DNA降解。因此裂解后要及時染色和判定，避免時間過長影響試驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致樣品染色顏色偏淺，造成假陰性和嚴(yán)重程度誤判。

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