張凱鵬 楊秀娟 張 琳 陳纘光*

1(中山大學(xué)藥學(xué)院， 廣州 510006) 2(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510282) 3(廣東省生物工程研究所，廣州 510316)

1 引 言

檢測(cè)器是色譜儀器最重要的組成部分之一。非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器最初應(yīng)用于毛細(xì)管電泳[1,2]，后來在微流控芯片分析中發(fā)展迅速[3]。它對(duì)荷電和極性物質(zhì)有很好的響應(yīng)，且成本低、穩(wěn)定性好、易于與其它檢測(cè)器聯(lián)用，因此備受關(guān)注。

2006年，電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)開始用于高效液相色譜，Kuban等[4]建立了氨基酸、非甾體抗炎藥和β受體阻斷劑等幾類物質(zhì)的測(cè)定方法。此后的研究報(bào)道包括肽[5]、大環(huán)聚羧酸酯衍生物[6]、脂肪酸[7]的分析等。Mark 等[8]比較了兩種用于高效液相色譜電容耦合非接觸電導(dǎo)的檢測(cè)池。然而，這些研究都采用商業(yè)化檢測(cè)器，通常需要制作檢測(cè)池，通過特殊的接頭才能實(shí)現(xiàn)與液相色譜的連接[9]，使用不便，且不利于后續(xù)維護(hù)。而聚醚醚酮(Polyetheretherketone，PEEK)管直接穿過的電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)單元便于與液相色譜連接，且易于更換，成本較低，應(yīng)用前景廣闊。Gillespie 等[10]曾使用PEEK管直接穿過非接觸電導(dǎo)檢測(cè)池，但未對(duì)影響儀器性能的參數(shù)(電極間距、電極長度、PEEK管內(nèi)徑等)[11,12]做詳細(xì)探討。目前，關(guān)于高效液相色譜電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器的研究報(bào)道較少。

鴉膽子油是一種中藥抗癌輔助藥，為細(xì)胞周期非特異性抗癌藥[13～15]，其主要抗癌活性成分是油酸和亞油酸。油酸和亞油酸均具有長碳鏈結(jié)構(gòu)，末端含羧基，在鴉膽子油中主要以脂肪酸甘油酯的形式存在，為弱紫外吸收物質(zhì)。傳統(tǒng)方法如高效液相色譜柱前衍生化法[16]、蒸發(fā)光散射法[17]等均有其各自缺點(diǎn)，如操作過程繁瑣、影響因素多，不利于油酸和亞油酸的準(zhǔn)確定量分析。

本研究采用自制的高效液相色譜電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鴉膽子油有效成分的分離檢測(cè)，為此類中藥制劑有效成分的質(zhì)量控制提供了一種新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Waters plus 717高效液相色譜儀(美國Waters公司); C18BP色譜柱(200 mm×4.6 mm， 5 μm，大連依利特公司); C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm， 5 μm，天津三維公司); FA1004分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司); ZB-2020色譜工作站(四川知本分析科技有限公司); SB-5200 DTDN超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。聚醚醚酮連接管(外徑均為1.57 mm，內(nèi)徑: 0.13、0.25、0.50、0.75和1.00 mm，常州優(yōu)沃世塑料制品有限公司)。所有電子元器件均購自廣州天河賽格數(shù)碼電子城。

十二烷基磺酸鈉(SDS)、 油酸以及亞油酸分析標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.9%, 上海晶純生化科技股份有限公司); 甲醇、乙腈(色譜純, 美國BCR試劑有限公司); 鴉膽子油軟膠囊(華潤三九(南昌)藥業(yè)有限公司); 醋酸鈉(NaAc，分析純，天津市百世化工有限公司); NaOH(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。 實(shí)驗(yàn)用水為超純水, 由Millipore純水儀(美國Millipore公司)制備。流動(dòng)相使用前超聲30 min，所有樣品均需經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后進(jìn)樣。

2.2 溶液制備

2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制準(zhǔn)確稱取十二烷基磺酸鈉對(duì)照品10 mg，以10%乙腈溶液溶解并定容至10 mL。準(zhǔn)確稱取油酸、亞油酸對(duì)照品各10 mg，加入1 mL 0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液，用90%甲醇溶解并定容至10 mL。所有對(duì)照品溶液均在4℃條件下保存，用時(shí)根據(jù)需要稀釋至所需濃度。

2.2.2鴉膽子油溶液的皂化精確稱取鴉膽子油20 mg， 置于5 mL玻璃小瓶中， 加入0.5 mol/L NaOH甲醇溶液1 mL， 蓋上蓋子， 置于鼓風(fēng)干燥箱中60℃反應(yīng)30 min后取出， 用90%甲醇溶解并定容至10 mL， 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 液相色譜分離條件

C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm， 5 μm)，流動(dòng)相： 甲醇-乙腈-1 mmol/L醋酸鈉溶液(50∶30∶20,V/V); 柱溫: 25℃; 流速: 1.0 mL/min; 進(jìn)樣量: 20 μL。

2.4 電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器的制作

圖1 高效液相色譜-電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)裝置示意圖(A)檢測(cè)控制單元; (B) 電極盒內(nèi)部構(gòu)造; (C) 非接觸電極; a. 信號(hào)放大調(diào)節(jié)器; b.激發(fā)頻率調(diào)節(jié)器; c. 激發(fā)電壓調(diào)節(jié)器; d. 基線調(diào)節(jié)器; e. 電源開關(guān); f.色譜柱; g. PEEK 連接頭; h.信號(hào)屏蔽線; j,p. PEEK連接管; k. 屏蔽電路; l. 激發(fā)電極; m. 接收電極;n.信號(hào)插頭Fig.1 Schematic illustration of HPLC-C4D system(A) detector control unit; (B) inside view of contactless electrodes; (C) contactless electrodes box; a. amplifier adjuster; b. excitation frequency adjuster; c. excitation voltage adjuster; d. baseline adjuster; e. power switch; f. chromatographic column; g. PEEK junction fitting; h .shielding wire; j,p. changeable PEEK tubing; k. ground circuit; l. excitation electrode; m. pick-up electrode; n. sockets.

如圖1所示，所研制的電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器由信號(hào)發(fā)生器、電極套管、接收放大器等組成。信號(hào)發(fā)生器和接收放大器等與本研究組曾研制的電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器相似[18]。信號(hào)發(fā)生器可提供頻率范圍10～150 kHz、電壓振幅0～100 V(有效值)的正弦高頻信號(hào)。兩個(gè)檢測(cè)電極(非接觸電極)由內(nèi)徑2.0 mm(液相色譜連接管剛好能穿過)的兩個(gè)銅管構(gòu)成，同軸固定于電路板上，檢測(cè)電極單元最后裝入5.3 cm×3.2 cm×1.5 cm的金屬盒中。金屬盒接地。將液相色譜PEEK連接管(外徑1.57 mm)穿過檢測(cè)電極，一端用PEEK連接頭與色譜柱出口連接，另一端與紫外檢測(cè)器相連接或放空。此連接方式并不破壞液相色譜的整個(gè)系統(tǒng)，使用方便。信號(hào)接收放大器將信號(hào)放大整流，經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換后由色譜工作站和計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的記錄與處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 儀器參數(shù)優(yōu)化

3.1.1激發(fā)電壓的影響激發(fā)電壓是影響電容耦合非接觸電導(dǎo)儀器性能的重要因素之一。將激發(fā)頻率設(shè)定在60 kHz，其它參數(shù)均固定，研究激發(fā)電壓在15～90 V時(shí)對(duì)檢測(cè)的影響。圖2A是十二烷基磺酸鈉的色譜圖，根據(jù)其峰高和信噪比值可確定最優(yōu)的激發(fā)電壓。從圖2B可見，隨著激發(fā)電壓增大，峰高也增大。當(dāng)激發(fā)電壓低于60 V時(shí)，信噪比隨電壓的增大而增大。然而，當(dāng)電壓高于60 V時(shí)，基線的噪音也增大，導(dǎo)致信噪比下降。 因此，選擇60 V為最優(yōu)的激發(fā)電壓。

3.1.2激發(fā)頻率的影響在激發(fā)電壓為60 V的條件下，在15～120 kHz 范圍內(nèi)考察十二烷基磺酸鈉(500 μg/mL)在液相色譜系統(tǒng)分離條件下的響應(yīng)及信噪比情況(圖2C)。激發(fā)頻率低于70 kHz時(shí)，信噪比隨著頻率的增大而增大; 當(dāng)激發(fā)頻率大于70 kHz時(shí)，雖然峰高增大明顯，但是噪音增大更為明顯，導(dǎo)致信噪比大大降低。因此選擇70 kHz為儀器的最優(yōu)激發(fā)頻率。

圖2 (A)十二烷基磺酸鈉的色譜圖: 1. 溶劑峰; 2. 十二烷基磺酸鈉(500 μg/mL)； (B) 激發(fā)電壓對(duì)峰高和信噪比的影響(固定頻率60 kHz); (C)激發(fā)頻率對(duì)峰高和信噪比的影響(固定電壓 60 V)Fig.2 (A) Response of SDS with C4D: 1.solvent peak; 2. SDS (500 μg/mL); (B) Influence of the excitation voltage on peak height and S/N at a constant frequency of 60 kHz; (C) Influence of excitation frequency on peak height and S/N at a constant voltage of 60 V

3.1.3電極間距的影響電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器的兩個(gè)電極之間的間距對(duì)儀器性能也有影響。固定激發(fā)電壓60 V，激發(fā)頻率70 kHz，考察了電極間距在0.5～3.5 mm范圍內(nèi)，對(duì)500 μg/mL十二烷基磺酸鈉在液相色譜系統(tǒng)分離條件下的響應(yīng)及信噪比情況(圖3A)。當(dāng)電極間距小于1.5 mm時(shí)，峰高隨距離的增大并不明顯，但是信噪比同時(shí)也在增大，電極太靠近時(shí)，噪音相對(duì)較大，信噪比在電極間距較小時(shí)較低，這說明合適的范圍內(nèi)，影響信號(hào)的因素主要是噪音; 然而，當(dāng)間距大于1.5 mm時(shí)，峰高和信噪比都出現(xiàn)了較大程度的下降，說明電極間距較大時(shí)，峰高成為影響靈敏度的主要因素。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將電極間距固定在1.5 mm。

3.1.4電極長度的影響設(shè)定激發(fā)電壓60 V、激發(fā)頻率70 kHz、電極間距1.5 mm，考察電極長度在4～18 mm時(shí)，十二烷基磺酸鈉(500 μg/mL)經(jīng)液相色譜分離后的響應(yīng)及信噪比情況。從圖3B可見，隨著電極長度增加，峰高也增高，但是當(dāng)電極長度大于10 mm時(shí)，隨著電極長度增大，信噪比并未明顯增大，反而略有降低; 另一方面，電極長度過長，對(duì)分離度也會(huì)產(chǎn)生影響。因此，選擇10 mm作為最優(yōu)的電極長度。

圖3 (A) 電極間距對(duì)峰高和信噪比的影響; (B) 電極長度對(duì)峰高和信噪比的影響Fig.3 (A) Effect of distance between excitation electrode and receiving electrode on peak height and signal to noise ratio (S/N); (B) Effect of length of excitation electrode and receiving electrode on peak height and S/N

圖4 不同內(nèi)徑的PEEK管對(duì)電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)靈敏度的影響流動(dòng)相- 乙腈-水(35∶65， V/V); 流速，1 mL/min。 峰1. 十二烷基磺酸鈉(20 μg/mL); 管徑：a. 0.13 mm; b. 0.25 mm; c. 0.50 mm; d. 0.75 mm; e. 1.00 mm.Fig.4 Effect of the different internal diameters tubing on C4D sensitivity using SDS at a concentration of 20 μg/mL: a. 0.13 mm; b. 0.25 mm; c. 0.50 mm; d.0.75 mm; e.1.00 mm. Mobile phase composition: acetonitrile-water (35∶65, V/V); flow rate, 1 mL/min. Peak definition: 1. SDS.

3.1.5不同內(nèi)徑的PEEK管的影響高效液相色譜儀連接管的材料多用聚醚醚酮，適合用于非接觸電導(dǎo)檢測(cè)。在行業(yè)內(nèi)，連接管的外徑相同，為1/16英寸(即1.57 mm)，內(nèi)徑則有不同規(guī)格。不同的內(nèi)徑對(duì)應(yīng)于不同的管壁厚度，對(duì)應(yīng)于不同的耦合電容量和不同的回路總阻抗，最終影響檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)弱。連接管的內(nèi)徑越大，管壁越薄，耦合電容量越大，回路的總阻抗越小，得到的檢測(cè)信號(hào)越強(qiáng)[19]。連接管內(nèi)徑還涉及擴(kuò)散效應(yīng)的影響。連接管的內(nèi)徑大于色譜柱出口的內(nèi)徑時(shí)，流動(dòng)相從小內(nèi)徑的管路流進(jìn)大內(nèi)徑的管路，常會(huì)引起成分區(qū)帶的擴(kuò)散，導(dǎo)致峰變寬，靈敏度變差，還使得分離度下降[20]。

圖5 鴉膽子油樣品和油酸、亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品混合物的電容耦合非接觸電導(dǎo)色譜圖(a) 200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品混合物, (b) 400 μg/mL皂化后的鴉膽子油樣品. 色譜峰: 1. 溶劑峰; 2.亞油酸; 3.油酸。Fig.5 HPLC-C4D detection of (a) standard mixture sample at a concentration of 200 μg/mL, (b) Brucea javanica oil (400 μg/mL) sample with saponification process. Peak assignment: 1. solvent peak: 2.linoleic acid, 3.oleic acid.

考察了5種不同內(nèi)徑的PEEK連接管對(duì)靈敏度的影響。如圖4所示，當(dāng)PEEK連接管內(nèi)徑為0.13 mm時(shí)，幾乎觀察不到十二烷基磺酸鈉的峰，可能是小內(nèi)徑管壁太厚，回路總阻抗太大，導(dǎo)致靈敏度太低，幾乎觀察不到信號(hào)。當(dāng)使用內(nèi)徑為0.75和1.00 mm時(shí)，擴(kuò)散效應(yīng)明顯。0.50 mm內(nèi)徑的PEEK連接管具有最高的峰高和信噪比，可能是管壁厚度和回路總阻抗適中，而擴(kuò)散效應(yīng)影響較小。綜上所述，0.50 mm內(nèi)徑的PEEK管具有最高的靈敏度。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1精密度取100 μg/mL的油酸和亞油酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6次，色譜峰見圖5a，記錄峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值。結(jié)果表明，油酸和亞油酸峰面積的RSD分別為1.5%和1.1%，表明儀器的精密度良好。

3.2.2方法重復(fù)性稱取相同質(zhì)量的6份鴉膽子油溶液，用同樣的方法皂化處理，最終稀釋至200 μg/mL，分別進(jìn)樣，色譜峰見圖5b。結(jié)果表明，油酸和亞油酸峰面積的RSD值分別為1.9%和1.8%， 表明本方法具有很好的重復(fù)性。

3.2.3線性范圍和檢出限準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，配成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣，記錄每個(gè)濃度所對(duì)應(yīng)的峰面積，將濃度對(duì)峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢出限通過配制系列低濃度樣品，計(jì)算信噪比(S/N=3)得到。如表1所示，油酸及亞油酸在5～1000 μg/mL線性關(guān)系良好，r>0.99，檢出限分別為2.5和1.0 μg/mL。

3.2.4回收率將對(duì)照品溶液按高、中、低3種濃度(每個(gè)濃度配3個(gè)樣)分別加入到已知濃度的樣品溶液中，測(cè)定加標(biāo)回收率。如表2所示，油酸和亞油酸的平均回收率分別在99.0%～100.8%和98.0%～101.3%范圍內(nèi)，表明本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3.2.5樣品穩(wěn)定性將皂化后的樣品放置于室溫條件下，分別在0、4、8、12、24和48 h進(jìn)樣。結(jié)果表明，油酸和亞油酸峰面積的RSD值分別為1.8%和2.4%。因此， 樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 亞油酸與油酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限 (濃度點(diǎn), 9;y, 峰面積;x, 樣品濃度)

Table 1 Regression equation, correlation coefficient, linearity range and limit of detection (LOD) of linoleic acid and oleic acid (n=9;y, peak area;x, concentration)

組分Components回歸方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)Coefficientofcorrelation(r)線性范圍Linearrange(μg/mL)檢出限LOD(μg/mL)亞油酸Linoleicacidy=5174．1x-2．40×1040．99925～10001．0油酸Oleicacidy=9163．4x-0．70×1040．99845～10002．5

3.3 樣品分析

選取3個(gè)批次的鴉膽子油軟膠囊進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表3。鴉膽子油中油酸含量在51.6%～55.8%之間，亞油酸含量在30.3%～32.8%之間，是鴉膽子油的兩個(gè)主要成分。與其它方法比較，油酸含量較為接近，本方法測(cè)得亞油酸含量為30%，而高效液相色譜(HPLC)紫外直接測(cè)定法[21]測(cè)得亞油酸含量為12.5%，HPLC-紫外柱前衍生化法[22]測(cè)得亞油酸含量為23.4%, 這可能是由于不同廠家、不同產(chǎn)地的原材料提取的鴉膽子油的有效成分存在差異，這也體現(xiàn)了中藥質(zhì)量控制的復(fù)雜性。目前，藥典中并未有鴉膽子油軟膠囊中油酸、亞油酸的具體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而油酸和亞油酸作為鴉膽子油的兩個(gè)主要成分，其含量的測(cè)定對(duì)藥物質(zhì)量的控制具有重要意義，本研究為鴉膽子油的質(zhì)量控制提供了一種新方法。

表2 亞油酸與油酸的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 2 Recoveries of standard additions of linoleic acid and oleic acid

組分Components測(cè)定值Found(μg/mL)加入量Added(μg/mL)測(cè)得量Totalfound(μg/mL，n=3)回收率Recovery(%，n=3)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%，n=9)亞油酸Linoleicacid131．5油酸Oleicacid243．8100．0231．298．0125．0258．1101．3150．0278．698．4200．0446．1100．8250．0494．899．1300．0537．699．02．81．7

表3 3批鴉膽子油軟膠囊的測(cè)定結(jié)果與其它的方法的比較

Table 3 Comparison of detection results of contents of linoleic acid and oleic acid in samples ofBruceajavanicaoil (n=3) by this method and literature methods

批號(hào)Batchnumber本方法Thismethod?(n=3)1503002J1506007J1506008J其它方法OthermethodsHPLC?紫外直接測(cè)定法[21]HPLC?UVHPLC?紫外柱前衍生化法[22]HPLC?derivatization亞油酸Linoleicacid(%)31．6±0．732．8±0．930．3±1．112．523．4油酸Oleicacid(%)55．8±1．255．8±0．151．6±0．961．365．6

上述結(jié)果表明， 此檢測(cè)器具有優(yōu)良的性能，適合于用于荷電或極性成分的定性和定量分析。但此檢測(cè)器的靈敏度相對(duì)較低，可能由兩方面的原因： (1)儀器方面，因?yàn)槟壳八艿玫降囊合嗌V連接管的管壁均較厚，導(dǎo)致回路總阻抗較大。雖然提高激發(fā)頻率可以降低回路阻抗，但噪音增加，信噪比改善不明顯; (2)電導(dǎo)檢測(cè)是基于被測(cè)成分與背景溶液的電導(dǎo)值的差異，而液相色譜測(cè)定荷電或極性成分時(shí)所用流動(dòng)相的背景電導(dǎo)值是相當(dāng)大的，這是靈敏度不高的主要原因之一。

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