戴田行 張才煜 耿 穎 何 蘭

(中國(guó)食品藥品檢定研究院， 北京 100050)

1 引 言

鹽酸蘭地洛爾是用于治療心律不齊的腎上腺素β1受體抑制劑，2002年由日本小野(Ono)制藥株式會(huì)社在日本首先上市，目前尚未在國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)上市[1～3]。鹽酸蘭地洛爾臨床常用劑型是注射制劑，由于它可以快速起效，并且在血漿中代謝半衰期很短，所以常用于治療手術(shù)中及術(shù)后快速性心律失常以及心房顫動(dòng)[4～6]。鹽酸蘭地洛爾分子中有2個(gè)手性中心，共有4個(gè)立體異構(gòu)體分子，臨床上應(yīng)用的鹽酸蘭地洛爾為S,S-異構(gòu)體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。識(shí)別鹽酸蘭地洛爾及其3個(gè)立體異構(gòu)體可以提高藥品質(zhì)量和藥效，避免潛在的藥物副作用。目前，鹽酸蘭地洛爾的立體異構(gòu)體的檢測(cè)方法報(bào)道不多[7]，探索并研究鹽酸蘭地洛爾的立體異構(gòu)體識(shí)別方法對(duì)手性藥物質(zhì)量的控制具有重要意義。

手性藥物分析的常用方法為旋光度測(cè)定、圓二色譜法、核磁共振、X射線衍射以及應(yīng)用最為廣泛的色譜法，這些方法都已經(jīng)非常成熟，廣泛應(yīng)用在手性分析中，然而也有各自的局限性，如分析周期長(zhǎng)、樣品處理過程復(fù)雜、樣品中的微量雜質(zhì)容易影響測(cè)定結(jié)果等。目前，在手性藥物及其立體異構(gòu)體識(shí)別中尚無法有效避免耗時(shí)長(zhǎng)、分析方法復(fù)雜等問題。質(zhì)譜法憑借快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在藥物分析領(lǐng)域。由于手性立體異構(gòu)體具有相同的分子量，所以質(zhì)譜一度被認(rèn)為無法鑒別手性異構(gòu)體。隨著軟電離源技術(shù)以及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，很多文獻(xiàn)報(bào)道了利用質(zhì)譜法區(qū)分和鑒別手性立體異構(gòu)體的研究[8～19]。手性物質(zhì)的質(zhì)譜分析常依賴手性選擇劑形成非對(duì)映體復(fù)合物，在質(zhì)譜儀器中進(jìn)行離子反應(yīng)或者離子裂解反應(yīng)，由于非對(duì)映異構(gòu)體之間的空間構(gòu)型以及分子能量的差異而呈現(xiàn)出不同的二級(jí)質(zhì)譜圖, 據(jù)此可進(jìn)行手性識(shí)別[20～22]。

質(zhì)譜法用于識(shí)別具有2個(gè)手性中心的藥物如鹽酸蘭地洛爾的研究尚未見報(bào)道。本研究采用兩種具有反應(yīng)活性的手性酰氯探針試劑N-對(duì)甲苯磺?；?L-苯丙氨酰氯(TSPC)與(-)-莰烷酰氯(其結(jié)構(gòu)如圖2所示)，與鹽酸蘭地洛爾及其對(duì)映體反應(yīng)，對(duì)鹽酸蘭地洛爾以及它在與酰氯反應(yīng)后的質(zhì)譜裂解行為進(jìn)行了研究，首次對(duì)鹽酸蘭地洛爾及其3個(gè)對(duì)映體雜質(zhì)進(jìn)行了基于質(zhì)譜法的手性識(shí)別，并采用離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(IT-TOF)進(jìn)行高分辨質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，確證了質(zhì)譜裂解規(guī)律。本方法快速、靈敏，樣品用量少，對(duì)于鹽酸蘭地洛爾進(jìn)行定性研究，為分離識(shí)別手性藥物對(duì)映異構(gòu)體提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 鹽酸蘭地洛爾(A)及其立體異構(gòu)體(B, R,R-異構(gòu)體；C, R,S-異構(gòu)體；D，R,S-異構(gòu)體)的結(jié)構(gòu)式 Fig.1 Structure of landiolol hydrochloride (A) and its isomers (B, R,R-isomer; C, R,S-isomer; D, R,S-isomer)

圖2 手性酰氯探針的結(jié)構(gòu)式: (A) N-對(duì)甲苯磺?；?L-苯丙氨酰氯(TSPC); (B) (-)-莰烷酰氯Fig.2 Structure of chiral acyl chloride probe. (A) N-(p-Tosyl)-L-phenylalaninyl chloride； (B) (-)-Camphanic acid chloride

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Bruker amaZon離子阱質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司); LCMS-IT-TOF離子阱-飛行時(shí)間(IT-TOF)質(zhì)譜儀(日本島津公司)

鹽酸蘭地洛爾以及三個(gè)立體異構(gòu)體對(duì)照品(100%，中國(guó)食品藥品檢定研究院); 甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Tedia公司) ;N-對(duì)甲苯磺酰基-L-苯丙氨酰氯(TSPC)、(-)-莰烷酰氯(分析純，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司); 實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm，Million-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司)。

2.2 樣品處理

2.2.1樣品溶液的配制分別精密稱取鹽酸蘭地洛爾及其3個(gè)異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，用乙腈溶解并稀釋至10 mL，制成濃度約為0.002 mol/L的樣品儲(chǔ)備液，在室溫下貯存，待用。取樣品儲(chǔ)備液1 mL，用乙腈稀釋至50 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，作為進(jìn)樣溶液，直接進(jìn)樣分析。

2.2.2手性酰氯探針溶液的配制精密稱取TSPC 14 mg、(-)-莰烷酰氯9 mg，分別用乙腈溶解并稀釋至10 mL，制成濃度約為0.004 mol/L的溶液，作為探針儲(chǔ)備液，室溫下密封貯存，待用。

2.2.3手性探針與樣品的反應(yīng)分別取鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體儲(chǔ)備液各200 μL，分別與TSPC儲(chǔ)備溶液300 μL混合，在室溫下超聲5 min，用乙腈稀釋至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，直接進(jìn)樣分析。再取鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體儲(chǔ)備溶液各200 μL，分別與(-)-莰烷酰氯溶液300 μL混合，混合液在室溫下超聲5 min，反應(yīng)后用乙腈稀釋至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，直接進(jìn)樣分析。

2.3 質(zhì)譜分析條件

2.3.1BrukeramaZon離子阱質(zhì)譜儀分析儀器配有電噴霧離子源和離子阱質(zhì)量分析器，采用正離子模式，樣品溶液通過進(jìn)樣泵以170 μL/h的流速注入離子源內(nèi)。儀器參數(shù)：氮?dú)鉃楦稍餁?，流? L/min； 干燥氣溫度250℃; 氮?dú)鉃殪F化氣，壓力為10 Psi; 噴霧電壓為+4500 V，掃描速度為每秒m/z8000; 碰撞氣為氦氣。

2.3.2LCMS-IT-TOF離子阱-飛行時(shí)間(IT-TOF)質(zhì)譜儀分析儀器配有電噴霧離子源和離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)量分析器，采用正離子模式，干燥氣(氮?dú)?溫度為150℃，霧化氣(氮?dú)?流速為1.5 L/min，霧化氣壓力為100 kPa，檢測(cè)電壓為1.57 V。氬氣為碰撞氣，二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量設(shè)置為30%， 掃描范圍為： 一級(jí)質(zhì)譜m/z100～1000，二級(jí)質(zhì)譜m/z240～1000。使用三氟醋酸鈉校正準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律研究

圖3 鹽酸蘭地洛爾(A)及其R,R-異構(gòu)體(B)、R,S異構(gòu)體(C)、 S,R-異構(gòu)體(D)的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.3 Tandem mass spectra (MS/MS) of landiolol hydrochloride (A) and its R,R-isomer (B)、R,S-isomer (C) and S,R-isomer (D)

采用離子阱質(zhì)譜儀，在正離子模式下，鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖如圖3所示。鹽酸蘭地洛爾經(jīng)ESI電離形成[M+H]+(m/z510)，其碰撞能量為0.21 V的二級(jí)質(zhì)譜圖如圖3A所示。其中m/z423的碎片離子是丟失嗎啉環(huán)的產(chǎn)物離子，m/z405是它丟失了一分子水的產(chǎn)物離子;m/z365是丟失嗎啉環(huán)并且在縮酮位置脫去丙酮得到的產(chǎn)物離子，m/z327則為它失去一分子水的產(chǎn)物;m/z309是分子酯鍵斷裂生成的產(chǎn)物，m/z291由它失去一分子水得到。質(zhì)譜二級(jí)可能的裂解途徑如圖4所示。上述碎裂途徑的碎片離子，均通過高分辨質(zhì)譜得到確證，結(jié)果如表1所示。

表1 鹽酸蘭地洛爾的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)

Table 1 Accurate mass measurement of landiolol hydrochloride

母離子Precursorions(m/z)碎片離子Productions(m/z)分子式Formula測(cè)定值Measuredmass(m/z)理論值Calculatedmass(m/z)相對(duì)誤差Error(ppm)510[M+H]+-C25H40N3O+8510．2820510．28101．96423C21H31N2O+7423．2134423．21261．89405C21H29N2O+6405．2057405．20209．13365C18H25N2O+6365．1714365．17071．92347C18H23N2O+5347．1615347．16014．03309C15H21N2O+5309．1455309．14453．23291C15H19N2O4+291．1354291．13395．15811[M+H]+-C41H55N4O11S+811．3603811．35832．47793C41H53N4O10S+793．3453793．3477-3．03753C38H49N4O10S+753．3107753．30586．50724C37H46N3O10S+724．2950724．28987．18706C37H44N3O9S+706．2745706．2793-6．80666C34H40N3O9S+666．2481666．24800．15648C34H38N3O8S+648．2385648．23741．70690[M+H]+-C35H52N3O+11690．3587690．3596-1．30672C35H50N3O+10672．3462672．3491-4．31632C32H46N3O+10632．3173632．3178-0．79603C31H43N2O+10603．2920603．29121．33545C28H37N2O+9545．2493545．2494-0．18

由碎裂途徑(圖4)可知，在鹽酸蘭地洛爾二級(jí)質(zhì)譜中，羥基位置失去一分子水是比較常見的裂解途徑，嗎啉環(huán)也比較容易丟失，縮酮基團(tuán)位置丟失丙酮形成的離子強(qiáng)度也比較大。在相同能量下，鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體的碎裂途徑，產(chǎn)生的碎片離子基本一致。在二級(jí)質(zhì)譜圖中，可以發(fā)現(xiàn)蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖的碎片離子種類以及豐度基本一致。

圖4 推測(cè)的鹽酸蘭地洛爾裂解途徑Fig.4 Proposed fragment pathway of landiolol hydrochloride

3.2 手性酰氯探針識(shí)別鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體的質(zhì)譜區(qū)分研究

3.2.1N-對(duì)甲苯磺?；?L-苯丙氨酰氯(TSPC)的質(zhì)譜識(shí)別區(qū)分

圖5 鹽酸蘭地洛爾與探針N-對(duì)甲苯磺酰基-L-苯丙氨酰氯(TSPC)反應(yīng)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)Fig.5 Structure of N-(p-Tosyl)-L-phenylalaninyl chloride (TSPC) derivative products

在離子阱質(zhì)譜儀正離子模式下，鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體與手性探針酰氯TSPC反應(yīng)后(圖5)，其產(chǎn)物經(jīng)ESI電離形成[M+H]+(m/z811)準(zhǔn)分子離子峰離子峰，對(duì)[M+H]+離子進(jìn)行CID實(shí)驗(yàn)，碰撞能量為0.22 V的二級(jí)質(zhì)譜圖如圖6所示，主要的碎片離子的形成與鹽酸蘭地洛爾的碎裂途徑非常類似，均出現(xiàn)丟失嗎啉環(huán)和水以及縮酮基團(tuán)位置丟失丙酮的碎片離子，值得注意的是二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)了較強(qiáng)的母離子直接脫水的產(chǎn)物離子峰m/z793，這是鹽酸蘭地洛爾的二級(jí)質(zhì)譜中沒有出現(xiàn)的裂解，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜圖推測(cè)主要碎片離子的結(jié)構(gòu)如圖7所示。上述碎裂途徑的碎片離子均通過高分辨質(zhì)譜得到確證，高分辨數(shù)據(jù)如表1所示。在二級(jí)質(zhì)譜圖中，明顯可見碎片離子m/z793的豐度在4個(gè)異構(gòu)體中不相同，圖6A和圖6D中的豐度比明顯低于圖6B和圖6C。

能量分辨質(zhì)譜(Energy resolution mass spectrometry，ERMS)是研究串聯(lián)質(zhì)譜裂解途徑的常用方法，原理是通過繪制以二級(jí)質(zhì)譜碎裂能量為橫坐標(biāo)、二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子的相對(duì)豐度為縱坐標(biāo)的能量曲線(Breakdown curve)，研究二級(jí)質(zhì)譜裂解途徑與碎裂能量的關(guān)系，此方法也常被用于質(zhì)譜手性分析中[23～25]。為了進(jìn)一步研究衍生化產(chǎn)物裂解途徑，在碰撞電壓為0.16～0.30 V下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，將不同碰撞能量下母離子與碎片離子的豐度變化繪制成能量識(shí)別曲線(圖8)，通過能量識(shí)別曲線可觀察到不同能量下碎片離子豐度的變化。鹽酸蘭地洛爾與它的立體異構(gòu)體經(jīng)過手性探針反應(yīng)后進(jìn)入質(zhì)譜分析后，在同一碰撞能量下的二級(jí)質(zhì)譜圖中有一些離子的豐度由于立體構(gòu)型的原因表現(xiàn)出一定差異，如m/z793和m/z706這兩個(gè)碎片離子，根據(jù)推測(cè)的碎片離子結(jié)構(gòu)，m/z793和m/z706這兩個(gè)碎片離子都是羥基位置丟失水分子的碎片離子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明, 分子中羥基所在的手性中心構(gòu)型為S的鹽酸蘭地洛爾和S,R-異構(gòu)體與R構(gòu)型的R,S-和R,R-異構(gòu)體存在明顯差異，R構(gòu)型的手性中心更加利于丟失羥基的碎裂途徑，S構(gòu)型的分子羥基可與手性探針中的羰基形成穩(wěn)定的分子間相互作用，從而丟失水分子的碎片豐度更低一點(diǎn)，從二級(jí)質(zhì)譜圖上可以觀察到，羥基所在手性中心構(gòu)型為S構(gòu)型時(shí)m/z793和m/z706兩個(gè)碎片離子相對(duì)豐度與基峰離子的比值約為0.15(m/z793)和0.10(m/z706)，R構(gòu)型的比值約為0.45(m/z793)和0.25(m/z706)。由于不同構(gòu)型的母離子立體結(jié)構(gòu)的差異,導(dǎo)致分子內(nèi)和分子間相互作用不同, 進(jìn)而導(dǎo)致CID裂解效率有所不同，因此產(chǎn)生的碎片離子豐度也有所差異，利用這種豐度的差異可快速識(shí)別鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體。

圖6 TSPC結(jié)合產(chǎn)物的MS/MS質(zhì)譜圖: (A)鹽酸蘭地洛爾， (B) R,R-異構(gòu)體， (C) R,S-異構(gòu)體， (D) S,R-異構(gòu)體Fig.6 MS/MS spectra of TSPC derivative products: (A) Landiolol hydrochloride, (B) R,R-isomer, (C) R,S-isomer and (D) S,R-isomer

圖7 TSPC結(jié)合產(chǎn)物可能的碎片離子Fig.7 Proposed fragment ions of TSPC derivative products

圖8 TSPC結(jié)合產(chǎn)物碎片離子的能量識(shí)別曲線: (A) 鹽酸蘭地洛爾, (B) R,R-異構(gòu)體, (C) R,S-異構(gòu)體, (D) S,R-異構(gòu)體Fig.8 Breakdown curve of fragment ions of derivative products: (A) Landiolol hydrochloride, (B) R,R-isomer, (C) R,S-isomer, (D) S,R-isomer

3.2.2(-)-莰烷酰氯衍生化的質(zhì)譜區(qū)分離子阱質(zhì)譜儀正離子模式下，鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體與探針(-)-莰烷酰氯反應(yīng)之后形成產(chǎn)物如圖9所示。產(chǎn)物分子經(jīng)ESI電離形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+(m/z690)， 其碰撞能量為0.20 V的二級(jí)質(zhì)譜如圖10所示，因?yàn)闃?gòu)型的不同導(dǎo)致碎片離子豐度呈現(xiàn)出差異，主要的碎片離子也都是丟失嗎啉環(huán)和水以及縮酮位置脫去丙酮形成的，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)與手性探針TSPC一致的母離子丟失水分子的碎片離子，可能的碎片離子的結(jié)構(gòu)推測(cè)如圖11所示。上述碎裂途徑的碎片離子，均通過高分辨質(zhì)譜得到確證，結(jié)果如表1所示。在二級(jí)質(zhì)譜圖(圖10)中，可以觀察到4個(gè)構(gòu)型的異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖都不相同，碎片離子m/z672 與m/z603在4個(gè)構(gòu)型異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖中的豐度均有差異。與蘭地洛爾(圖10A)中這兩個(gè)碎片離子豐度均相比，圖10(B～D)中的豐度均與圖10A中的碎片離子豐度有差異。

圖9 鹽酸蘭地洛爾與探針(-)-莰烷酰氯反應(yīng)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)Fig.9 Structure of (-)-Camphanic acid chloride derivative products

圖10 (-)-莰烷酰氯結(jié)合產(chǎn)物的MS/MS質(zhì)譜圖: (A) 鹽酸蘭地洛爾, (B) R,R-異構(gòu)體, (C) R,S-異構(gòu)體, (D) S,R-異構(gòu)體Fig.10 MS/MS spectrum of (-)-Camphanic acid chloride derivative products: (A) landiolol hydrochloride, (B) R,R-isomer, (C) R,S-isomer, (D) S,R-isomer

圖11 (-)-莰烷酰氯結(jié)合產(chǎn)物可能的碎片離子Fig.11 Proposed fragment ions of (-)-Camphanic acid chloride derivative products

在碰撞電壓0.17～0.28 V條件下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，繪制能量識(shí)別曲線(圖12)，二級(jí)質(zhì)譜圖表明，m/z672是由于羥基連接的手性碳構(gòu)型不同，導(dǎo)致碎片豐度不同，m/z672是母離子直接丟失一分子水的碎片離子，這與TSPC衍生化產(chǎn)物的裂解途徑一致，鹽酸蘭地洛爾(S,S)與S,R-異構(gòu)體由于羥基所在的手性中心比較穩(wěn)定不易于丟失羥基，在二級(jí)圖譜上直觀地表現(xiàn)為丟失羥基的碎片豐度比較小。二級(jí)質(zhì)譜圖和能量識(shí)別曲線表明，羥基所在手性中心構(gòu)型為S構(gòu)型時(shí)。m/z672碎片離子與基峰離子豐度比值約為0.3，R構(gòu)型時(shí)的比值約為0.5。除此之外，在能量識(shí)別曲線中還可以觀察到, 在鹽酸蘭地洛爾(S,S)與R,S-異構(gòu)體的m/z603碎片離子豐度比R,R-異構(gòu)體與S,R-異構(gòu)體高。由于m/z603在質(zhì)譜圖中的相對(duì)豐度較低，所以在質(zhì)譜圖中較難觀察到，通過能量識(shí)別曲線，可以觀察到離子豐度的區(qū)別。這個(gè)區(qū)別取決于縮酮基團(tuán)所在的手性中心的構(gòu)型，縮酮基團(tuán)所在的手性中心的空間構(gòu)型的不同會(huì)導(dǎo)致碎片離子相對(duì)豐度有所差異。計(jì)算可得，當(dāng)縮酮基團(tuán)所在手性中心為S構(gòu)型時(shí)，m/z603碎片離子與基峰離子豐度比值約為0.07，R構(gòu)型時(shí)比值約為0.18。由于空間構(gòu)型的差異導(dǎo)致碎片離子能量的差異，這使得離子豐度也有所差異。結(jié)果表明，(-)坎烷酰氯可作為手性探針酰氯，通過計(jì)算二級(jí)質(zhì)譜中的特征碎片離子m/z672 與m/z603的相對(duì)豐度比值，可以快速區(qū)分鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體，并且確定兩個(gè)手性中心的構(gòu)型。

圖12 (-)-莰烷酰氯結(jié)合產(chǎn)物碎片離子的能量識(shí)別曲線: (A)鹽酸蘭地洛爾, (B) R,R-異構(gòu)體, (C) R,S-異構(gòu)體, (D) S,R-異構(gòu)體Fig.12 Breakdown curve fragment ions of (-)-Camphanic acid chloridederivative products: (A) landiolol hydrochloride、(B) R,R-isomer, (C) R,S-isomer, (D) S,R-isomer

4 結(jié) 論

通過手性酰氯探針快速衍生化手性藥物鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體，采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了研究。研究了質(zhì)子化鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體在正離子模式下的二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律，使用兩種手性酰氯試劑作為手性探針，對(duì)鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體進(jìn)行了識(shí)別研究。結(jié)果表明，手性探針識(shí)別后，手性中心碳原子構(gòu)型可以影響二級(jí)質(zhì)譜碎片離子的豐度，由于其立體結(jié)構(gòu)的差異，不同構(gòu)型特征母離子經(jīng)過不同效率的裂解途徑產(chǎn)生的碎片離子豐度也不同，計(jì)算二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生碎片離子豐度比值即可快速靈敏地識(shí)別鹽酸蘭地洛爾及其立體異構(gòu)體，對(duì)藥物中異構(gòu)體雜質(zhì)的分離鑒定提供了借鑒。

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