陸彭磊 蔡少平

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082）

銅綠假單胞菌是引起相關(guān)性肺炎的常見致病菌之一，不僅可以對(duì)燒傷患者、老年患者、獲得性免疫缺陷癥患者等造成致死性感染外，也是院內(nèi)獲得性感染的最主要病原菌之一。同時(shí)在院內(nèi)，銅綠假單胞菌可引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、手術(shù)切口感染、植入物感染等疾病［1］。在新形勢(shì)下，隨著全球耐藥菌的增多、抗生素的不規(guī)范使用、免疫缺陷患者引發(fā)多重耐藥感染率的上升，銅綠假單胞菌的抗生素選擇和應(yīng)用一直是臨床科室亟待解決的問題［2］。除了接受廣譜抗生素的治療外，實(shí)踐證明中藥注射液與抗生素配伍后溶液劑量穩(wěn)定有效［3］。痰熱清注射液是由黃苓、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹等提取而成，具有抗菌、抗炎、抗病毒、化痰、止咳作用的中成藥注射液［4］。喜炎平注射液主要成分包括穿心蓮內(nèi)酯磺化物，臨床上具有較強(qiáng)的廣譜抑菌活性和抗病毒作用［5］。痰熱清注射液、喜炎平注射液與頭孢他啶注射液聯(lián)合作用的抗菌效果臨床評(píng)價(jià)依據(jù)較少，導(dǎo)致臨床選擇困難。因此本研究對(duì)痰熱清注射液、喜炎平注射液與頭孢他啶注射液聯(lián)合作用時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中是否能起到聯(lián)合抑菌的效果進(jìn)行探究，以期為中藥抗感染治療提供應(yīng)用基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究資料 1）菌株選擇：選擇ATCC27853銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（購自上海市臨檢中心）。2）細(xì)菌懸液的制備：采用細(xì)菌生長法［6］制備菌液。銅綠假單胞菌從-80℃超低溫冰箱取出，無菌操作取狀態(tài)良好的菌落或菌苔，接種于2～3 mL普通肉湯管放入35℃（10%CO2）恒溫培養(yǎng)箱中24 h進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種至羊血瓊脂培養(yǎng)基，置于孵育環(huán)境中（10%CO2）35℃培養(yǎng)48 h。然后用無菌生理鹽水制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙簜溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 循環(huán)型超凈工作臺(tái)（賽默飛世爾儀器有限公司），生物安全柜（賽默飛世爾儀器有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），-20℃冰箱（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司），-80℃超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司），4℃冰箱（青島海爾特種電器有限公司），高溫高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），臺(tái)式高速離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司），顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。痰熱清注射液（上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20160918，規(guī)格：10 mL/支）在本次實(shí)驗(yàn)中使用原倍原液。喜炎平注射液（江西青峰藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2016120103，規(guī)格：每支2 mL∶50 mg）在實(shí)驗(yàn)中加入無菌注射用水8 mL復(fù)溶，并且配置成5 μg/mL喜炎平原液。注射用頭孢他啶（海南海靈化學(xué)制藥有限公司，批號(hào)：1609216，規(guī)格：1 g/支）在實(shí)驗(yàn)中加入無菌注射用水200 mL并且稀釋成4 μg/mL頭孢他啶原液。

1.3 干預(yù)方法 1）單獨(dú)藥敏試驗(yàn)：采用倍比稀釋法［7］制備痰熱清原液，喜炎平原液與頭孢他啶原液的濃度梯度稀釋液。取無菌96孔微量板，按從左至右編號(hào)為1～12號(hào)孔，先在2～10孔中預(yù)先加入50 μL無菌注射用水。1號(hào)孔加入100 μL痰熱清原液（1號(hào)孔痰熱清稀釋倍數(shù)為1∶1），從1號(hào)孔中混勻吸出50 μL痰熱清原液加入2號(hào)孔中（2號(hào)孔痰熱清稀釋倍數(shù)為1∶2），以此類推，倍比稀釋法至第10號(hào)孔（10號(hào)孔痰熱清稀釋倍數(shù)為 1∶512）。 1～10 號(hào)每孔加入 50 μL 細(xì)菌懸液混勻。設(shè)置11號(hào)孔為陰性對(duì)照，加入100 μL無菌注射用水；12號(hào)孔為陽性對(duì)照，加入100 μL細(xì)菌懸液。再分別如上制備喜炎平與頭孢他啶的濃度梯度96孔微量板。各藥物濃度重復(fù)3次，封板后置于濕盒內(nèi)，放置于35℃ CO2培養(yǎng)箱中18～24 h后觀察生長情況。2）聯(lián)合藥敏試驗(yàn)：倍比稀釋法制備痰熱清原液，喜炎平原液與頭孢他啶原液的濃度梯度稀釋液。在無菌96孔微量板上，進(jìn)行從左至右編號(hào)為1～9號(hào)孔，從上至下編號(hào)為A～I(xiàn)號(hào)孔，從左至右、痰熱清注射液從1∶16倍比稀釋至1∶4096，每孔分別加25 μL稀釋液。從上至下注射用頭孢他啶從 1∶1 倍比稀釋至 1∶256，每孔分別加 25 μL稀釋液。然后在每孔加50 μL細(xì)菌懸液混勻，在96孔板底部空余孔內(nèi)設(shè)置陰性對(duì)照，加入100 μL無菌注射用水，陽性對(duì)照，加入100 μL細(xì)菌懸液。再分別如上制備喜炎平與頭孢他啶的濃度梯度96孔微量板，各藥物濃度重復(fù)3次，封板后置于濕盒內(nèi)，放置于35℃CO2培養(yǎng)箱中18～24 h后觀察生長情況。3）判讀標(biāo)準(zhǔn)與FIC指數(shù)計(jì)算：3次重復(fù)試驗(yàn)中，兩次實(shí)驗(yàn)均無細(xì)菌生長澄清的孔為陰性，記錄“-”。兩次實(shí)驗(yàn)均有細(xì)菌生長的孔為陽性，記錄“+”。采用視覺法判定終點(diǎn)。以80%抑制作為觀察終點(diǎn)，以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。分級(jí)抑菌濃度指數(shù)（FIC）＝MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用。根據(jù)FIC指數(shù)判讀標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)IC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1 為相加作用；1＜FIC≤2 為無關(guān)作用；FIC＞2為拮抗作用［8］。

2 結(jié) 果

2.1 單獨(dú)藥敏試驗(yàn)MIC測(cè)定結(jié)果 見表1～表3。頭孢他啶稀釋度為1∶32時(shí)小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長，即MIC值為0.125 μg/mL。痰熱清注射液為1∶16時(shí)小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長，即MIC值為1∶16。喜炎平注射液為1∶8時(shí)小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長，即MIC值為0.625 μg/mL。

2.2 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 見表4～表5。頭孢他啶稀釋倍數(shù)中1∶256，痰熱清注射液稀釋倍數(shù)中1∶64為聯(lián)合應(yīng)用時(shí)FIC值。另外，頭孢他啶稀釋倍數(shù)中1∶256，喜炎平注射液稀釋倍數(shù)中1∶16為聯(lián)合應(yīng)用時(shí)FIC值。根據(jù)FIC公式計(jì)算得頭孢他啶聯(lián)合痰熱清注射液FIC指數(shù)為0.375為協(xié)同作用，頭孢他啶聯(lián)合喜炎平注射液FIC指數(shù)為0.625為相加作用。

3 討 論

近年來，隨著老齡化社會(huì)年老體弱、營養(yǎng)不良患者和免疫力低下、免疫缺陷患者的增多，臨床上對(duì)于抗生素廣泛使用而導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的問題日趨凸顯和日益嚴(yán)重［9］，并且已經(jīng)嚴(yán)重影響了臨床對(duì)于感染性疾病的治療效果和患者的整個(gè)康復(fù)過程［10］。而中藥的抗感染和抑菌作用古已有之，并且中藥在抗感染方面具有低耐藥性、多作用靶位的廣譜抗菌效果、藥源廣泛、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)［11］。因此在21世紀(jì)提倡減少不必要的抗生素使用的大背景下，對(duì)已知成分的中藥注射液與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用也成為了一種對(duì)抗多重耐藥的新型手段，對(duì)于今后的抗感染治療和抗生素的合理選擇意義重大。

表1 頭孢他啶注射液單獨(dú)對(duì)銅綠假單胞菌的MIC

表2 痰熱清注射液單獨(dú)對(duì)銅綠假單胞菌的MIC

表3 喜炎平注射液單獨(dú)對(duì)銅綠假單胞菌的MIC

表4 頭孢他啶聯(lián)合痰熱清注射液對(duì)銅綠假單胞菌的MIC

表5 頭孢他啶聯(lián)合喜炎平注射液對(duì)銅綠假單胞菌的MIC

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)痰熱清注射液、喜炎平注射液與頭孢他啶注射液聯(lián)合體外抑制銅綠假單胞菌生長。體外實(shí)驗(yàn)中均對(duì)銅綠假單胞菌出現(xiàn)了抑菌效果，其中聯(lián)合應(yīng)用時(shí)抑菌效果均高于單藥單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的抑菌效果，結(jié)果同時(shí)顯示痰熱清注射液聯(lián)合時(shí)的抑菌效果優(yōu)于喜炎平注射液聯(lián)合時(shí)的抑菌效果，與李亞娜和閆春生等研究一致［12-13］。

本研究結(jié)果表明，中藥注射液在聯(lián)合應(yīng)用對(duì)抗銅綠假單胞菌上效果均優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用對(duì)抗銅綠假單胞菌。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能原因?yàn)槠茐募?xì)菌的新陳代謝、改變細(xì)菌細(xì)胞的通透性、小分子細(xì)胞膜滅活細(xì)菌、氧化細(xì)菌體內(nèi)的活性基團(tuán)等的中藥抑菌機(jī)制和頭孢他啶注射液影響細(xì)菌細(xì)胞壁的合成作用聯(lián)合，可以加速細(xì)菌溶菌死亡，起到事半功倍的效果。

目前對(duì)銅綠假單胞菌引起的感染，臨床上已經(jīng)主張使用痰熱清注射液和喜炎平注射液等來抗感染治療。本研究證明痰熱清注射液，喜炎平注射液與頭孢他啶注射液聯(lián)合均能起到聯(lián)合抑菌作用，其中痰熱清注射液相較于喜炎平注射液作用更好。但也需注意配伍禁忌，發(fā)現(xiàn)藥物不良反應(yīng)立即停藥［14］。因此中藥在應(yīng)用過程要遵從辨病施治的特點(diǎn)，就需要加強(qiáng)合理用藥，并且在應(yīng)用過程中選擇安全有效的制劑方法和合適的藥物劑型［15］。但痰熱清注射液和喜炎平注射液聯(lián)合抗生素的作用機(jī)制和如何優(yōu)化臨床治療方案尚需進(jìn)一步證實(shí)。需要后期進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制深入研究并收集證據(jù)進(jìn)行臨床規(guī)范化研究。

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