張明哲，尹文秀，陳 哲，吳 姍，虞惠貞，張曉峰，許 瑾，李明福，吳 蓉

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基于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的土沉香物種鑒定

張明哲1，尹文秀1，陳 哲1，吳 姍1，虞惠貞1，張曉峰1，許 瑾2，李明福2，吳 蓉1

（1. 浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016；2. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

對(duì)土沉香，云南沉香.和馬來(lái)沉香3種沉香屬植物的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，并通過(guò)DNAMAN軟件篩選出單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，土沉香序列第236位上的堿基為C，而云南沉香和馬來(lái)沉香為T(mén)，設(shè)計(jì)出土沉香特異性引物AS-F，AS-R和探針AS-P。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，該引物探針能特異性擴(kuò)增土沉香，且檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.01 ng·μL-1，是一種快速、靈敏的鑒定方法。

土沉香；實(shí)時(shí)熒光PCR；ITS；物種鑒定

土沉香，又稱(chēng)白木香，屬瑞香科Thymelaeaceae沉香屬植物，為我國(guó)特有的珍貴觀賞藥用植物[1]，也是我國(guó)生產(chǎn)藥材沉香的唯一植物資源，于1999年被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[2]。2005年1月12日，瑞香科白木香屬的全部物種均被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES公約）附錄Ⅱ管制[3-4]。目前全球沉香屬樹(shù)種的野生資源主要分布在亞洲[4]。我國(guó)土沉香主要分布于廣東、海南、廣西、福建，喜生于低海拔的山地、丘陵以及路邊陽(yáng)處疏林中[5]。土沉香老莖受傷后所積得的樹(shù)脂，俗稱(chēng)沉香，可作香料原料，并為治胃病特效藥；樹(shù)皮纖維柔韌，色白而細(xì)致可做高級(jí)紙?jiān)霞叭嗽烀?；木質(zhì)部可提取芳香油，花可制浸膏[5]。沉香系傳統(tǒng)中藥、名貴香料，具有悠久利用史，其藥用、精油、香料等方面市場(chǎng)需求量巨大[6]。近年來(lái)，其較高的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值，吸引了化學(xué)、生物學(xué)、病理學(xué)、材料科學(xué)等多學(xué)科研究人員的關(guān)注，且部分研究成果已在中醫(yī)藥學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域得到應(yīng)用[4]。

我國(guó)的土沉香資源十分豐富，歷史上就有“交干連枝，崗嶺相接，千里不絕”的記載，而且國(guó)產(chǎn)沉香品質(zhì)優(yōu)良，有“冠絕天下”的美稱(chēng)[7]。但近年來(lái)土沉香生存環(huán)境遭到破壞，一方面自然繁殖率下降；另一方面為了產(chǎn)香、取香，人為地對(duì)土沉香樹(shù)進(jìn)行傷害，甚至砍倒，影響土沉香正常生長(zhǎng)和繁殖，土沉香林面積急劇下降[7]。同時(shí)，隨著中藥現(xiàn)代化的快速發(fā)展和香客、收藏愛(ài)好者對(duì)沉香的熱衷，沉香的需求日益增加，野生資源和傳統(tǒng)的人工結(jié)香已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足需求，市場(chǎng)上摻假造假的現(xiàn)象也日益凸顯。為加強(qiáng)沉香屬物種資源的保護(hù)和利用，規(guī)范市場(chǎng)秩序，本研究基于沉香屬不同種間單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的差異，設(shè)計(jì)特異性引物探針，建立了土沉香分子生物學(xué)鑒定方法，對(duì)口岸快速篩查和鑒定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年3－7月，采集土沉香葉片13份（云南、海南、廣東、廣西），云南沉香葉片3份（云南）和馬來(lái)沉香木材1份（馬來(lái)西亞），共17份。采集樣本為任意部位的新鮮葉片，數(shù)量若干，部分放在密封袋中，以供試驗(yàn)，剩余樣品置于－20℃冰箱保存。木材樣本為檢查截獲的馬來(lái)沉香樣品。

1.2 方法

表1 通用引物ITS2

1.2.1 DNA樣品的制備 DNA提取在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，采用改良的DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）[8]。DNA提取之前，先將Qiagen試劑盒中的Buffer AP1在65℃水浴鍋中預(yù)熱。葉片經(jīng)無(wú)菌水沖洗并用已滅菌的濾紙擦干，木材用75%的乙醇對(duì)表面進(jìn)行徹底的消毒，再經(jīng)無(wú)菌水沖洗并用已滅菌的濾紙擦干[9]，將植物葉片、木材研磨成粉末狀，取0.1 g粉末至2 mL離心管，加入400 μL預(yù)熱的Buffer AP1，4 μL RNase A，充分混合后65℃溫浴10 min，然后加入130 μL的BufferP3，迅速混勻后在冰上冷卻5 min。接下來(lái)的步驟，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

表2 土沉香引物探針

注：探針5’端標(biāo)記FAM報(bào)告熒光染料，3’端標(biāo)記BHQ1淬滅熒光染料。

1.2.2 引物和探針 本研究篩選出沉香屬通用引物（ITS2[10])，可有效擴(kuò)增沉香屬樣本，擴(kuò)增長(zhǎng)度約為500 bp（表1）。引物、探針由TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成。以通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物為目標(biāo)序列，通過(guò)DNAMAN軟件篩選出多態(tài)性位點(diǎn)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)出土沉香特異性鑒定引物和探針（表2）。

1.2.3 反應(yīng)體系及條件 普通PCR反應(yīng)體系：采用大連寶生物（TaKaRa Ex Taq）提供的試劑，10×Ex Taq Buffer 2.0 μL（Mg2+plus），dNTPs 1.6 μL（各2.5 mM），引物各0.4 μL（20 μM），ddH2O 13.5 μL，Taq酶0.1 μL（5 U·μL-1），DNA模版2 μL（10 ~ 40 ng·μL-1）。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。使用PCR儀（S1000）擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送至杭州擎科梓煕生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系：采用大連寶生物（TaKaRa Ex Taq）提供的試劑，實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液（2×）10 μL，正反向引物（20 μM）各0.4 μL，探針（10 μM）0. 8 μL，ROX（50×）0.4 μL，DNA模板2 μL，滅菌雙蒸水6 μL。反應(yīng)條件：（1）95℃，30 s；（2）95℃，15 s；（3）65.5℃，34 s。（1）~（3）循環(huán)40次。使用熒光定量PCR儀（ABI7500Fast）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 序列測(cè)定與數(shù)據(jù)分析 通用引物ITS2可有效擴(kuò)增沉香屬樣本，擴(kuò)增長(zhǎng)度467 bp。以該引物擴(kuò)增產(chǎn)物為目標(biāo)序列，通過(guò)DNAMAN軟件篩選多態(tài)性位點(diǎn)（圖1）。一共有6個(gè)變異位點(diǎn)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)位于土沉香ITS基因所示序列第236位上的堿基可區(qū)分土沉香和馬來(lái)沉香、云南沉香。土沉香序列第236位上的堿基為C，而云南沉香和馬來(lái)沉香為T(mén)，以此位點(diǎn)差異利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)出土沉香特異性鑒定引物和探針（表2）。因?yàn)橥脸料?3個(gè)樣本的擴(kuò)增結(jié)果相同，云南沉香3個(gè)樣本的擴(kuò)增結(jié)果也相同，故選取任意3條土沉香序列與1條云南沉香序列進(jìn)行比對(duì)分析。

圖1 土沉香、云南沉香和馬來(lái)沉香序列比對(duì)

Figure 1 Sequence comparison of,and

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的影響

本研究基于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出土沉香特異性鑒定引物和探針，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行不斷優(yōu)化，最終確定了1.2.3中的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，該引物探針能特異性擴(kuò)增土沉香，對(duì)云南沉香、馬來(lái)沉香樣本和空白對(duì)照并沒(méi)有擴(kuò)增（圖2），故本研究中設(shè)計(jì)的引物探針可快速篩查出土沉香。同時(shí)，該特異性引物和探針具有良好的擴(kuò)增效率，當(dāng)模板濃度低至0.01 ng·μL-1時(shí)，仍具有明顯的擴(kuò)增（圖3）。檢測(cè)結(jié)果重復(fù)3次，均獲得相同結(jié)果。

圖2 土沉香實(shí)時(shí)熒光PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

Figure 2 Real-time PCR specific amplification of

圖3 土沉香不同濃度梯度實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果

Figure 3 Real-time PCR amplification ofwith different concentration of template

2.2 不同模板濃度梯度的熒光PCR擴(kuò)增

以引物AS-F和AS-R以及熒光探針AS-P對(duì)3個(gè)沉香屬樹(shù)種進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。土沉香隨機(jī)選取2個(gè)樣本，其余沉香屬樣品選取1個(gè)樣本，每個(gè)樣本2個(gè)重復(fù)。出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)的為土沉香樣本，未出現(xiàn)擴(kuò)增的為云南沉香、馬來(lái)沉香和空白對(duì)照。以引物AS-F和AS-R以及熒光探針AS-P對(duì)土沉香進(jìn)行不同濃度梯度的熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖3。擴(kuò)增曲線(xiàn)自左至右表示土沉香DNA模板最大濃度為10 ng·μL-1，按10倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)濃度梯度，最低為1×10-5ng·μL-1，每一濃度2個(gè)重復(fù)。當(dāng)模板濃度低至0.01 ng·μL-1時(shí)，仍有擴(kuò)增。檢測(cè)結(jié)果重復(fù)3次，均獲得相同結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究對(duì)土沉香、云南沉香和馬來(lái)沉香的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，經(jīng)比較分析，篩選出了單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，土沉香序列第236位上的堿基為C，而云南沉香和馬來(lái)沉香為T(mén)，并設(shè)計(jì)出可鑒定土沉香的特異性引物AS-F、AS-R和探針AS-P。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，該引物探針能特異性擴(kuò)增土沉香，且檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.01 ng·μL-1，是一種可快速、靈敏辨別土沉香與云南沉香和馬來(lái)沉香的方法。

3.2 討論

在物種鑒定過(guò)程中，雖然傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)方法仍然占有主導(dǎo)地位，但是近年來(lái)，由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究者利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行物種鑒定。這主要是DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)的迅猛發(fā)展給物種鑒定提供了豐富的資源；另一方面，利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行物種鑒定不僅簡(jiǎn)單、快捷，而且準(zhǔn)確性高，避免了形態(tài)學(xué)鑒定中存在的局限性。形態(tài)學(xué)鑒定主要依賴(lài)專(zhuān)業(yè)鑒定人員較高的鑒定技能和豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn)，但不能排除鑒定者對(duì)物種形態(tài)特征主觀感受的差異。分子生物學(xué)作為一種精確地分析鑒定手段，有別于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)，能從遺傳角度鑒別物種，具有鑒定過(guò)程快捷便利，適合大量樣本的鑒定；穩(wěn)定且重復(fù)性高；標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程，操作要求簡(jiǎn)單等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[11]。由于沉香屬植物的外表相似，特別是木材制品種與種之間難以區(qū)分，故利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行沉香物種的鑒定與分類(lèi)勢(shì)在必行。有實(shí)驗(yàn)表明，土沉香的新鮮材及其高溫干燥樣品可以通過(guò)DNA條形碼準(zhǔn)確識(shí)別[12]。還有實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CTAB法聯(lián)合DNA試劑盒法，簡(jiǎn)單、快速獲得高質(zhì)量沉香總DNA，透過(guò)正交試驗(yàn)快速獲得ITS2目的片段，為沉香的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析提供參考[13]。本研究在土沉香DNA條形碼的基礎(chǔ)上，篩選出單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)并進(jìn)一步設(shè)計(jì)了特異性的引物和探針，結(jié)果判定準(zhǔn)確和快捷，避免了條形碼在數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)中的不唯一性和條形碼方法進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)等過(guò)程的低效性。通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)并驗(yàn)證特異性引物探針，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定，有利于口岸快速篩查和準(zhǔn)確鑒定，有效地保障了土沉香的流失，對(duì)物種資源保護(hù)具有重要意義。

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Identification ofby Single Nucleotide Polymorphism

ZHANG Ming-zhe1，YIN Wen-xiu1，CHEN Zhe1，WU Shan1，YU Hui-zhen1，ZHANG Xiao-feng1，XU Jin2，LI Ming-fu2，WU Rong1

（1. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Hangzhou 310016, China; 2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China）

Leaves were collected and timbers of,andwere quarantined from March to July of 2017 from different provinces in China, and were amplified and sequenced. Screening of single nucleotide polymorphisms (SNP) by DNAMAN software, specific primers and probes were designed for. The real-time PCR test showed that the primer and probe could specifically amplify, and the sensitivity reached 0.01 ng·μL-1.

Real-time PCR; ITS; species identification

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.06.005

Q949.761.1

A

1001-3776（2018）06-0029-04

2018-05-21；

2018-09-09

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2017YFF0210304）；浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018C02041）；浙江省科技廳公益性項(xiàng)目（2017C32045）

張明哲，博士，高級(jí)農(nóng)藝師，從事物種鑒定和轉(zhuǎn)基因檢測(cè)研究；E-mail：mzzhang429@163.com。