邵志華， 李瑛澤， 許 潔， 于金軍， 劉志學(xué)， 李思光

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330031； 3. 同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092)

Prominin1為5次跨膜的膽固醇結(jié)合糖蛋白[1-2]，定位于干細(xì)胞/腫瘤干細(xì)胞和光感受細(xì)胞等細(xì)胞膜上表面的凸起[3-6]。目前，Prominin1的配體和功能尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，Prominin1的雙等位基因突變或缺失導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性，光感受細(xì)胞外節(jié)形成異常[7-12],因此，其可能在功能性質(zhì)膜凸起的形成上發(fā)揮重要作用[7,13]。雖然有研究證明Prominin1在光感受細(xì)胞表達(dá)[9,11,14]，但對(duì)其在視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)的表達(dá)鮮有報(bào)道。

Prom1cre/ERT2+/Gt(ROSA)26SorCAG-ZsGreen1+雜合鼠為Prominin1陽(yáng)性細(xì)胞示蹤小鼠，融合蛋白cre-ERT2在Prominin1啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)。腹腔注射他莫昔芬后，cre-ERT2與他莫昔芬結(jié)合轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，繼而cre剪切雜合小鼠基因組ZsGreen上游的終止序列(stop序列)，促進(jìn)綠色熒光蛋白ZsGreen的表達(dá)，即Prominin1陽(yáng)性細(xì)胞及其后代可見綠色熒光。

本研究使用Prom1cre/ERT2+/Gt(ROSA)26SorCAG-ZsGreen1+轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合免疫熒光和PCR技術(shù)，首次闡述了Prominin1在不同發(fā)育時(shí)期RPE的表達(dá)，豐富了Prominin1的組織表達(dá)譜，為視網(wǎng)膜的生長(zhǎng)發(fā)育及疾病發(fā)生的研究提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型C57BL/6小鼠(6～8周齡)購(gòu)于上海普爾畢凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。轉(zhuǎn)基因小鼠B6N;129S-Prom1tm1(cre/ERT2)Gilb/J(Prom1cre/ERT2+/-)和B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J(Gt(ROSA)26SorCAG-ZsGreen1+/+)購(gòu)于Jackson實(shí)驗(yàn)室(The Jackson Laboratory)。

1.2 試劑和抗體

他莫昔芬(T5648)、玉米油(C8267)、NaOH(S5881)、蔗糖(V900116)、EDTA(EDS)、Tris-HCl(T1503)、Triton X-100(T9284)、Tween 20(P1379)和熒光抗衰減封片劑(10981)購(gòu)自Sigma公司；無(wú)水乙醇(10009218)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；PBS(SH30256)購(gòu)自HyClone公司；TRIzol(15596-026)、驢抗小鼠(A-21209,1∶1000)、驢抗兔(A-11072,A-21206,均1∶1000)購(gòu)自Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR036A)和SYBR Premix Ex Taq II Mix(RR820A)購(gòu)自TaKaRa公司;Rabbit anti-Otx2抗體(AB9566,1∶500)購(gòu)自Millipore公司;Rat anti-Prominin1抗體(14-1331,1∶100)購(gòu)自eBioscience公司;DAPI(10236276001,1∶1000)購(gòu)自Roche公司;Donkey血清(017-000-121)購(gòu)自Jakson公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠 轉(zhuǎn)基因小鼠B6N;129S-Prom1tm1(cre/ERT2)Gilb/J和B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J按雌雄2∶1比例進(jìn)行合籠，獲得F1代雜合小鼠。F1代雜合小鼠出生后20d剪取尾尖，堿裂解法提取DNA后進(jìn)行PCR鑒定。堿裂解法采用NaOH(25mmol/L)和EDTA(0.2mmol/L)混合液，98℃裂解1h。裂解產(chǎn)物冷卻至室溫后用等量的Tris-HCl(40mmol/L,pH為8.8)中和后離心，上清液可用于后續(xù)的PCR反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因小鼠B6N;129S-Prom1tm1(cre/ERT2)Gilb/J的PCR鑒定引物序列為Mutant1 F： 5′-CAGGCTGTTAGCTTGGGTTC-3′, Mutant1 R： 5′-AGGCAAATTTTGGTGTACGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為320bp；B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J的PCR鑒定引物序列為Mutant2 F： 5′-GGCATTAAAGCA-GCGTATCC-3′，Mutant2 R： 5′-AACCAGAAGTGG-CACCTGAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為199bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為Taq Mix 12.5μL，引物各1μL，鼠尾裂解產(chǎn)物1μL，加去離子水至25μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為 94℃ 預(yù)變性3min，94℃變性30s，61℃退火30s，72℃ 延伸40s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸2min。篩選cre/ERT2+/CAG-ZsGreen1+雜合鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 小鼠合籠 野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠分別按雌雄2∶1比例進(jìn)行合籠，第2天早上檢查陰栓，有陰栓的小鼠為E 0.5(embryonic stage 0.5)。出生后第1天的新生鼠為P1(postnatal day 1)。

1.3.3 他莫昔芬誘導(dǎo)重組 他莫昔芬100mg先后溶于預(yù)熱的1ml無(wú)水乙醇和9ml玉米油中，配置成10mg/ml的溶液。孕鼠按100μg/g劑量腹腔注射，新生鼠按照80μg/g劑量腹腔注射。

1.3.4 冰凍切片 小鼠麻醉后經(jīng)4%多聚甲醛灌注，4℃固定過(guò)夜。PBS清洗后，用10%～30%蔗糖梯度脫水，經(jīng)OCT包埋劑-80℃包埋后，進(jìn)行冰凍切片(厚度12～14μm)。

1.3.5 熒光定量PCR 分離的RPE組織用TRIzol法進(jìn)行RNA提取，經(jīng)RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，1∶10稀釋后進(jìn)行熒光定量PCR。Prominin1的引物序列如下。正義鏈： 5′-GCCTCTACCCTGGAAG-CAAA-3′,反義鏈： 5′-GATGCTGGTGGATGGCTCTT-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度為100bp。PCR反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq II Mix 10μL,引物各1μL，稀釋的cDNA 1μL，加去離子水至20μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火100s，72℃延伸40s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。

1.3.6 免疫熒光染色 冰凍切片用PBS清洗3次后，用0.25%透膜液室溫透膜20min；PBS清洗3次后3% donkey血清室溫封閉30min，一抗按比例稀釋后4℃ 孵育過(guò)夜；PBS清洗3次后二抗和DAPI按比例稀釋后室溫孵育1h；PBS清洗3次，用熒光抗衰減封片劑封片，熒光共聚焦顯微鏡成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行配對(duì)樣品t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型的鑒定

引物Mutant1和Mutant2分別為轉(zhuǎn)基因小鼠B6N;129S-Prom1tm1(cre/ERT2)Gilb/J和B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J的鑒定引物。用Mutant1和Mutant2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)電泳可見320bp和199bp產(chǎn)物，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因小鼠為Prom1cre/ERT2+/Gt(ROSA)26SorCAG-ZsGreen1+雜合鼠，見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠示蹤Prominin1在不同發(fā)育時(shí)期RPE的表達(dá)

孕13.5d(E13.5)、15.5d(E15.5)和出生后1d(P1)的新生鼠，分別腹腔注射他莫昔芬，7d收取胎鼠和新生鼠的眼球，冰凍切片后進(jìn)行Otx2免疫熒光染色。由于RPE為色素上皮且表達(dá)Otx2，因此色素和Otx2可用于RPE的定位。E13.5和E15.5的胎鼠部分RPE中表達(dá)ZsGreen(圖2A′～F′)，而P1小鼠的RPE中不表達(dá)ZsGreen(圖2G′～I(xiàn)′)。示蹤小鼠RPE中ZsGreen陽(yáng)性表示此細(xì)胞在注射他莫昔芬時(shí)表達(dá)Prominin1，或者其可能來(lái)源于Prominin1陽(yáng)性的細(xì)胞，因此本結(jié)果說(shuō)明E13.5和E15.5時(shí)部分RPE可能表達(dá)Prominin1，而P1時(shí)的RPE不表達(dá)Prominin1。

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)Prominin1在不同發(fā)育時(shí)期RPE的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證示蹤小鼠的研究結(jié)果，用定量PCR檢測(cè)了Prominin1在野生型胎鼠和出生后小鼠RPE的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Prominin1在胎鼠的表達(dá)明顯高于出生后(P<0.01)；胎鼠中Prominin1在E13.5和E15.5高表達(dá)，均顯著高于E10.5(P<0.05)和E17.5(P<0.01)，但兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。出生后Prominin1的表達(dá)明顯下降，其在P1與P4的RPE中表達(dá)無(wú)差異。此結(jié)果與轉(zhuǎn)基因小鼠示蹤的結(jié)果一致。

2.4 免疫熒光檢測(cè)Prominin1在不同發(fā)育時(shí)期RPE的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證和探究Prominin1在不同發(fā)育時(shí)期RPE的表達(dá)，對(duì)E10.5、E13.5、E15.5、E17.5和P1的野生型小鼠RPE進(jìn)行了Prominin1免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果與熒光定量PCR的結(jié)果一致，在胚胎期的小鼠RPE中可檢測(cè)到Prominin1的表達(dá)(紅色熒光)，出生后未見Prominin1的表達(dá)，見圖4。其中E10.5、E13.5和E15.5的熒光較明顯(圖4A′～L′)，而E17.5的熒光較弱(圖4M′～P′)。

圖1 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠Fig.1 The detection of transgenic mice

圖2 轉(zhuǎn)基因小鼠示蹤Prominin1在不同發(fā)育時(shí)期RPE的表達(dá)Fig.2 Tracing the expression of prominin1using genetically modified mice in developmental RPE孕鼠(A～F,A′～F′)和新生鼠(G～I(xiàn),G′～I(xiàn)′)腹腔注射他莫昔芬7d后切片，用Otx2和DAPI進(jìn)行染色，熒光共聚焦顯微鏡成像；標(biāo)尺： A～F為100μm，G～I(xiàn)為200μm，A′～C′為25μm，D′～I(xiàn)′為50μm；TM： 他莫昔芬

圖3 PCR檢測(cè)Prominin1在不同發(fā)育時(shí)期RPE的表達(dá)Fig.3 The expression of Prominin1 in developmental RPE detected by RT-PCRE10.5與E13.5和E15.5的RPE比較，*P<0.05；胎鼠(E10.5，E13.5，E15.5，E17.5)與出生后(P1和P14)的RPE比較，**P<0.01；E10.5，E13.5和E15.5與E17.5的RPE比較，**P<0.01

3 討 論

RPE是一層位于神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間的單層色素上皮，其在支持、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)視網(wǎng)膜和維持視覺功能方面發(fā)揮著重要的作用[15]。因此，研究RPE的基因和蛋白表達(dá)對(duì)闡明RPE的生理和病理功能具有重要的意義。Prominin1是膽固醇結(jié)合糖蛋白，在多種上皮細(xì)胞中表達(dá)。但是其在RPE的表達(dá)尚未見報(bào)道。由于Prominin1位于細(xì)胞膜上表面的凸起，如微絨毛等，而RPE細(xì)胞上表面存在大量的微絨毛[16]，因此，推測(cè)RPE可能也表達(dá)Prominin1。

組織特異性遺傳修飾小鼠是細(xì)胞體內(nèi)示蹤研究的重要工具[17]。其中，組織特異性Cre/ERT2重組酶轉(zhuǎn)基因示蹤小鼠和ROSA26-ZsGreen報(bào)告系統(tǒng)小鼠雜交的后代，可用于示蹤組織特異性基因的表達(dá)。本研究使用Prominin1陽(yáng)性細(xì)胞的示蹤小鼠B6N;129S-Prom1tm1(cre/ERT2)Gilb/J和ROSA26-ZsGreen報(bào)告系統(tǒng)小鼠B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J雜交后代進(jìn)行了示蹤研究。本研究顯示，胎鼠的RPE中表達(dá)Prominin1，而出生后的小鼠RPE不表達(dá)。此外，對(duì)野生型小鼠的RPE的定量PCR和免疫熒光染色顯示，Prominin1主要在E13.5和E15.5達(dá)。與本研究不同的是，2011年，Jaszai等[14]利用原位雜交對(duì)胎鼠和出生后的小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行研究，結(jié)果顯示： Prominin1僅在神經(jīng)視網(wǎng)膜光感受細(xì)胞外節(jié)和部分內(nèi)核層細(xì)胞表達(dá)，而在RPE中未見Prominin1的表達(dá)。這種差異的原因可能是因?yàn)镽PE為色素上皮，細(xì)胞內(nèi)聚集大量的色素顆粒，這些色素對(duì)非熒光染色有一定的干擾。

Prominin1作為干細(xì)胞表面標(biāo)志物，已經(jīng)在神經(jīng)和腫瘤等多種干細(xì)胞表面被發(fā)現(xiàn)[18-20]，但是其具體的功能尚不清楚。然而，對(duì)視網(wǎng)膜退行性疾病的研究發(fā)現(xiàn)Prominin1的c.1726C>T純合突變可導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性[10]；插入突變可導(dǎo)致光感受細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良；R373C的錯(cuò)義突變可導(dǎo)致家族性黃斑變性[11]。對(duì)R373C錯(cuò)義突變小鼠的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Prominin1的突變可影響光感受細(xì)胞外節(jié)的形態(tài)發(fā)生；電鏡研究發(fā)現(xiàn)RPE內(nèi)有脂褐素樣物質(zhì)的異常堆積。

圖4 免疫熒光檢測(cè)Prominin1在不同發(fā)育時(shí)期RPE的表達(dá)Fig.4 The expression of Prominin1 in developmental RPE of mice shown by immunofluorescence不同發(fā)育時(shí)期的胎鼠(A～P、A′～P′)和新生鼠(Q～T、Q′～T′)的冰凍切片，用Otx2、Prominin1和DAPI進(jìn)行染色，熒光共聚焦顯微鏡成像；標(biāo)尺： A～T為50μm，A′～D′為12.5μm，E′～T′為25μm

這些研究結(jié)果提示Prominin1的突變可能會(huì)導(dǎo)致RPE的異常。由于RPE對(duì)神經(jīng)視網(wǎng)膜有營(yíng)養(yǎng)、支持和保護(hù)等功能，其形態(tài)和功能的異常也會(huì)導(dǎo)致光感受細(xì)胞的異常[21]。因此，Prominin1是否參與RPE細(xì)胞質(zhì)膜凸起的形成及其在RPE中的功能值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了Prominin1在胎鼠RPE中表達(dá)，特別是在E13.5和E15.5的表達(dá)明顯。本研究不僅豐富了Prominin1的組織表達(dá)譜，也為視網(wǎng)膜的生長(zhǎng)發(fā)育及疾病發(fā)生的研究提供了新的線索。

[1] MIRAGLIA S, GODFREY W, YIN A H, et al. A novel five-transmembrane hematopoietic stem cell antigen： isolation, characterization, and molecular cloning[J]. Blood, 1997,90(12)： 5013-5021.

[2] CORBEIL D, ROPER K, FARGEAS C A, et al. Prominin： a story of cholesterol, plasma membrane protrusions and human pathology[J]. Traffic, 2001,2(2)： 82-91.

[3] BAUER N, FONSECA A V, FLOREK M, et al. New insights into the cell biology of hematopoietic progenitors by studying prominin-1 (CD133) [J]. Cells Tissues Organs, 2008,188(1-2)： 127-138.

[4] IROLLO E, PIROZZI G.CD133： to be or not to be, is this the real question?[J]. Am J Transl Res, 2013,5(6)： 563-581.

[5] 石小軍,江華.胰腺腫瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,37(4)： 119-123.

[6] MARZESCO A M. Prominin-1-containing membrane vesicles： origins, formation, and utility[J]. Adv Exp Med Biol, 2013,777： 41-54.

[7] JASZAI J, FARGEAS C A, FLOREK M, et al. Focus on molecules： prominin-1 (CD133) [J]. Exp Eye Res, 2007,85(5)： 585-586.

[8] MICHAELIDES M, HUNT D M, MOORE A T. The genetics of inherited macular dystrophies[J]. J Med Genet, 2003,40(9)： 641-650.

[9] MAW M A, CORBEIL D, HELLWIG A, et al. A frameshift mutation in prominin (mouse)-like 1 causes human retinal degeneration[J]. Hum Mol Genet, 2000,9(1)： 27-34.

[10] ZHANG Q, ZULFIGAR F, XIAO X, et al. Severe retinitis pigmentosa mapped to 4p15 and associated with a novel mutation in the PROM1 gene[J]. Hum Genet, 2007,122(3-4)： 293-299.

[11] YANG Z, CHEN Y, LILLO C, et al. Mutant prominin 1 found in patients with macular degeneration disrupts photoreceptor disk morphogenesis in mice[J]. J Clin Invest, 2008,118(8)： 2908-2916.

[12] PRAS E, ABU A, ROTENSTREICH Y, et al. Cone-rod dystrophy and a frameshift mutation in the PROM1 gene[J]. Mol Vis, 2009,15： 1709-1716.

[13] FLOREK M, BAUER N, JANICH P, et al. Prominin-2 is a cholesterol-binding protein associated with apical and basolateral plasmalemmal protrusions in polarized epithelial cells and released into urine[J]. Cell Tissue Res, 2007,328(1)： 31-47.

[14] JASZAI J, FARGEAS C A, GRAUPNER S, et al. Distinct and conserved prominin-1/CD133-positive retinal cell populations identified across species[J]. PLoS One, 2011,6(3)： e17590.

[15] BHARTI K, MILER S S, ARNHEITER H. The new paradigm： retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2011,24(1)： 21-34.

[16] STRAUSS O. The retinal pigment epithelium in visual function[J]. Physiol Rev, 2005,85(3)： 845-881.

[17] GLASER S, ANASTASSIADIS K, STEWART A F. Current issues in mouse genome engineering[J]. Nat Genet, 2005,37(11)： 1187-1193.

[18] LUO Y, COSKUN V, LIANG A, et al. Single-cell transcriptome analyses reveal signals to activate dormant neural stem cells[J]. Cell, 2015,161(5)： 1175-1186.

[19] ZHOU Q, CHEN A, SONG H, et al. Prognostic value of cancer stem cell marker CD133 in ovarian cancer： a meta-analysis[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(3)： 3080-3088.

[20] CHEN Y L, LIN P Y, MING Y Z, et al. The effects of the location of cancer stem cell marker CD133 on the prognosis of hepatocellular carcinoma patients[J]. BMC Cancer, 2017,17(1)： 474.

[21] GOLESTANEH N, CHU Y, XIAO Y Y, et al. Dysfunctional autophagy in RPE, a contributing factor in age-related macular degeneration[J]. Cell Death Dis, 2017,8(1)： e2537.