殷玉蓮 張衛(wèi)紅 周 悅 葉媚娜 陳紅風(fēng)

乳腺癌是威脅當(dāng)代女性身心健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。流行病學(xué)研究顯示，乳腺癌患者中逾六成為激素受體(Hormone receptor，HR)陽性[2]，針對HR陽性的乳腺癌患者，內(nèi)分泌治療是常見的治療方式。其中，芳香化酶抑制劑(Aromatase inhibitor，AI)已經(jīng)成為絕經(jīng)后激素受體陽性乳腺癌的常見內(nèi)分泌治療藥物。但在提高患者生存率的同時，AI治療會帶來骨代謝異常、全身骨關(guān)節(jié)酸痛、骨質(zhì)疏松，甚至骨折等不良結(jié)局，這一系列變化被稱為芳香化酶抑制劑相關(guān)性骨丟失(Aromatase inhibitors-associated bone loss，AIBL)。在臨床實踐中，同期應(yīng)用AIs治療的乳腺癌患者，其骨密度、骨代謝指標(biāo)表現(xiàn)參差不齊。已有研究證實，健康人群中女性骨代謝異常發(fā)生風(fēng)險與ERα(Estrogen receptor alpha)第一內(nèi)含子上2個位點(rs9340799、rs2234693)的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)有關(guān)[3-5]。另有研究結(jié)果表明這2個位點SNPs與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)[6]，但與AIBL發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)研究較少。因此，本研究將探索rs9340799、rs2234693位點SNPs與AIBL的相關(guān)性，試從中篩選出AIBL易感的基因類型，以盡早預(yù)防AIBL的發(fā)生并為絕經(jīng)后乳腺癌患病群體的精準(zhǔn)治療提供新依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

所有病例來自上海中藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)乳腺科2015年10月—2017年4月期間門診及住院的乳腺癌術(shù)后應(yīng)用芳香化酶抑制劑治療(≤2年)、未合并其他惡性腫瘤、無家族史、否認合并用藥、簽署知情同意書的絕經(jīng)后患者?；颊咂骄挲g為58.56±6.81歲；平均絕經(jīng)時間為9.42±5.50年，絕經(jīng)時間≤10年、>10年的分別為67例和49例；接受AIs治療<1年、1～2年的分別有72例和44例；其中使用來曲唑51人，阿那曲唑34人，依西美坦31人。

1.2 ERα基因SNPs位點檢測

所有入組對象均抽取清晨空腹外周靜脈血2 mL，將其置于無菌無酶的EDTA抗凝試管，存放于-20℃環(huán)境。引物均由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計并合成。對目標(biāo)片段進行PCR擴增[7]，ERα基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳觀察圖見圖1。

圖1 ERα基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳觀察圖Figure 1 PCR product of ERα by the agarose electrophoresis

1.3 引物設(shè)計及基因位點測序方法

引物均由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計并合成，如下：rs9340799-F 5′TTGTTATTTTTTTGACACATGTTCT3′；rs9340799-R5′ AAAATGACAAAATGAAATTAGCTG3′214反向測序；rs2234693-F5′ ATCCAGGGTTATGTGGCAAT3′；rs2234693-R5′ CTAATAGACTTAATGTTTTTGCAGG 3′ 222反向測序?；蛭稽c測序儀型號為3730XL(美國ABI)，結(jié)果使用Seqman以及Chromas軟件進行分析，2位點的測序圖見圖2。

圖2 ERα基因位點測序圖Figure 2 ERα gene site sequencing mapNote：A.rs9340799 site；B.rs2234693 site.

1.4 骨密度測定

采用雙能X線吸收法測量腰椎(L1-L4)、股骨BMD，按常規(guī)腰椎、股骨檢測條件及體位，并對年齡、BMI指數(shù)等影響B(tài)MD的因素進行修正。每日開機后均用模體校正，錯誤率為0.5%，常年錯誤率<1%。

1.5 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用PLINK-doc-1.04對患者測序結(jié)果進行Hardy-Weinberg遺傳基因分布平衡檢驗。各基因亞型組間的計量和計數(shù)資料差異比較采用方差分析和卡方檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERα基因rs9340799、rs2234693位點基因型和等位基因分布

116例乳腺癌術(shù)后應(yīng)用AIs治療的患者中，ERα基因rs9340799位點，A、G等位基因的分布頻率分別為79%和21%；其中A/A型實際頻數(shù)76例，A/G型32例，G/G型8例(P>0.05)。ERα基因rs2234693位點中C、T等位基因的分布頻率為34%和66%；其中C/C型實際頻數(shù)為17例、C/T型為45例、T/T型為54例(P>0.05)，說明樣本具有群體代表性(表1)。

表1 ERα基因rs9340799、rs2234693位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

2.2 ERα基因rs9340799、rs2234693位點SNPs與腰椎BMD的關(guān)系

比較ERα基因rs9340799位點各基因型患者間腰椎BMD的差異，發(fā)現(xiàn)該位點的3種基因型(A/A、A/G、G/G)組間腰椎BMD值差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在A顯性模式下，即A/A、A/G基因型患者腰椎BMD(0.935±0.126 g/cm2)、(0.901±0.119 g/cm2)均高于G/G基因型患者(0.847±0.153 g/cm2)(P<0.05)。而該位點3組基因亞型的腰椎T值之間的差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 ERα基因rs9340799位點SNPs與腰椎BMD值和T值的關(guān)系

Note：When *P<0.05，compared to G/G.

比較另一ERα基因rs2234693位點各基因亞型患者間腰椎BMD的差異，發(fā)現(xiàn)該位點3種基因型(C/C、C/T、T/T)組間腰椎BMD值差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；在T顯性模式下，即T/T、C/T基因型的腰椎BMD(0.929±0.116 g/cm2)、(0.916±0.134 g/cm2)均高于C/C基因型患者(0.878±0.139 g/cm2)(P<0.05)；但T/T型與C/T型的患者腰椎BMD無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。且該位點3組基因亞型的腰椎T值之間的差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 ERα基因rs2234693位點SNPs與腰椎BMD值和T值的關(guān)系

Note：When *P<0.05，compared to C/C.

2.3 ERα基因rs9340799、rs2234693位點SNPs與股骨BMD的關(guān)系

比較ERα基因rs9340799位點各基因型患者間股骨BMD的差異，發(fā)現(xiàn)該位點的3種基因型組間股骨BMD值差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 ERα基因rs9340799位點SNPs與股骨BMD值和T值的關(guān)系

分析另一ERα基因rs2234693位點各基因亞型患者間股骨BMD的差異，發(fā)現(xiàn)該位點3種基因型組間股骨BMD值比較，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表5)。

表5 ERα基因rs2234693位點SNPs與股骨BMD值和T值的關(guān)系

3 討論

本研究納入的所有病例均為絕經(jīng)后乳腺癌患者，其AIBL的發(fā)生主要和絕經(jīng)狀態(tài)以及AIs治療相關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查表明，絕經(jīng)后女性的體內(nèi)雌激素水平普遍低于絕經(jīng)前女性[8]，更易出現(xiàn)骨代謝異常。應(yīng)用AIs治療即通過抑制芳香化酶，減少體內(nèi)雌激素，能夠降低對乳腺癌細胞刺激并提高療效，但也加速了骨代謝異常的發(fā)生。多項大型臨床研究已證實，AIs治療在帶來獲益的同時，對骨代謝異常的發(fā)生帶來較高風(fēng)險。ATAC[9]研究隨訪68個月數(shù)據(jù)顯示，阿那曲唑治療組的骨折發(fā)生率高于他莫昔芬治療組(11%vs. 7.7%)(P<0.01)。BIG1-98[10]研究則發(fā)現(xiàn)來曲唑組的骨折發(fā)生率高于他莫昔芬組(8.6%vs. 5.8%)(P<0.01)。MA.17R研究結(jié)果表明[11]，AI組發(fā)生骨折和新發(fā)骨質(zhì)疏松的風(fēng)險上升。因此，雌激素的缺乏可能是AIBL發(fā)生的重要原因。

雌激素在人體內(nèi)的作用離不開相關(guān)受體的介導(dǎo)，因此ERα基因多態(tài)性可能直接影響與雌激素相關(guān)的生命活動。ERα基因第一內(nèi)含子中存在重要的基因調(diào)節(jié)序列，其突變可能使ERα在表達與功能上產(chǎn)生差異[12]。曹蘭青等[13]研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體XbaⅠ X等位基因可能對乳腺癌患病風(fēng)險具有保護效應(yīng)。另有國內(nèi)研究表明漢族女性PvuⅡ pp型者比壯族女性罹患乳腺癌的風(fēng)險增加[14]。一項Meta分析顯示ERα基因PvuⅡ位點多態(tài)性與亞洲女性膝骨關(guān)節(jié)炎遺傳易感性有一定關(guān)聯(lián)性[4]。對144例患者的觀察發(fā)現(xiàn)，ERα基因XbaI位點多態(tài)性中XX等位基因?qū)τ诶夏昱泽y部骨質(zhì)疏松發(fā)病有一定的影響，且與年齡增長呈正相關(guān)[15]。由上可知，ERα第一內(nèi)含子上的XbaⅠ、PvuⅡ基因多態(tài)性與骨代謝異常的發(fā)生率以及乳腺癌的患病風(fēng)險存在關(guān)系，那么其與AIBL之間可能亦存在一定聯(lián)系。隨著研究的深入，ERα第一內(nèi)含子上的2個SNPs位點已被證實與骨代謝相關(guān)。王偉等研究發(fā)現(xiàn)ERα基因rs2234693位點基因多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥明顯相關(guān)[16]。另一研究則證實rs9340799中A等位基因與中國漢族女性的膝骨關(guān)節(jié)炎存在相關(guān)[17]。以上研究證實這2個SNPs位點與普通人群中的骨代謝異常存在相關(guān)，但對于乳腺癌術(shù)后應(yīng)用AI這一特殊人群骨代謝異常的基因多態(tài)性研究尚存空白。故本研究將rs9340799、rs2234693位點作為研究對象，以探索2位點SNPs與AIBL之間的關(guān)系。

本研究納入116名絕經(jīng)后乳腺癌術(shù)后應(yīng)用AIs治療的患者，行ERα基因rs9340799、rs2234693位點測序，發(fā)現(xiàn)2個位點的等位基因分布頻率以及各基因亞型實際頻數(shù)與正常人群女性中分布頻率和基因亞型的理論頻數(shù)一致，并與近年國內(nèi)已有相關(guān)報道和本課題組前期研究結(jié)果類似[7，18]，證明所選樣本具有代表性。通過比較各基因型患者腰椎骨密度發(fā)現(xiàn)，對于rs9340799位點，A/A、A/G基因型的腰椎BMD值均高于G/G基因型患者；而rs2234693位點的T/T、C/T基因型的腰椎BMD均優(yōu)于C/C基因型患者；攜帶純合型A、T基因型患者的腰椎BMD值高于攜帶有C、G等位基因的亞型。據(jù)此筆者認為ERα基因rs9340799、rs2234693位點SNPs可能是影響應(yīng)用AIs乳腺癌患者腰椎BMD值變化的因素之一，并從一定程度上預(yù)判AIBL的發(fā)生發(fā)展。但觀察比較各亞型之間腰椎T值、股骨頭BMD值、T值的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)攜帶有A、T等位基因患者的腰椎T值、股骨頭BMD值、T值表現(xiàn)雖優(yōu)于純合型C、G等位基因的患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能與不同部位的骨質(zhì)狀況差異、測量方法誤差、樣本例數(shù)較少有關(guān)，值得進一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芳香化酶抑制劑相關(guān)骨丟失(AIBL)的發(fā)生可能與ERα基因特殊的亞型相關(guān)。ERα基因rs9340799和rs2234693位點與AIs所致的腰椎骨代謝異常存在關(guān)聯(lián)，其中C、G等位基因可能是發(fā)生AIBL的易感型基因，可為絕經(jīng)后乳腺癌患病群體的精準(zhǔn)治療提供依據(jù)：對于攜帶這2組等位基因的患者，應(yīng)充分考慮其AIBL發(fā)生的風(fēng)險與AI治療獲益之間的利弊，選擇合適的內(nèi)分泌治療方案；對于已應(yīng)用AI治療的患者，則應(yīng)注重其骨代謝指標(biāo)及骨密度的隨訪監(jiān)測，積極且有效的預(yù)防骨丟失的發(fā)生及進展。

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