韓利東， 鄭 重， 王申元， 蘇廣華， 高廣琦， 武云喜， 張曉然， 烏日漢， 李光鵬， 張 立*

(1.內(nèi)蒙古大學(xué)省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室，呼和浩特 010070；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古內(nèi)大圣牧高科牧業(yè)有限公司，呼和浩特 011500)

日本和牛(Japanese black cattle)是日本當(dāng)?shù)攸S牛與海福特、安格斯等肉牛雜交培育的世界著名肉牛品種之一，其肌間脂肪豐富，肉中富含不飽和脂肪酸，質(zhì)地柔軟，鮮嫩可口，肉質(zhì)呈明顯的大理石花紋，在國際高檔牛肉市場上飽受青睞[1-3]。近年來，我國肉牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，傳統(tǒng)的養(yǎng)殖模式面臨著結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型，選擇優(yōu)良的肉牛品種及多元化的養(yǎng)殖模式使得中高檔肉牛的養(yǎng)殖在中國蓬勃發(fā)展[4-5]。為了滿足國內(nèi)市場消費的需求，很多企業(yè)從新西蘭、澳大利亞等國引進和牛、安格斯等優(yōu)質(zhì)肉牛品種。但是，活體引種成本高、常規(guī)繁育速度慢等一些問題嚴(yán)重影響了國內(nèi)中高檔肉牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了促進國內(nèi)良種肉牛的發(fā)展，2009年，內(nèi)蒙古大學(xué)通過體細胞克隆技術(shù)，成功培育出國內(nèi)首批體細胞克隆和牛。目前，已經(jīng)培育成國內(nèi)最大群體的純種和牛群,使得群體在短期內(nèi)快速擴繁的最有效的技術(shù)手段無疑是超數(shù)排卵(multiple ovulation)和胚胎移植(MOET)技術(shù)。目前，國內(nèi)外對影響牛的超數(shù)排卵效果的研究有很多，例如供體牛品種的選擇,供體牛的飼養(yǎng)管理水平,供體牛的月齡、外源激素種類、激素劑量、季節(jié)等[6-8]，但對和牛超數(shù)排卵的研究較少[9-10]，并且對體細胞克隆和牛的超數(shù)排卵的研究還沒有報道，鑒于此，本試驗研究了不同劑量FSH和不同季節(jié)對體細胞克隆和牛超數(shù)排卵效果的影響，以期摸索出一套成熟、穩(wěn)定的體細胞克隆和牛胚胎生產(chǎn)方案，為建立完善的體細胞克隆牛繁育體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

分別使用總劑量為320 mg、360 mg及400 mg的加拿大進口FSH，在春、夏、秋、冬季節(jié)利用CIDR+FSH+PG對體細胞克隆和牛進行超數(shù)排卵，探討體細胞克隆和牛超數(shù)排卵過程中的最佳FSH劑量，以及季節(jié)對體細胞克隆和牛超數(shù)排卵效果的影響。試驗于2017年1—12月在內(nèi)蒙古內(nèi)大圣牧高科牧業(yè)有限公司完成，具體方案見表1。

表1 試驗方案

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗動物及精液的選擇 選取內(nèi)蒙古大學(xué)通過體細胞克隆技術(shù)生產(chǎn)的系譜完整、無生殖道疾病、營養(yǎng)狀況良好，有正常發(fā)情周期的36～48月齡的體細胞克隆和牛及后代(見圖1)。細管凍精選自內(nèi)蒙古大學(xué)生產(chǎn)的體細胞克隆和牛種公牛(見圖2)的凍精。

圖1 體細胞克隆和牛供體

圖2 體細胞克隆和牛種公牛

1.2.2 供體體細胞克隆和牛的飼養(yǎng)管理 在超數(shù)排卵過程中飼養(yǎng)管理水平和營養(yǎng)水平是決定胚胎質(zhì)量的關(guān)鍵因素，超數(shù)排卵前應(yīng)對供體克隆和牛加強飼養(yǎng)管理，以提高克隆和牛的超排效果及胚胎質(zhì)量。從前期處理即放入CIDR前45～60 d，開始加強飼養(yǎng)管理，單獨組群并編號，每頭牛每天飼喂全價飼料3～4 kg，同時肌肉注射VA、VD和VE。

1.2.3 試驗藥品 新西蘭進口孕酮類制品：EAZI-BREED CIDR(controlled internal release device)1.9 g Progesterone/支；垂體促卵泡素(FSH),加拿大進口，400 mg/瓶(20 mL稀釋)；氯前列烯醇(PG)由上海計劃生育研究所生產(chǎn)，0.2 mg/支；2%的鹽酸利多卡因；杜氏磷酸緩沖液(PBS)，新西蘭生產(chǎn)，每份9.6 g；1.5 mol/L乙二醇冷凍液(含0.1 mol/L蔗糖)，美國生產(chǎn)，20 mL/瓶；保存液(Holding)，美國生產(chǎn)，50 mL/瓶。

1.3 試驗方法

1.3.1 超數(shù)排卵方法 將自然發(fā)情之日或放CIDR之日定為發(fā)情第0天，在第9天開始超數(shù)排卵，采用連續(xù)4 d注射FSH進行超排處理，并在注射FSH的第3天(第5針)同時注射PG，打完最后一針取CIDR，第13天觀察發(fā)情，進行人工授精。具體程序見圖3。

圖3 供體體細胞克隆和牛超排FSH遞減法注射程序

1.3.2 胚胎采集 在超數(shù)排卵發(fā)情后的第7天采取二路沖卵管法進行非手術(shù)沖胚。首先將牛保定以免操作人員受傷，用5 mL注射器抽取5 mL、2%的鹽酸利多卡因進行尾椎硬膜外麻醉。然后使用子宮頸粘液去除器吸除粘液。用直腸把握法將帶有鋼芯的沖卵管從陰門送到子宮角。當(dāng)沖卵管前端送達子宮角前端時，用20 mL注射器給沖卵管氣囊充氣約9～13 mL，氣囊充好氣后抽出沖卵管鋼芯；用50 mL注射器每次吸取20～45 mL沖卵液從輸入管注入子宮角，然后吸回，反復(fù)3～4次，每個子宮角用150～220 mL沖卵液，將回收液帶到實驗室內(nèi)放到集卵杯過濾,把過濾好的回收液在室溫下(18～22 ℃)靜置5～8 min，鏡檢。

1.3.3 胚胎級別鑒定 根據(jù)胚胎的形態(tài)、發(fā)育的狀態(tài)等將胚胎分為4級。A級：形態(tài)規(guī)則，卵細胞和分裂球的輪廓清晰，細胞質(zhì)致密，透明帶完整，色澤和分布均勻一致。B級：與A級胚胎相比細胞大小略微不均勻，但卵細胞和分裂球的輪廓清晰，細胞質(zhì)較致密，水泡樣和變性細胞不超過10%～20%。C級：形態(tài)變化明顯，卵細胞和分裂球的輪廓稍不清晰，細胞質(zhì)不均勻，色澤發(fā)暗，水泡樣和變性細胞占30%～50%。D級：胚胎變性、退化。

1.3.4 胚胎冷凍 將檢出的A、B級胚胎用保存液洗4～6次→1.5 mol/L乙二醇/保存液→平衡15～20 min裝管→冷凍儀(-5.5～-7.0 ℃)平衡5 min后植冰，繼續(xù)平衡5 min(溫度以0.3～0.6 ℃/min的速率下降),當(dāng)溫度降到(-32)～(-35) ℃平衡5 min→投入液氮。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Graph Pad Prism數(shù)據(jù)處理軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超排后發(fā)情效果分析

試驗使用比較成熟的超數(shù)排卵方法——CIDR+FSH+PG法，結(jié)果表明，試驗中的體細胞克隆和牛在撤出CIDR后的24 h內(nèi)發(fā)情率有所差異，但在36 h內(nèi)發(fā)情率均為100%，見表2。

表2 體細胞克隆和牛同期發(fā)情效果結(jié)果

2.2 體細胞克隆和牛超數(shù)排卵FSH最適劑量選擇試驗

表3結(jié)果顯示，使用FSH劑量為360 mg組獲得的胚胎總數(shù)和頭均胚胎總數(shù)顯著高于320 mg組(P<0.05)，但是低于400 mg組，差異不顯著(P>0.05)。360 mg組獲得的頭均可用胚胎數(shù)和胚胎可利用率均高于320 mg組和400 mg組，差異顯著(P<0.05)。由此，對36～48月齡的體細胞克隆和牛使用360 mg的FSH進行超數(shù)排卵試驗最適。

表3 體細胞克隆和牛超數(shù)排卵結(jié)果

注:同列數(shù)值之間標(biāo)有相同字母上標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)有不同字母上標(biāo)表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3 不同季節(jié)對體細胞克隆和牛超數(shù)排卵效果的影響

由表4結(jié)果可知，在內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)季節(jié)對體細胞克隆和牛超數(shù)排卵效果有一定的影響，在秋季超排獲得的胚胎總數(shù)、頭均胚胎總數(shù)、頭均可用胚胎數(shù)及胚胎可用率均高于春季、夏季和冬季，且夏季超排效果最差，差異均不顯著(P>0.05)。

表4 不同季節(jié)使用360 mg的FSH超排結(jié)果

3 討 論

供體牛在進行超數(shù)排卵時，使用FSH激素的劑量會受到母畜的年齡、體重、胎次、營養(yǎng)水平等因素的影響[11-12]，如果考慮不周將會影響母畜的超數(shù)排卵效果。在超數(shù)排卵過程中，如果超排劑量偏低可能會造成卵巢不啟動，不排卵，無法獲得胚胎；如果超排劑量偏高，可能會導(dǎo)致母畜的卵巢過度增大，未受精卵和不排卵的卵泡增多等結(jié)果[13-14]。試驗結(jié)果2.2表明，使用較大劑量的FSH時，獲得的胚胎總數(shù)和頭均胚胎數(shù)較多，但是胚胎可利用率明顯低于劑量較小的兩組。所以筆者認(rèn)為，超數(shù)排卵過程中最好選擇最適的FSH激素劑量，從而避免大劑量激素對母畜卵巢的損害，同時還能提高可用胚胎的利用率。

目前，關(guān)于季節(jié)對牛超數(shù)排卵效果影響的結(jié)論并不一致。Massey等的研究結(jié)果表明，季節(jié)對牛超數(shù)排卵效果無明顯的影響[6]；和占星等和Barati等的研究表明，季節(jié)對可用胚胎數(shù)的影響不顯著[15-16]。然而另一些研究者則認(rèn)為季節(jié)對牛的超排效果有顯著的影響，Lerner等研究結(jié)果表明，在春季對荷斯坦牛超排獲得的可用胚胎數(shù)極顯著高于其他季節(jié)[17]；徐照學(xué)等研究結(jié)果表明，秋季和冬季對牛超數(shù)排卵的效果優(yōu)于春季[18]；陳龍等和李強等的研究均表明，在夏季超排獲得的可用胚胎數(shù)顯著低于其他季節(jié)[19-20]。不同的試驗地點、飼養(yǎng)環(huán)境、超數(shù)排卵方案及供體牛的品種等因素可能導(dǎo)致上述結(jié)論的不一致性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在秋季對體細胞克隆和牛超數(shù)排卵獲得的胚胎總數(shù)、頭均胚胎總數(shù)、頭均可用胚胎數(shù)及胚胎可用率均高于春季、夏季和冬季，它們之間差異均不顯著(P>0.05)。在內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)的夏季(7月)，對體細胞克隆和牛超數(shù)排卵的效果是最差的，導(dǎo)致這樣結(jié)果的原因可能是炎熱季節(jié)引起的熱應(yīng)激。熱應(yīng)激能夠引起母牛子宮血流量降低和子宮內(nèi)溫度增加，從而影響胚胎附植前的發(fā)育和超數(shù)排卵效果[21-22]。因此，為減少熱應(yīng)激對體細胞克隆和牛超數(shù)排卵效果的影響，可在炎熱的夏季暫?；驕p少超數(shù)排卵工作，從而提高體細胞克隆和牛超數(shù)排卵的效率。

劉瀟等對純種育成和牛進行超排，獲得了頭均可用胚胎數(shù)達6.5枚以上的結(jié)果[3]。孫鳳俊等對成年日本和牛超排試驗，獲得了頭均可用胚胎數(shù)達6枚以上的結(jié)果[23]。郝海生等對青年日本和牛進行超排試驗，獲得了頭均可用胚胎數(shù)達6.23枚以上的結(jié)果[13]。本試驗結(jié)果表明，使用常規(guī)的超數(shù)排卵方法對體細胞克隆和牛進行超數(shù)排卵，在不同的季節(jié)均得到了良好的超排效果，說明體細胞克隆和牛在生產(chǎn)胚胎性能方面與常規(guī)和牛沒有區(qū)別。1938年，德國的科學(xué)家Spemman提出了細胞核移植的概念[24]，隨后小鼠成為了通過核移植技術(shù)獲得的首例哺乳動物[25]。1997年，隨著克隆羊Dolly的誕生[26]，促使體細胞克隆技術(shù)迅速的發(fā)展，打開了克隆動物研究的新局面。目前，體細胞克隆技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用，但是體細胞克隆動物各方面的生產(chǎn)性能還需要進一步研究。通過本試驗獲得的體細胞克隆和牛的胚胎，筆者分別進行了鮮胚與凍胚的移植試驗，并且獲得了較好的妊娠率(待發(fā)表資料)。