王博榮 李鵬程 劉菲 金發(fā)光

溺水事故常有發(fā)生，據(jù)全球統(tǒng)計，每年因海水淹溺導(dǎo)致的死亡總數(shù)達(dá)到14萬人。當(dāng)海水進(jìn)入肺內(nèi)，肺泡膜上皮屏障遭到破壞，蛋白滲出充滿肺泡腔，引起肺水腫，氣體交換障礙，導(dǎo)致呼吸衰竭，甚至死亡，這是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的生理特性[1]。因此，肺泡上皮細(xì)胞的再生和修復(fù)是改善肺損傷的關(guān)鍵。目前除了保守對癥支持治療，ARDS患者沒有有效的治療策略。然而有研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞移植為減少ARDS的病死率提供了一種可能途徑[2]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化能力和免疫調(diào)節(jié)特性，已報道能夠分化成肺泡上皮細(xì)胞，促進(jìn)再生，減輕炎癥，改善病理損傷，甚至減少急性肺損傷(acute lung injury, ALI)模型病死率[2-4]。然而，由于MSCs在ALI肺組織模型的低移植率和低分化率，導(dǎo)致治療效果不佳[5-6]。因此，闡明MSCs在上皮的修復(fù)功能，使干細(xì)胞在受損肺組織得以定殖，分化成肺泡上皮細(xì)胞，改善對ALI模型的治療作用的機制尤為重要[7]。

經(jīng)典Wnt信號通路，依賴β-catenin的聚集，是細(xì)胞增殖、活化，決定細(xì)胞命運，及胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞極性，發(fā)展成穩(wěn)定的成熟組織的基本通路之一[8]。最近的一些研究表明，實際上經(jīng)典Wnt通路及其下游信號分子對MSCs的自我更新和分化起著至關(guān)重要的作用，并且表達(dá)一些配體、受體、和Wnt通路的抑制劑[9]。Wnt配體綁定到Frizzled家族蛋白及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein, LRP)，可抑制糖原合成酶(GSK-3β)磷酸化和胞質(zhì)中β-catenin降解，從而使胞內(nèi)大量β-catenin聚集，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[10]。因此，β-catenin被認(rèn)為是經(jīng)典Wnt通路的一個關(guān)鍵信號調(diào)節(jié)器。

先前的研究顯示，在體外實驗中證實激活經(jīng)典Wnt/β-catenin通路能夠促進(jìn)大鼠MSCs分化成Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，不僅具有抗氧化功能，還能夠促進(jìn)自身向受損肺組織遷移、定殖[11]。然而，Wnt/β-catenin通路在體內(nèi)如何調(diào)節(jié)MSCs的增殖、分化，如何對ALI的治療起作用仍然未知。體內(nèi)環(huán)境十分復(fù)雜，與體外環(huán)境不同，會影響MSCs的定殖與分化。一項近期研究顯示，過表達(dá)β-catenin的慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的大鼠MSCs，通過激活Wnt /β-catenin信號通路，調(diào)節(jié)大鼠MSCs遷移、增殖、分化[12]。

目前，少有報道MSCs移植治療海水吸入引起的肺損傷治療效果，幾乎沒有證據(jù)表明MSCs移植治療海水吸入型肺損傷(seawater inhalation induced acute lung injury, SWI-ALI)的治療效果可以通過β-catenin過表達(dá)改善。本研究的目的是確定MSCs通過β-catenin過表達(dá)對受損的肺泡上皮細(xì)胞的修復(fù)作用和它對SWI-ALI大鼠模型的總體治療效果，從而進(jìn)一步明確其作用機制。

材料和方法

一、實驗材料

健康雄性SD大鼠，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，SPF級，實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。Ctnnb1基因的過表達(dá)慢病毒購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，L-DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，NIR815細(xì)胞標(biāo)記試劑盒購于美國affymetrix公司。配方海水：根據(jù)我國國家海洋局第三海洋研究所提供配方配制，主要成分及含量接近我國東南沿海海水：NaCl 26.518 g/L，MgCl22.447 g/L，MgSO43.305 g/L，CaCl21.141 g/L，NaBr 0.083 g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，pH 8.2，比重1.05，滲透壓 1 300 mmol/L。主要儀器設(shè)備：超凈工作臺購于中國蘇凈安泰公司，體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)購于美國Caliper Life Sciences公司，高速臺式離心機購于美國 Eppendorf公司。

二、研究方法

1. Ctnnb1基因過表達(dá)慢病毒包裝和構(gòu)建： 慢病毒載體EF1α-MCS-3FLAG-CMV-EGFP-T2A-Puromycin(過表達(dá)Ctnnb1)在上海吉凱有限公司包裝和構(gòu)建。空載體EF1a-EGFP作為一個空的對照。

2. 慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs： MSCs(5×104/孔)接種于六孔板，每孔2 ml，過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞換液，每孔加入1 ml完全L-DMEM培養(yǎng)基含10%血清，加入目的基因病毒(2E+8TU/ml)5 μl，最后加入0.5 ml感染增強液(5 μg/ml)。3 d后通過熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)效果，確定轉(zhuǎn)染效率。將轉(zhuǎn)染慢病毒載體的MSCs在普通正常DMEM培養(yǎng)基中， 37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵化。傳代至6～10代細(xì)胞用于實驗。

3. 構(gòu)建海水吸入型肺損傷大鼠模型： SD大鼠稱重，腹腔內(nèi)注入戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉，大鼠保持仰臥位，頭位高于水平30°。大鼠共36只，被隨機分為四組，每組(n=9)?？瞻讓φ战M：未經(jīng)任何處理健康大鼠：SWI-ALI模型組：每個大鼠氣道注入1 ml的配方海水，10 min后注入30 μl PBS；MSCs治療組：每個大鼠氣道注入1 ml的配方海水，10 min后注入MSCs(500 000個細(xì)胞于30μl PBS里)；MSCs-Ctnnb1治療組：每個大鼠氣道注入1 ml的配方海水，10 min后注入 MSCs-Ctnnb1(500 000個細(xì)胞于30 μl PBS里)。老鼠被置于含氧量正常房間中直到完全恢復(fù)清醒。4 h后大鼠被腹主動脈離斷處死。采集標(biāo)本送檢。

4. 蘇木精和伊紅染色： 采集右肺上葉標(biāo)本置入多聚甲醛溶液24 h，轉(zhuǎn)入75%乙醇溶液待送檢。取回蠟塊包埋組織，矢狀切片厚5 μm，切面蘇木精和伊紅染色。染色切片可以看到水腫、肺泡間質(zhì)炎癥和出血、肺不張、壞死、透明膜形成。每只動物隨機選取9個切片高倍視野觀察每張幻燈片。

5. MSCs標(biāo)記和追蹤： NIR815染料標(biāo)記細(xì)胞，NIR815染料的細(xì)胞(5×105)直接氣道注入海水處理過的MSCs治療組和MSCs-Ctnnb1治療組大鼠模型。每組三個肺組織標(biāo)本分別在處理后12 h，48 h體外肺部成像，使用光學(xué)成像系統(tǒng)(激發(fā)光=786 nm，發(fā)射光=814 nm，曝光時間4 000 ms)。自體熒光光譜模式使用軟件包大師2.4。肺部熒光強度是衡量器官目的區(qū)域與正?；骄盘柣谄毓鈺r間和目的區(qū)域的面積比(按比例縮小的計數(shù)/秒)。

結(jié) 果

一、MSCs慢病毒載體有效轉(zhuǎn)染

MSCs分別轉(zhuǎn)染空白對照EF1a-eGFP和目的基因EF1a-MCS-3FLAG-CMV- EGFP-T2A-Puromycin(過表達(dá)Ctnnb1)培養(yǎng)10代。本研究中，eGFP細(xì)胞陽性率反映了MSCs目的基因的轉(zhuǎn)染效率。第10代MSCs-Ctnnb1和MSCs-GFP的轉(zhuǎn)染效率通過熒光顯微鏡可檢測出，分析顯示轉(zhuǎn)染效率大于90%，見圖1。結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染是有效的和穩(wěn)定的。

圖1 同視野光學(xué)顯微鏡觀察(上層)和熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(下層)對比圖(×200)

二、實驗動物組織病理學(xué)檢測

從海水吸入型肺損傷鼠模型的肺組織觀察到肺泡壁增厚，肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，出血，肺泡滲出和水腫。然而在干細(xì)胞干預(yù)后4 h MSCs治療組和MSCs-Ctnnb1治療組比SWI-ALI模型組組織病理學(xué)特征明顯緩解。MSCs-Ctnnb1治療組比MSCs治療組病理改善效果更好，見圖2。

圖2 肺組織病理學(xué)檢測：海水吸入后4 h各組鼠模型肺組織病理學(xué)HE染色顯微鏡下形態(tài)(×200)

三、MSCs在肺組織內(nèi)的保留

MSCs治療組和MSCs-Ctnnb1治療組大鼠干細(xì)胞干預(yù)造模后12 h和48 h進(jìn)行肺組織體外近紅外光譜成像追蹤。彩色熒光圖像信號表明，MSCs-Ctnnb1治療組比MSCs治療組干細(xì)胞干預(yù)造模后12 h、48 h檢測熒光信號更強。每個組的信號在12 h后逐漸減弱，48 h后信號明顯減少，但仍能被檢測出，見圖3。

討 論

MSCs可以遷移和定殖到受損肺組織是ALI/ARDS的一個潛在治療策略。MSCs在受損肺組織相對低的移植率和分化率限制了對ARDS的有利治療作用[13-14]。在目前的研究中，將β-catenin基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSCs，經(jīng)典Wnt通路是細(xì)胞和組織發(fā)育、分化及其它生理功能的一個根本調(diào)控通路[8]。經(jīng)典Wnt通路的激活主要取決于β-catenin的聚集。經(jīng)典Wnt配體綁定卷曲(Fz)共受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP-5，6)，從而抑制糖原合成酶GSK-3β磷酸化及β-catenin降解，β-catenin大量積累進(jìn)而轉(zhuǎn)移入核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)[10]。因此，β-catenin被認(rèn)為是經(jīng)典Wnt通路的關(guān)鍵信號調(diào)節(jié)器。在研究中，利用慢病毒載體介導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染獲得長期穩(wěn)定的β-catenin基因過表達(dá)MSCs株。獲得的MSCs株傳10代測感染效率仍高達(dá)90%，并通過PCR和Western blot驗證了其感染效率是穩(wěn)定的。有研究表明β-catenin過表達(dá)使MSCs核內(nèi)β-catenin累積，被認(rèn)為可促進(jìn)Wnt/β-catenin通路的激活[7]。但β-catenin過表達(dá)激活Wnt/β-catenin通路的具體機制是什么，尚不清楚，還需進(jìn)一步探索及研究。

在體外實驗中證實激活經(jīng)典Wnt/β-catenin通路能夠促進(jìn)大鼠MSCs分化成Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，不僅具有抗氧化功能，還能夠促進(jìn)自身向受損肺組織遷移、定殖[11]。這表明經(jīng)典Wnt通路可提高M(jìn)SCs對肺損傷的治療作用。在目前的研究中，通過MSCs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染β-catenin基因，證實了Wnt/β-catenin通路對AWI-ALI大鼠模型的這種積極作用。

MSCs可能具有在受損炎癥點聚集，發(fā)揮抗炎作用，分化成特定細(xì)胞，修復(fù)受損組織的生物學(xué)功能。很多研究都證實了MSCs向炎癥、創(chuàng)傷、缺血和腫瘤等疾病受損部位遷移和定殖的能力，主要在受損點增殖而不是在無損傷的部位[15-20]。同樣，很多研究證實急性肺損傷鼠模型明顯比正常對照鼠模型干細(xì)胞移植效果好[3, 21]。近來其它研究中也有證實經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路在MSCs遷移中的積極作用[22-23]。通過細(xì)胞遷移實驗研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a和LiCl刺激經(jīng)典Wnt信號通路促進(jìn)骨髓MSCs遷移到受損肺組織[11]。與以上研究一致，本實驗結(jié)果表明β-catenin過表達(dá)的MSCs相比對照MSCs明顯增加其在AWI-ALI鼠模型肺內(nèi)的定殖。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路除了促進(jìn)干細(xì)胞遷移和定殖到急性肺損傷大鼠肺組織，對干細(xì)胞移植到復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境還有一個積極的保護作用，可以降低干細(xì)胞存活率的不利因素，如氧化物、炎癥因子、缺氧和缺血等。有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路保護骨髓MSCs抗氧化應(yīng)激，明顯增加干細(xì)胞存活率和抑制細(xì)胞凋亡[11]。此外體外實驗表明β-catenin過表達(dá)MSCs比對照組促進(jìn)增殖。所有這些機制可能促進(jìn)MSCs在海水吸入型受損肺內(nèi)的定殖作用。

圖3 體外近紅外光譜成像的肺組織熒光信號表達(dá)(SW+MSCs control：MSCs治療組；SW+MSCs-Ctnnb1：MSCs-Ctnnb1治療組)

很多研究指出MSCs可以調(diào)控大部分免疫細(xì)胞的活性[24-26]，在本實驗中也證實了MSCs能夠抑制ALI鼠模型體內(nèi)炎癥，多方面的證據(jù)支持這個結(jié)論：促炎因子如干擾素-γ、IL-1β、IL - 6的分泌減少，而抗炎細(xì)胞因子IL - 10增加[5, 21]，β-catenin過表達(dá)的MSCs放大這種效應(yīng)，然而基本機制尚不清楚，值得進(jìn)一步探索。

以上結(jié)果表明通過β-catenin過表達(dá)激活經(jīng)典Wnt/β-catenin通路提高間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及向受損肺組織的遷移能力，增加MSCs在肺內(nèi)的定殖、緩解病理損傷，能夠提高M(jìn)SCs對SWI-ALI的治療效果。

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