彭彥昆，趙 芳，李 龍，邢瑤瑤，房曉倩

0 引 言

番茄屬于茄科類蔬菜，富含多種維生素和多種礦物質元素，并有降血壓、降膽固醇和防癌的作用，是全世界栽培最為普遍的果蔬之一，在中國蔬菜栽培中也占有重要的地位，是生產上的大宗蔬菜之一。種子活力檢測是種子質量檢驗中的重要內容，而種子活力在貯藏過程中可能由于不利的貯藏條件和貯藏之前因種子干燥溫度過高而喪失[1]。蔬菜種子主要用于生產和培育，而損傷種子在進行田間種植繁殖時，會造成出苗率低、成苗率低、出苗時間長、出苗后生長速度慢甚至產量降低等影響。一些研究[2-7]證明高溫會顯著降低種子發(fā)芽率。因此，開展番茄種子熱損傷檢測對確保番茄果實產量和品質具有十分重要的現實意義。

損傷種子的識別主要依靠人工或機器視覺通過顏色來進行挑選和分級。Shatadal等[8]建立了基于顏色圖像分析的 4類神經網絡模型，用于正常、熱損傷、冷凍損傷和蟲害大豆種子的識別，其判別正確率分別為 99.6%，95%，90%，50.6%。圖像分析技術可以提供一種熱損傷種子識別方法，但熱受損種子并不總是在顏色上有差異，種子質量的變化往往伴隨其內含物質的變化，而機器視覺不能提供與化學成分有關的具體信息。近年來，近紅外光譜分析技術已逐步應用于種子質量檢測[9-19]。白京等[12]利用自主搭建的近紅外光譜檢測系統(tǒng)獲取玉米種子在450～900 nm的光譜，以紅墨水染色法測定得到的種子活力為參考值，建立了種子活力的定性判別模型，其中校正集與驗證集的判別正確率分別為 95.65%和86.67%。Tigabu等[13]利用近紅外透射光譜技術結合SIMCA及PLS-DA分析方法，對未老化和高溫高濕老化的馬尾松種子進行了定性分析，老化和未老化種子的判別正確率可達100%，不同老化處理時間之間的判別正確率大于75%，為從大批種子中分離劣變種子提供了可能。Spielbeauer等[16]利用自主搭建的漫反射近紅外光譜采集系統(tǒng)建立了玉米種子淀粉、蛋白質和含油量的定量預測模型，其相關系數在 0.66～0.89之間，為種子化學成分的測定提供一種新方法。

上述研究為利用近紅外光譜技術檢驗種子質量提供了理論基礎和方法依據，但目前種子質量檢測主要集中于化學成分含量的測定，而對種子熱損傷的無損識別的研究鮮有報道。熱損傷種子的早期檢測有利于提高種子的使用價值，提升種子企業(yè)的競爭力。本文以番茄種子為研究對象，應用近紅外光譜技術采集正常種子和熱損傷種子的光譜特征信息，并結合線性和非線性建模方法建立番茄種子熱損傷定性分析模型，為熱損傷種子的快速無損識別提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

本次試驗采用的近紅外光譜采集系統(tǒng)是實驗室自主搭建，該系統(tǒng)主要包括光譜儀（AVS-DESKTOP-USB2-EXT-12V，Avantes China，北京）、光學光纖（R200-7-VISNIR，Ocean Optics，USA）、光源（HL-2000，Ocean Optics，USA）、支架和計算機等。光譜儀的掃描范圍是980～1 700 nm，分辨率為4 nm。數顯鼓風干燥箱（GZX-9070MBE，上海博訊實業(yè)有限公司）。

1.2 樣品制備

本研究采用的試驗樣品購自北京市博收種子有限公司，品種為“奇奇”櫻桃番茄種子?？紤]到番茄種子在試驗過程中均單獨存放，故選擇種子粒數不能過多。經人工挑選共選取 120粒無裂紋、無蟲害、無霉變和飽滿的番茄種子，并編號單粒保存于自封袋中，在試驗之前樣品放置于4 ℃的環(huán)境中保存。

將番茄種子平均分為2部分，一部分用于獲得熱損傷種子組，另一部分作為正常種子組。種子正常干燥處理的溫度為38～48 ℃，當干燥溫度過高（大于60 ℃）時會導致種子熱損傷現象。有研究表明80 ℃高溫處理對種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及田間出苗率均有顯著影響[20-21]，故本試驗將干燥溫度設置為80 ℃；在高溫干燥過程中隨著處理時間的增長，種子活力的破壞越大，但為了獲得在外觀（顏色和表皮裂紋）上與正常種子無顯著差異的熱損傷種子組，通過試驗確定高溫處理時間為6 h。故本文通過將種子置入干燥箱內以80 ℃高溫持續(xù)烘6 h獲得熱損傷種子組。高溫加熱處理后，將種子單粒置入已編號的自封袋中，便于單粒種子的光譜采集和后續(xù)的發(fā)芽驗證試驗。

1.3 光譜采集

打開上述的近紅外光譜檢測系統(tǒng)，為了保證光譜儀的穩(wěn)定運行，光譜儀預熱至少30 min。然后對裝置的檢測參數進行設置：光譜積分時間為90 ms，像素平滑窗口寬度為1，掃描次數為6次。將種子逐粒從袋子中取出，按照順序放置在黑色背景上面進行單籽粒光譜采集，每粒種子采集 3次光譜，取平均值作為該樣本的原始光譜數據。為了消除暗電流的影響，需進行光譜校正。采集時先將裝置探頭放置在標準校正白板，采集白參考，再放置在標準黑板，采集黑參考，樣品反射率的計算公式如式（1）所示：

式中R為樣品的光譜反射率；I為樣品的反射光譜強度；Ia為白參考的反射光譜強度；Ib為黑參考的反射光譜強度（無單位）。

樣品集的劃分會影響模型的預測精度，而 Kennard-Stone（KS）方法被普遍應用在光譜數據的定性分析領域[22]。為了保證一定的建模樣本數量和得到穩(wěn)定的預測模型[22]，本文采用KS方法將樣品按照約3∶1的比例劃分為校正集與驗證集，其劃分結果如表1所示。

表1 Kennard-Stone樣品集劃分結果Table 1 Samples set division results by KS

1.4 種子發(fā)芽驗證試驗

為了驗證熱損傷種子組與正常種子組活力的差異性，將采集過光譜的種子按照編號順序放在發(fā)芽皿上，按照標準發(fā)芽試驗對番茄種子進行14 d的發(fā)芽試驗。通過每天統(tǒng)計的發(fā)芽數計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數和平均發(fā)芽日數。

式中Gt表示在t日時的發(fā)芽數，Dt表示相應的發(fā)芽日數，N表示種子總數，Gf表示在發(fā)芽試驗初期規(guī)定日期f天內的發(fā)芽種子數，Gr為發(fā)芽率，Ge為發(fā)芽勢，Gi為發(fā)芽指數，Gd為平均發(fā)芽日數。

1.5 數據分析方法

本文選取線性和非線性應用最廣泛的兩種分類判別模型，分別為偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和支持向量機（support vector machines，SVM）。PLS-DA算法是基于PLS回歸模型建立的判別分析算法[23-24]，通過建立光譜數據與類別特征之間的回歸模型，進行判別分析。支持向量機是一種基于有限樣本統(tǒng)計學習理論的有監(jiān)督機器學習方法，通過非線性映射將輸入變量映射到一個高維的特征向量空間，在高維特征空間進行線性回歸，依據結構風險最小化（structural risk minimization，SRM）原則，在高維空間構造最優(yōu)分類超平面，較好解決小樣本、非線性等問題[25-26]。本試驗將有正常種子的類別變量設為1，熱損傷種子的類別變量設為0，閡值設置為0.5，即當預測值大于0.5則判定為有正常種子，否則，判定為熱損傷種子。通過比較 2種模型的判別效果，選取最優(yōu)判別模型。數據處理與分析在 Matlab R2011b、OriginPro 8和Excel 2007中完成。

2 結果與分析

2.1 番茄種子光譜特性

圖1為60粒正常種子和60粒熱損傷種子的平均光譜圖。從圖1可以看出正常種子與熱損傷種子的光譜曲線的總趨勢和特征吸收峰基本相同。在1 200和1 500 nm附近處有2個明顯的吸收峰，1 200 nm為 C-H基的第二倍頻吸收波長[15]，代表了碳水化合物的特征吸收峰；1 400～1 500 nm為O-H基和N-H基的第一倍頻吸收波長[15]，分別代表了水分和蛋白質的特征吸收峰。由圖 1可以得出，熱損傷種子與正常種子在光譜強度上有差異，熱損傷種子的平均吸收率小于正常種子的平均吸收率，與Wang等[27]的研究報道一致。番茄種子經高溫處理后，種子內的蛋白質在加熱的物理作用下變性。蛋白質的變性作用主要是蛋白質分子內部的結構被破壞。天然蛋白質的空間結構是通過氫鍵等次級鍵維持的，而變性后次級鍵被破壞，蛋白質分子就從原來有序的卷曲緊密結構變?yōu)闊o序的松散伸展狀結構（一級結構并未改變）。天然蛋白質與變性蛋白質的結構差異會導致種子吸收光譜的差異。另一方面，熱損傷種子容易在籽粒中心產生了應力裂紋，然后沿著淀粉顆粒邊界向外圍擴展，導致種子內部的空隙增加[28]。當入射光照射到熱損傷種子上時，會產生更多衍射和漫反射光，而正常種子內部沒有裂紋，入射光會直接穿過種子，因此熱損傷種子具有較小的吸收率。

圖1 平均原始近紅外光譜Fig.1 Average raw NIR spectra

2.2 發(fā)芽驗證試驗結果

番茄種子的發(fā)芽驗證試驗結果如表 2所示，從表 2中可以看出熱損傷種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數均明顯低于正常種子，平均發(fā)芽日數高于正常種子。這表示熱損傷種子的萌發(fā)受到了抑制，其活力低于正常種子。

表2 番茄種子發(fā)芽結果Table 2 Germination results of tomato seeds

2.3 PLS-DA判別模型

主因子數的選擇是建立 PLS-DA模型的第一步，合理的主因子數既可以提高模型的預測精度，又可以提高模型的穩(wěn)定性。本文采用留一交叉驗證法[29]確定PLS-DA模型的最佳主因子數，主因子數初始范圍為1～20，步長為1，分別建立PLS-DA模型，得到校正集的判別正確率和交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）。因為模型得到的預測值并不是整數，且判別閾值為0.5，因此只有當預測值與類別真值之間的誤差小于0.5時才能判別正確，所以選擇RMSECV小于0.5對應的主因子數。再以校正集判別正確率作為評價指標，校正集的判別正確率高時所對應的主因子數即為最佳主因子數。

校正集判別正確率和交叉均方根誤差與主因子數的關系如圖2所示，RMSECV隨著主因子數的增加呈遞減的趨勢，主因子為1時，交叉驗證均方根誤差最大為0.5，主因子數在3～20范圍內時，RMSECV變化平緩，且當主因子數為 8時交叉驗證均方根誤差達到最小值。校正集總判別正確率隨著主因子數的增加呈遞增的趨勢，當主因子數為5時，其判別正確率達100%。考慮到主因子數小，更有利于模型的穩(wěn)定性，因此本試驗最終選取 5作為PLS-DA模型的最佳主因子數。

圖2 主因子數與判別正確率和交叉驗證均方根誤差的關系Fig.2 Relationships between classification accuracy,RMSECV and latent variable number

當主因子數為 5時，采用校正集樣品的原始光譜建立PLS-DA分類模型，其校正模型的判別效果如圖3a所示，其正常種子和熱損傷種子的判別正確率均為100%。為了進一步驗證所建立 PLS-DA模型，將未參與建模的驗證集樣品的原始光譜代入上述 PLS-DA校正模型并計算判別正確率，結果如圖 3b所示，其總判別正確率為96.67%，其中正常種子的判別正確率為100%，1個熱損傷種子被誤判為正常種子。

圖3 PLS-DA模型的判別結果Fig.3 Classification result of PLS-DA model

2.4 PAC-SVM判別模型

2.4.1 PCA預處理

由于原始光譜數據維數過高，若將其直接作為支持向量機的輸入變量，會導致模型過于復雜，運行時間過長。同時，冗余的光譜數據還會減少模型的預測精度。主成分分析（principal component analysis，PCA）是常用的一種面向模式分類的數據降維方法，是在保證盡可能多的反映原始信息的基礎上，用較少的主成分代替原來較多的光譜變量，從而達到簡化模型的目的[30]。因此，在建立 SVM 判別模型之前，利用 Matlab R2011b中的pca( )函數對番茄種子的原始光譜進行主成分分析，前 3個主成分的累積貢獻率已達到99.99%，能準確反映光譜數據信息。圖4為校正集光譜矩陣前3個主成分的得分分布圖，2類種子在三維得分圖中具有較好的聚類效果，因此可以通過PCA預處理方法提高模型的識別能力[31]。

圖4 主成分得分Fig.4 Principal component scores

2.4.2 PCA-SVM模型的建立與驗證

利用Matlab自帶的PLS_Toolbox_802工具包中的支持向量機算法建立熱損傷種子定性分析模型。不同的核函數可構成不同的SVM分類器，目前最常用的核函數分類器有多項式核函數、S型核函數、線性核函數和徑向核函數（radial basis function，RBF）等。因為徑向函數具有效率高、逼近速度快等優(yōu)點[32]，本文選取 RBF作為SVM的核函數，支持向量機類型為ε-SVM。對于RBF核函數的ε-SVM，有懲罰因子c、松弛變量g和基本參數ε需要優(yōu)化。其中懲罰因子c與可容忍的誤差相關，松弛變量g決定了數據映射到新的特征空間后的分布，決定了線性分類面的復雜度。本文采用交叉驗證法（cross validation，CV）確定這3個參數，其參數優(yōu)化結果如圖5所示。

當懲罰因子c為10、松弛變量g為0.32和基本參數ε為0.01時，采用SVM判別分析法結合PCA預處理建立番茄種子熱損傷定性識別模型，并對驗證集進行預測分析，其鑒別結果如圖 6所示。從圖中可以看出，其校正集與預測集的判別正確率均為100%，驗證集中其分類變量值與預測值的平均偏差為0.043，表明SVM模型可以很好區(qū)分正常種子和熱損傷種子。

圖5 ε-SVM的參數優(yōu)化結果Fig.5 Parameter optimization results of ε-SVM

圖6 PCA-SVM模型的判別結果Fig.6 Classification result of PCA-SVM model

3 結 論

本研究基于用近紅外光譜技術分析了正常番茄種子與熱損傷番茄種子的光譜特性，并利用偏最小二乘判別法和支持向量機建立了番茄種子熱損傷識別模型。以判別正確率和預測平均偏差來評價判別模型，得出以下結論：

1）PLS-DA和PCA-SVM模型的驗證集總正確率分別為96.67%和100%，表明2種模型均可用于番茄種子熱損傷識別。熱損傷種子與正常種子番茄即使在外觀上無顯著差異，但會在內部品質方面存在差異，體現在蛋白質、淀粉等指標的不同，這些指標又反映在光譜強度上，所以基于近紅外光譜技術對熱損傷番茄種子進行無損識別研究方法可行。

2）與PLS-DA模型相比，PCA-SVM判別效果更好，主成分數為 3，其校正集與預測集的判別正確率均為100%，且預測偏差較小，平均偏差為0.043，模型更穩(wěn)定。

3）近紅外光譜技術結合PCA-SVM方法可用于番茄種子熱損傷的無損鑒定，為種子質量檢驗提供了一種新的方法。

本研究對象是“奇奇”櫻桃番茄種子，在以后的研究中將考慮不同品種的番茄種子和其他種子，進一步提高基于近紅外光譜的種子熱損傷識別判定方法的可靠性。另外，本文利用原始光譜結合模式識別方法建立番茄種子熱損傷的判別模型，后續(xù)將對與種子質量相關的有效特征波長的選擇方法做進一步研究，開發(fā)簡易、低成本的基于近紅外光譜的熱損傷種子識別分級設備。

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