袁雪梅，姚嘉赟，郝貴杰，藺凌云，徐 洋，潘曉藝，尹文林，沈錦玉

（農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001）

草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國的主要淡水養(yǎng)殖品種。然而各種疾病的暴發(fā)嚴(yán)重阻礙了草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，如出血性疾病、細(xì)菌性腸炎和細(xì)菌性敗血癥，給草魚養(yǎng)殖戶造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）是我國第1株分離鑒定的魚類病毒，也是水生呼腸孤病毒屬中致病力最強(qiáng)的毒株[3-4]。由其引起的草魚出血病是草魚養(yǎng)殖過程中的最大病害，死亡率高達(dá)60% 以上，嚴(yán)重影響了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[5]。因其危害性大、流行范圍廣、發(fā)病季節(jié)長，使該病一直為我國魚類病毒病的研究重點(diǎn)[4，6]。學(xué)者們就該病毒的流行病學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)等進(jìn)行了研究[7-8]。然而國際上對(duì)GCRV的研究與哺乳動(dòng)物及禽呼腸孤病毒相比還有很大差距。研究病毒在體內(nèi)的復(fù)制增殖規(guī)律可進(jìn)一步揭示GCRV分子致病機(jī)理，從而為該病防治奠定基礎(chǔ)。目前對(duì)于該病尚無有效治療方法，主要依靠疫苗預(yù)防。我國從20世紀(jì)70年代開始研究草魚出血病疫苗，研制出的組織疫苗和細(xì)胞疫苗在生產(chǎn)上收到了較好效果[9]。目前在疫苗生產(chǎn)過程中多使用細(xì)胞來增殖病毒。GCRV在細(xì)胞上繁殖速度較快，一般培養(yǎng)2～3 d即可觀察到細(xì)胞病變（Cytopathological effect，CPE）[10]。當(dāng)前多使用CIK細(xì)胞來制備細(xì)胞疫苗，在病毒培養(yǎng)過程中多通過觀察細(xì)胞病變來收獲病毒。但這種方式并不能準(zhǔn)確反映病毒在細(xì)胞中的增殖規(guī)律，往往錯(cuò)過最佳收獲病毒時(shí)期，致使疫苗免疫效果不理想而造成經(jīng)濟(jì)損失。Real-time PCR技術(shù)具有靈敏度高、操作簡單、結(jié)果直觀、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠精確分析病毒在細(xì)胞中的增殖規(guī)律，從而為生產(chǎn)細(xì)胞苗提供依據(jù)[11]。為此，本研究利用建立的Real-time PCR方法，對(duì)GCRV在CIK細(xì)胞及草魚體內(nèi)的增殖復(fù)制進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，從而為GCRV致病機(jī)理研究和細(xì)胞滅活疫苗制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

M199培養(yǎng)基、胰酶：Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清：購自四季青公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T載體：購自TAKARA公司；Trizol Reagent：購于Invitrogen公司；DNA Marker：購自鼎國生物公司；SYBR Green熒光染料：購自TOYOBO公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒：購自愛思進(jìn)公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞、毒株及試驗(yàn)魚

草魚腎細(xì)胞系CIK、GCRV873由本實(shí)驗(yàn)室保存。用于本研究的草魚購自浙江省淡水水產(chǎn)研究所苗種基地，體重為10～15 g，分別置于4個(gè)體積約300 L自動(dòng)充氣水循環(huán)系統(tǒng)圓柱形水缸中飼養(yǎng)，每缸放40尾，飼養(yǎng)2周，水溫保持（26±1）℃；試驗(yàn)期間每天投喂顆粒性餌料2次，投餌之前先吸污換水。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)方法的建立

1.3.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中GCRV 873毒株 VP6蛋白編碼基因序列，應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物VP6-U及VP6-L，同時(shí)針對(duì)草魚內(nèi)參基因β-actin序列設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列（表1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 GCRV熒光定量PCR引物序列

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品制備 收集 GCRV 873毒株CIK細(xì)胞培養(yǎng)物，按照Trizol說明書抽提RNA；用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，分別用引物VP6-U/VP6-L和β-actin-U/β-actin-L擴(kuò)增病毒VP6基因及內(nèi)參基因β-actin。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，克隆于pMD-18T載體，并將陽性克隆送南京金斯瑞公司測(cè)序確認(rèn)。對(duì)測(cè)序正確的陽性克隆抽提質(zhì)粒，測(cè)定濃度，按公式[11]計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=（質(zhì)量/分子量）×6.02×1023。

1.3.3靈敏性試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 對(duì)重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。參照SYBR Green熒光定量試劑盒說明書，分別取稀釋好的重組質(zhì)粒1 μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×SYBR GreenⅠPCR反應(yīng)混合液10 μL，10 pmol/L的上、下游引物各1 μL，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)采用三溫循環(huán)，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 10 s；95 ℃變性 5 s，56 ℃退火 30 s；72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)，并收集熒光信號(hào)。

1.3.4特異性試驗(yàn) 分別取GCRV 873毒株、傳染性造血器官壞死癥病毒（IHNV）、鯉魚春季病毒血癥病毒（SVCV）核酸，以其為模板進(jìn)行Realtime PCR擴(kuò)增，20 μL體系加模板1 μL，并設(shè)立陰性對(duì)照。

1.4 病毒培養(yǎng)與滴度測(cè)定

將保存于液氮中的GCRV 873毒株接種于長成致密單層的CIK細(xì)胞，28 ℃吸附1 h；吸棄病毒液，加入與培養(yǎng)液等量的維持液（含2%FBS的M199），28 ℃恒溫培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞形態(tài)，直至出現(xiàn)80%細(xì)胞病變，收取病毒液進(jìn)行滴度測(cè)定。GCRV873的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)反復(fù)凍融后作連續(xù)10倍梯度稀釋，取10-3～10-108個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度取100 μL的病毒液接種于96孔板上的單層CIK細(xì)胞；每稀釋度接種8孔，28 ℃孵育 1 h 后棄去，加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)正常細(xì)胞為對(duì)照，連續(xù)觀察7 d。根據(jù)病變情況，按Karber氏法計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）。lgTCID50=L+ d（s?0.5）。式中：L為病毒最低稀釋度的對(duì)數(shù)，d為組距（稀釋系數(shù)），s為各組病變數(shù)與接種數(shù)比值之和[12]。

1.5 GCRV 873株在CIK細(xì)胞上的生長特性研究

CIK細(xì)胞培養(yǎng)于24孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長至致密單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用1×104TCID50/mL，每孔100 μL的GCRV 873毒株感染細(xì)胞。感染后分別 于 0、2、4、8、10、12、24、36、48、72 h 收取病毒細(xì)胞培養(yǎng)液，應(yīng)用建立的Real-time PCR方法檢測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的病毒RNA增殖情況，并通過對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)病毒滴度的測(cè)定，檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，同時(shí)分別顯微鏡觀察0、12、24、36、48、72 h 的CIK病變情況。

1.6 GCRV 873株在草魚體內(nèi)的生長特性研究

試驗(yàn)魚用MS222溶液（1 mg/L）麻醉，每尾草魚腹腔注射TCID50為1×106的GCRV 0.1 mL，對(duì)照組每尾注射同等劑量的滅菌生理鹽水。于注射后1、2、3、5、7 d取樣，每組隨機(jī)選取4尾試驗(yàn)魚，用MS222（1 mg/L）麻醉后，取其肝臟、脾臟、腎臟，用Trizol提取各組織RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用Real-time PCR方法測(cè)定肝臟、脾臟、腎臟中的病毒含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，查看擴(kuò)增曲線和Ct值等；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到樣品中內(nèi)參基因β-actin和病毒基因組的絕對(duì)拷貝數(shù)，再經(jīng)β-actin校正得到相應(yīng)的相對(duì)拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR檢測(cè)方法的建立

用特異性熒光定量引物VP6-U/VP6-L對(duì)病毒核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段與預(yù)期大小（102 bp）一致，且特異性好（圖1）。將擴(kuò)增片段克隆到pMD-18T后送測(cè)序，發(fā)現(xiàn)序列與Genebank上公布的序列一致。從不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)（圖2）可以看出，從1×101～1×106個(gè)拷貝數(shù)的質(zhì)粒擴(kuò)增曲線均呈“S”型，且與指數(shù)增長期的擴(kuò)增曲線平行，反映出PCR的擴(kuò)增效率相近，檢測(cè)靈敏度為1×101個(gè)病毒粒子。以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，以Ct值為Y軸，根據(jù)兩者的相關(guān)性得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=3.237×log（X）+39.63，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999，擴(kuò)增效率為103.7%。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3），GCRV病毒核酸擴(kuò)增曲線呈“S”型，而IHNV、SVCV及陰性對(duì)照均沒有擴(kuò)增曲線，說明所建立的檢測(cè)方法特異性好。

圖1 引物VP6-U、VP6-L PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 GCRV 873株在CIK細(xì)胞中的生長特性

GCRV 873株吸附CIK細(xì)胞1 h后，分別在0、2、4、8、10、12、24、36、48、72 h 收取細(xì)胞病毒液。對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)病毒滴度及RNA水平進(jìn)行檢測(cè)（圖3），并通過顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞病變情況（圖4）。由圖3可以看出病毒在感染CIK細(xì)胞0～12 h期間，病毒RNA水平很低，上升不明顯，病毒滴度處于較低水平，上升趨勢(shì)也不明顯；12～24 h期間，病毒RNA和病毒滴度開始明顯上升；24～72 h期間，病毒RNA急劇上升，而病毒滴度在24～48 h期間明顯上升，48 h后趨于平穩(wěn)，72 h時(shí)病毒滴度達(dá)到最高，為106.75TCID50/mL。GCRV 873株感染CIK后12 h時(shí)出現(xiàn)少量細(xì)胞聚集；24 h時(shí)，細(xì)胞聚集增多，出現(xiàn)空斑現(xiàn)象；36 h時(shí)，空斑變大；48 h時(shí)，細(xì)胞大量脫落；72 h時(shí)，細(xì)胞基本已脫落，只有零星細(xì)胞附著于板上（圖5）。

圖2 GCRV重組質(zhì)粒熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)

圖3 GCRV熒光定量PCR特異性檢測(cè)的擴(kuò)增反應(yīng)

2.3 GCRV 873株在草魚體內(nèi)的復(fù)制情況

GCRV 873株感染草魚后，其肝、脾、腎中的病毒RNA拷貝數(shù)變化如圖6所示。3個(gè)組織中的病毒RNA均呈先升后降趨勢(shì)，其中肝臟中的病毒RNA峰值位于感染后3 d，脾臟和腎臟峰值位于感染后2 d。3種組織中，病毒RNA峰值最高的為腎臟，肝臟次之，脾臟最低；肝臟、腎臟和脾臟中的病毒RNA分別在至感染后7、6、4 d時(shí)下降到趨近于零的水平。

圖4 GCRV 873株感染CIK細(xì)胞后病毒滴度與RNA復(fù)制水平變化規(guī)律

圖5 GCRV 873株感染CIK細(xì)胞后細(xì)胞病變情況

3 討論

本研究從病毒RNA拷貝數(shù)、子代病毒含量及細(xì)胞病變3個(gè)方面綜合分析GCRV在CIK細(xì)胞中的增殖過程。試驗(yàn)結(jié)果表明，GCRV在感染CIK細(xì)胞的早期病毒RNA拷貝數(shù)及病毒滴度均處于較低水平，說明這一時(shí)期的病毒多為殘余的原代病毒及最先釋放出來的子代病毒；24～72 h期間，病毒RNA水平迅速上調(diào)，呈現(xiàn)對(duì)數(shù)增長，而病毒滴度在24～48 h期間呈明顯上升，之后趨于平穩(wěn)；對(duì)照48 h的細(xì)胞CPE發(fā)展完全，說明細(xì)胞被完全裂解，胞內(nèi)病毒得以釋放，使病毒滴度趨于平穩(wěn)。曾令兵等[13]利用組織培養(yǎng)微量滴定系統(tǒng)，研究GCRV-854毒株在CIK細(xì)胞上的繁殖過程，其動(dòng)態(tài)曲線與本研究相似，但出現(xiàn)快速增殖的時(shí)間較本研究晚，說明不同毒株感染細(xì)胞的能力存在差異。鄒桂平等[14]在電鏡下觀察到GCRV在感染CIK細(xì)胞4 h以內(nèi)出現(xiàn)脫去部分外層衣殼的不完整病毒顆粒，感染8 h時(shí)漿胞內(nèi)出現(xiàn)大量亞病毒顆粒，無外層蛋白結(jié)構(gòu)，感染12～16 h后出現(xiàn)成熟的病毒粒子。丁清泉等[15]發(fā)現(xiàn)GCRV在感染細(xì)胞12 h后即開始增殖，24～72 h大量增殖，使細(xì)胞產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變效應(yīng)，5 d左右達(dá)到最大增殖，此時(shí)病毒的滴度最高，以后逐漸平緩。分析病毒在細(xì)胞中的增殖過程，不僅反映出病毒的生長特性，還指示出收獲細(xì)胞培養(yǎng)的病毒材料的最佳時(shí)間。

應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)GCRV在草魚體內(nèi)的病毒拷貝數(shù)，為精確分析病毒在魚體中的增殖過程提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)采用的毒株GCRV 873株為1型。該毒株在體外細(xì)胞中培養(yǎng)可使細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變，但是草魚感染后未出現(xiàn)發(fā)病死亡情況，而其肝、脾、腎中的病毒RNA水平出現(xiàn)短期上升后下降到對(duì)照水平的結(jié)果，也正與無發(fā)病死亡情況相符。殷亮[16]研究發(fā)現(xiàn)GCRV HZ08株在感染稀有鮈鯽后，脾臟和腎臟中的病毒RNA水平呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，與本研究結(jié)果一致。丁清泉等[15]發(fā)現(xiàn)經(jīng)人工感染GCRV的魚體腎臟組織細(xì)胞內(nèi)，存在無外衣殼的未成熟病毒。毛樹堅(jiān)等[17]觀察草魚出血病的病理切片發(fā)現(xiàn)在肝臟、肌肉、腎臟、脾臟、鰓等魚體組織中含有大量的病毒顆粒。在本研究對(duì)比3種組織中病毒RNA的含量，發(fā)現(xiàn)腎臟中的含量最高，提示在取樣檢測(cè)時(shí)，可優(yōu)先考慮腎臟組織。

圖6 GCRV 873株感染草魚后不同組織中病毒RNA復(fù)制水平的變化規(guī)律

4 結(jié)論

本研究顯示：GCRV 在感染CIK細(xì)胞12 h后病毒RNA和病毒滴度開始上升；24～72 h期間，病毒RNA急劇上升，病毒滴度則在24～48 h內(nèi)明顯上升，48 h后趨于平穩(wěn)，至72 h，病毒滴度達(dá)到最高，為106.75TCID50/mL。在感染CIK后36 h，所有細(xì)胞均已感染，72 h時(shí)，細(xì)胞基本上脫落。GCRV感染草魚后，均能在其肝、脾、腎中檢測(cè)到病毒，且病毒RNA均呈先升后降趨勢(shì)；腎臟中的病毒RNA含量最高，因此應(yīng)優(yōu)先采集腎臟組織進(jìn)行檢測(cè)。

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