程 燕，黃徐根

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耐力訓(xùn)練對高脂飲食小鼠脂肪組織NLRP3炎癥小體通路的影響

程 燕，黃徐根

安徽師范大學(xué) 體育學(xué)院，安徽 蕪湖 241000

目的：研究耐力訓(xùn)練對高脂飲食小鼠脂肪組織NLRP3炎癥小體信號通路的影響。方法：4周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常飲食對照組(NC，10只)、正常飲食運動組(NE，10只)、高脂飲食對照組(HC，12只)、高脂飲食運動組(HE，12只)。運動組小鼠每天進(jìn)行60 min的遞增負(fù)荷跑臺耐力訓(xùn)練(12~20 m/min)，5天/周，共16周。測定小鼠脂肪組織NLRP3炎癥小體通路相關(guān)基因、蛋白變化和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果：1)與NC組相比，HC組小鼠體質(zhì)量、附睪脂肪重量顯著增加(＜0.01)，血清TG、TC、LDL-c、FFAs顯著升高(＜0.01)，附睪脂肪NLRP3、ASC、Caspase1、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)顯著升高(＜0.01)，NLRP3、ASC、pro-casp1、p20蛋白含量顯著增加(＜0.01)，附睪脂肪MDA、H2O2含量和NOX活性顯著升高(＜0.01)，Mn-SOD活性顯著下降(＜0.01)；2)與NC組相比，NE組小鼠各項指標(biāo)沒有顯著差異；3)與HC組相比，HE組小鼠體質(zhì)量、血清TG、FFAs顯著下降(＜0.05)，在附睪脂肪重量沒有顯著變化的情況下NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)和NLRP3、ASC蛋白含量顯著下降(＜0.05或＜0.01)，pro-casp1蛋白含量沒有顯著變化，但p20蛋白含量顯著下降(＜0.05)；附睪脂肪MDA、H2O2含量和NOX活性顯著下降(＜0.05)，Mn-SOD活性顯著提高(＜0.05)；4）與NE組相比，HE組小鼠體質(zhì)量、附睪脂肪重量、血清TG、TC、LDL-c、FFAs和附睪脂肪NLRP3、ASC、Caspase1、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA、NLRP3蛋白含量等顯著高于NE組(＜0.05或＜0.01)。結(jié)論：長期遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練能有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織NLRP3炎癥小體信號通路激活，降低脂肪組織炎癥因子表達(dá)，這可能與脂肪組織氧化應(yīng)激降低有關(guān)。

耐力訓(xùn)練；脂肪組織；NLRP3炎癥小體；慢性炎癥；氧化應(yīng)激

已有研究表明，長期高脂飲食可導(dǎo)致肥胖[1,4]，提高II型糖尿病、代謝綜合征等的風(fēng)險。肥胖引起的慢性低度炎癥又被稱為“代謝炎癥”[19]，是導(dǎo)致胰島素抵抗的關(guān)鍵機制，慢性炎癥同II型糖尿病[13]、動脈粥樣硬化[16]等密切相關(guān)。同炎癥因子TNF-α一樣[40]，IL-1家族炎癥因子是肥胖誘導(dǎo)胰島素抵抗的重要介質(zhì)[39]。早前臨床研究指出，白介素受體阻滯藥阿那白滯素(Anakinra)阻斷IL-1信號可以降低II型糖尿病人群的炎癥水平，改善糖尿病狀況[31]。IL-1家族成員包括IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33，IL-1β為最經(jīng)典的炎癥因子，可以通過破壞胰島素信號通路降低脂肪細(xì)胞對葡萄糖攝取[21]。脂肪組織是慢性炎癥的主要來源，高脂飲食顯著提高小鼠脂肪組織IL-1β mRNA水平[30]，相反，IL-1β-/-小鼠能抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥[35]。肥胖時脂肪組織炎癥因子主要來自脂肪組織基質(zhì)血管組分中的巨噬細(xì)胞[42]，巨噬細(xì)胞可通過自身細(xì)胞表面的模式識別受體識別相關(guān)的病原體或微生物，主要包括Toll樣受體(TLRs)和Nod樣受體(NLRs)，NLRs家族的NLRP3還可以識別非微生物來源的危險信號（如代謝產(chǎn)物），結(jié)合半胱氨酸蛋白酶Caspase1、配體蛋白ASC形成炎癥小體，caspase1剪切胞漿中的前體IL-1β，調(diào)節(jié)成熟IL-1β分泌。研究表明，肥胖時脂肪組織NLRP3炎癥小體的激活在脂肪組織炎癥中起重要作用，NLRP3-/-小鼠對肥胖引起的脂肪組織巨噬細(xì)胞堆積和脂肪組織炎癥產(chǎn)生抗逆，胰島素敏感性較野生型肥胖小鼠提高[41]。有氧耐力訓(xùn)練為改善脂肪組織炎癥和系統(tǒng)性慢性炎癥的有效手段，生物學(xué)機制包括降低脂肪組織巨噬細(xì)胞數(shù)量，轉(zhuǎn)變巨噬細(xì)胞的炎癥激活狀態(tài)，降低炎癥因子表達(dá)等[24-26]。然而，耐力訓(xùn)練對高脂飲食小鼠脂肪組織NLRP3炎癥小體信號通路的影響到目前尚不清楚，本文研究目的是觀察長期遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練對高脂飲食小鼠脂肪組織NLRP3炎癥小體信號通路的影響，并探討氧化應(yīng)激的作用。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗對象

健康4周齡雄性C57BL/6小鼠44只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周隨機分為正常飲食對照組(Normal Diet Control,NC,n=10)、正常飲食運動組(Normal Diet Exercise,NE,n=10)、高脂飲食對照組(High Fat Diet Control,HC,n=12)、高脂飲食運動組(High Fat Diet Exercise,HE,n=12)。清潔級動物房飼養(yǎng)溫度23~26 ℃，相對濕度控制在55%~65%，每天光照12 h。高脂飼料購自上海普路騰生物科技有限公司，粗蛋白22.3 g/100 g（供能20%）、脂肪19.8 g/100 g(供能40%)、碳水化合物44.6 g/100 g（供能40%）。

1.2 運動干預(yù)和取材

適應(yīng)性飼養(yǎng)期間運動組小鼠進(jìn)行1周的運動預(yù)適應(yīng)(表1)，確保運動組小鼠能完成60 min的全程跑，各組篩選出8只用于正式實驗。正式實驗運動方案參考Kawanishi[26]的研究方案，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良：采用遞增負(fù)荷跑臺運動試驗，跑臺坡度為0，跑速12~20 m/min，起始速度12 m/min跑10 min，從13 m/min開始每7 min提高1 m/min，每天訓(xùn)練60 min，每周5 d，共16周。末次運動干預(yù)結(jié)束小鼠給食6 h，隨后禁食12 h處死小鼠取材：摘眼球取全血，血樣室溫靜置30 min，3 500 r/min離心15 min，收集上層血清， -20 ℃保存；取雙側(cè)附睪脂肪墊，-80℃冰箱保存。

表1 運動預(yù)適應(yīng)方案

1.3 指標(biāo)測試與方法

1.3.1 測定血清脂代謝相關(guān)指標(biāo)

根據(jù)南京建成甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、游離脂肪酸(FFAs)試劑盒通過酶標(biāo)儀測定小鼠血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、游離脂肪酸(FFAs)濃度。

1.3.2 測定脂肪組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)

根據(jù)南京建成丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、NADPH氧化酶(NOX)試劑盒通過酶標(biāo)儀測定小鼠脂肪組織MDA、H2O2含量和Mn-SOD、NOX活性。

1.3.3 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

預(yù)冷RIPA蛋白裂解液(碧云天)中均漿脂肪組織，14 000 r/min 4℃離心30 min，取上清液于-80℃保存?zhèn)溆?要去除上層油脂)，BCA法測定總蛋白濃度(Pierce)，通過10%濃度的SDS-PAGE凝膠和4%～20%濃度的梯度膠(Bio-Rad)電泳分離NLRP3(118kDa)、Caspase1(45kDa)、ASC(21kDa)、GAPDH(37kDa)等蛋白分子，濕法轉(zhuǎn)PVDF膜100v 100 min，麗春紅S染色，剪取目標(biāo)條帶，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，一抗 NLRP3 1：1 500(CST)；Caspase1 1:1 000(CST)；ASC 1:1 500(Abcam)；GAPDH 1:1 000(Santa Cruz)，5%脫脂牛奶稀釋，4℃孵育過夜，1×TBST洗PVDF膜3次，每次10 min；羊抗兔二抗1：5 000(CST)，5%脫脂牛奶稀釋，室溫孵育2 h，1×TBST洗PVDF膜3次，每次10 min，ECL法發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶并拍照，讀取條帶灰度值，目的蛋白與內(nèi)參灰度值比值為蛋白相對表達(dá)含量。

1.3.4 qRT-PCR法檢測基因表達(dá)

Trizol法提取脂肪組織總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA用于qRT-PCR實驗，具體方法參照鄒華剛[6]，即100 mg附睪脂肪于1 mLTrizol中剪碎，勻漿2~3次，14 000 r/min低溫離心10 min，取上清(去油脂)，加入200 μL氯仿，室溫靜置 5 min，14 000 r/min低溫離心15 min，取上層水相(～400 μL)加等體積異丙醇(約400 μL)，室溫靜置10 min,14 000 r/min低溫離心10 min，去上清，1 mL預(yù)冷75%乙醇重懸沉淀， 7 500 r/min低溫離心5 min，去乙醇，DEPC水(20 μL)溶解RNA，酶標(biāo)儀檢測RNA濃度和純度。通過TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，20 μL反應(yīng)體系：5×RT buffer 4 μL、RT酶Mix1 μL、Primer Mix1 μL、RNA模板2 μL、DEPC水12 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃15 min，98℃ 5 min。NLRP3上游引物(5’-3’) CTC TTA CTC CTG CCC CTC CT，下游引物(5’-3’)CTT ATG CGG GAT GGT CAG TT；IL-1β上游引物(5’-3’)TTT CTC CAC GCA GGA GAC TT，IL-1β下游引物(5’-3’)TCC ACG ATT TCC CAG AGA AC；TNF-α上游引物(5’-3’) AGC CCC CAG TCT GTA TCC TT，TNF-α下游引物(5’-3’) ATC CCT TTG CAG AAC TCA GG；IL-6上游引物(5’-3’)AGT TGCCTTCTT GGG ACT GA，IL-6下游引物(5’-3’)TCC ACG ATT TCC CAG AGA AC；ASC上游引物(5’-3’)TTA ATC CCA GCA ACC AGG AG, ASC下游引物(5’-3’)CTT GAG TTA GGC CAG CCT TG；Caspase 1上游引物(5’-3’)GAC AAG ATC CTG AGG GCA AA, Caspase 1下游引物(5’-3’)TCC TGC CAG GTA GCA GTC TT；GAPDH(5’-3’)AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG，下游引物(5’-3’)ACA CAT TGG GGG TAG GAA CA。SYBR Green摻入法進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min預(yù)變性→95 ℃ 15 s變性→60℃ 30 s退火→72 ℃ 45 s延伸，進(jìn)行50個循環(huán)，統(tǒng)計Ct值，以2-△△Ct值表示mRNA相對定量值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤形式呈現(xiàn)，以＜0.05為顯著性差異，以＜0.01為極顯著性差異。GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)研究運動和飲食的總體效應(yīng)，組間進(jìn)行兩兩比較。

2 實驗結(jié)果

2.1 體質(zhì)量和體成分的變化

表2數(shù)據(jù)表明，飲食對體重(BW)和附睪脂肪重量(EW)均有顯著影響(＜0.01)，總體上運動只對BW有顯著影響(＜0.05)，對EW無顯著影響，運動、飲食對BW和EW均不存在交互作用。組間兩兩比較顯示，同NC組相比，HC組小鼠BW和EW顯著增加(＜0.01)；同NC組相比，NE組小鼠BW、EW雖然下降，但無顯著性差異；同HC組相比，HE組小鼠BW要顯著低于HC組(＜0.05)，EW無顯著性差異。

表2 小鼠代謝和生理相關(guān)參數(shù)比較

注：*表示高脂與普通飲食相比＜0.05 **表示＜0.01；#表示運動與安靜相比＜0.05，##表示＜0.01，下同。

2.2 血清脂代謝指標(biāo)的變化

表3數(shù)據(jù)表明，飲食對TG、TC、LDL-c、FFAs均有顯著影響(＜0.01)，運動對TG、TC、LDL-c和FFAs均有顯著影響(＜0.05)，運動和飲食對TG、TC、LDL-c、FFAs均不存在交互作用。組間兩兩比較顯示，同NC組相比，HC組小鼠TG、TC、LDL-c、FFAs均顯著升高(＜0.01)；同NC組相比，NE組小鼠各項指標(biāo)均不同程度下降，但無顯著性差異；與HC組相比，HE組小鼠TG、FFAs顯著低于HC(＜0.05)；與NE組相比，HE組小鼠TG、TC、LDL-c、FFAs顯著高于NE組(＜0.01)。

2.3 小鼠脂肪組織炎癥因子相關(guān)基因表達(dá)

為研究運動對高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥的影響，我們檢測了附睪內(nèi)臟脂肪TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA。結(jié)果顯示，飲食對脂肪組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)均有顯著影響(＜0.01)，同樣，運動對脂肪組織TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)有顯著影響(＜0.05或＜0.01)，運動和飲食對TNF-α mRNA表達(dá)不存在交互作用，對IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)存在交互作用(＜0.05)。組間兩兩比較顯示，與NC組相比，HC組小鼠脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)均不同程度顯著升高(＜0.01)；與NC組相比，NE組小鼠脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)沒有出現(xiàn)顯著差異；與HC組相比，HE組小鼠脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)顯著低于HC組(＜0.01)；與NE組相比，HE組TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA顯著高于NE組(＜0.01)。

表3 小鼠血清脂代謝指標(biāo)比較

圖1 小鼠脂肪組織炎癥因子基因表達(dá)比較(n=8)

Figure1. Comparison of Gene Expression of Inflammatory Cytokines in Adipose Tissue of Mice among Groups

注：*表示高脂與普通飲食相比＜0.05 **表示＜0.01；#表示運動與安靜相比＜0.05，##表示＜0.01，下同。

2.4 小鼠脂肪組織NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)基因表達(dá)

為了檢測運動對高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織NLRP3炎癥小體信號通路的影響，我們檢測了附睪內(nèi)臟脂肪NLRP3、ASC、Caspase1 mRNA。結(jié)果顯示，飲食對脂肪組織NLRP3、ASC、Caspase1mRNA表達(dá)均有顯著影響(＜0.01)，同樣，運動對脂肪組織NLRP3、ASC、Caspase1 mRNA表達(dá)有顯著影響(＜0.01)，運動和飲食對NLRP3和Caspase1 mRNA表達(dá)不存在交互作用，對ASC mRNA表達(dá)存在交互作用(＜0.05)。組間兩兩比較顯示，與NC組相比，HC組小鼠附睪脂肪NLRP3、ASC、Caspase1 mRNA表達(dá)均顯著提高(＜0.01)；與NC組相比，NE組小鼠附睪脂肪NLRP3、ASC、Caspase1 mRNA表達(dá)均沒有顯著變化；與HC組相比，HE組小鼠附睪脂肪NLRP3、ASC、Caspase 1 mRNA表達(dá)均顯著低于HC組(＜0.05或＜0.01)；與NE組相比，HE組小鼠附睪脂肪NLRP3、ASC、Caspase 1 mRNA表達(dá)顯著高于NE組(＜0.05或＜0.01)。

2.5 小鼠脂肪組織NLRP3炎癥小體信號通路NLRP3、ASC蛋白表達(dá)的變化

為了研究運動對高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織NLRP3炎癥小體信號通路的影響，我們通過Western blot檢測了附睪脂肪NLRP3、ASC蛋白含量。結(jié)果顯示，飲食對脂肪組織NLRP3、ASC蛋白表達(dá)均有顯著影響(＜0.01)，運動對脂肪組織ASC蛋白表達(dá)有顯著影響(＜0.01)，對NLRP3蛋白表達(dá)沒有顯著影響，運動和飲食對NLRP3蛋白表達(dá)有交互作用(＜0.05)，對ASC 蛋白表達(dá)不存在交互作用。組間兩兩比較顯示，與NC組相比，HC組小鼠附睪脂肪NLRP3、ASC蛋白表達(dá)顯著升高(＜0.01)；與NC組相比，NE組小鼠附睪脂肪NLRP3、ASC蛋白含量沒有顯著差異；與HC組相比，HE組小鼠附睪脂肪NLRP3、ASC蛋白表達(dá)均顯著低于HC組(＜0.05)；與NE組相比，HE組小鼠附睪脂肪NLRP3蛋白表達(dá)顯著高于NE組，ASC蛋白沒有顯著差異。

圖2 小鼠脂肪組織NLRP3炎癥小體信號相關(guān)基因表達(dá)比較

Figure2. Comparison of Gene Expression of NLRP3 Inflammasome Pathway in Adipose Tissue of Mice among Groups(n=8)

圖3 各組小鼠脂肪組織NLRP3、ASC蛋白表達(dá)比較

Figure3. Comparison of NLRP3 and ASC Protein in Adipose Tissue of Mice among Groups(n=8)

2.6 小鼠脂肪組織Caspase1的變化

為了研究運動對高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織NLRP3炎癥小體信號通路活性的影響，我們通過Western blot檢測了附睪脂肪procasp1(45 kDa)及cleaved caspase1(p20 20 kDa)變化。結(jié)果顯示，飲食對附睪脂肪procasp1和p20蛋白含量均有顯著影響(＜0.01)，運動對附睪脂肪procasp1含量無顯著影響，對p20蛋白含量有顯著影響(＜0.01)，運動和飲食對procasp1和p20蛋白含量均無交互作用。與NC組相比，HC組小鼠附睪脂肪procasp1蛋白含量顯著升高(＜0.01)，p20片段含量顯著增加(＜0.01)；與NC組相比，NE組小鼠附睪脂肪procasp1、p20蛋白含量沒有顯著差異；與HC組相比，HE組小鼠附睪脂肪p20片段含量顯著低于HC組(＜0.05)；與NE組相比，HE組小鼠附睪脂肪procasp1、p20蛋白含量沒有顯著變化。

圖4 各組小鼠脂肪組織Caspase1活性比較(n=8)

Figure4. Comparison of Caspase 1 Activity in Adipose Tissue of Mice among Groups

2.7 小鼠脂肪組織氧化應(yīng)激變化

為了研究運動對高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織氧化應(yīng)激的影響，我們檢測了附睪脂肪脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛(MDA)和活性氧過氧化氫(H2O2)含量以及NADPH氧化酶(NOX)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性。結(jié)果顯示，飲食對附睪脂肪MDA、H2O2含量和Mn-SOD、NOX活性均有顯著影響(＜0.01)，運動對附睪脂肪MDA、H2O2含量和Mn-SOD、NOX活性均有顯著影響(＜0.05或＜0.01)，運動和飲食對MDA、H2O2含量均無交互作用，對Mn-SOD、NOX活性存在交互作用(＜0.05)。與NC組相比，HC組小鼠附睪脂肪H2O2、MDA含量和NOX活性顯著升高(＜0.01)，Mn-SOD活性顯著下降(＜0.01)；與NC組相比，NE組小鼠附睪脂肪MDA、H2O2含量顯著下降(＜0.05)，Mn-SOD活性顯著提高(＜0.05)；與HC組相比，HE組小鼠附睪脂肪H2O2、MDA含量和NOX活性顯著低于HC組(＜0.05)，Mn-SOD活性顯著高于HC組(＜0.05)；與NE組相比，HE組小鼠附睪脂肪MDA、H2O2含量和NOX活性顯著高于NE組(＜0.01)，Mn- SOD活性顯著低于NE組(＜0.01)。

表4 各組小鼠脂肪組織氧化應(yīng)激比較

3 分析與討論

3.1 耐力訓(xùn)練對高脂飲食小鼠體質(zhì)量、附睪脂肪及血脂的影響

長期高脂飲食為常見的肥胖、糖尿病動物模型造模方法，8~16周不等時長的高脂飼料喂養(yǎng)可顯著提高小鼠熱量攝入、體質(zhì)量和血清TG、TC、VLDL等[2,3,14]。為了提高肥胖造模成功率，本課題采用了16周高脂飼料喂養(yǎng)，脂肪供能比例為45%，經(jīng)過16周高脂飲食組小鼠體質(zhì)量較正常飲食對照組顯著提高，附睪脂肪為代表的內(nèi)臟脂肪重量顯著增加，血清TG、TC、LDL-c、FFAs水平均顯著升高，這與前人研究結(jié)果一致。體育運動在健身和預(yù)防疾病中的作用被高度重視，有氧類運動處方被廣泛應(yīng)用于多種慢性疾病的預(yù)防和干預(yù)治療[33]。前期動物實驗表明，有氧耐力運動可以改善或預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，改善脂代謝，降低脂肪含量，比如，Emami等[14]發(fā)現(xiàn)，8周遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練（15 m/min、15 min/d逐漸提高到20 m/min、60 min/d，每周5 d）可以顯著降低高脂飲食大鼠的熱量攝入和體質(zhì)量，降低TG、TC、LDL-c水平。鄒華剛等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，6周有氧耐力訓(xùn)練（12 m/min，90 min/天，每周5天）可以改善高脂飲食小鼠的血脂。本文發(fā)現(xiàn)，16周的遞增負(fù)荷運動（12～20 m/min，60 min/天，每周5天)可有效緩解高脂飲食小鼠肥胖的進(jìn)展，改善小鼠血脂，減少內(nèi)臟脂肪。

3.2 耐力訓(xùn)練對高脂飲食小鼠脂肪組織炎癥的影響

肥胖通常伴隨著骨骼肌、肝臟、脂肪、胰腺等局部組織和系統(tǒng)性炎癥水平提高，這種代謝紊亂引起的慢性低度炎癥又被稱為代謝性炎癥，慢性炎癥在鏈接肥胖和胰島素抵抗中起重要作用，在II型糖尿病發(fā)病中扮演重要的角色[8]。Weisberg[42]發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞數(shù)量大幅增加，巨噬細(xì)胞釋放了絕大部分的炎癥因子TNF-α、IL-1β等。前期研究表明，炎癥因子TNF-α為重要的胰島素抵抗介質(zhì)，能直接破壞脂肪組織、骨骼肌的胰島素信號通路，降低胰島素敏感性[20]。炎癥因子IL-1β同樣在肥胖相關(guān)胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用[21,35]。長期高脂飲食提高脂肪組織炎癥反應(yīng)，激活了經(jīng)典的炎癥信號通路，提高炎癥因子基因表達(dá)[34]。同前期研究結(jié)果基本一致，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16周的高脂飼料喂養(yǎng)顯著提高了小鼠脂肪組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)，表明脂肪組織炎癥水平提高。前期已經(jīng)有大量研究通過建立肥胖模型觀察運動對肥胖小鼠脂肪組織炎癥的影響，或觀察高脂飲食的同時運動干預(yù)對脂肪組織炎癥的影響，均表明耐力運動對改善或預(yù)防脂肪組織炎癥有著良好的效果[27,28]。同樣，大量人體實驗表明，長期有氧運動干預(yù)對改善肥胖或糖尿病人群脂肪組織炎癥效果明顯[11,12]。本實驗同樣證明，耐力訓(xùn)練可以有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖性脂肪組織炎癥，抑制脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)。

3.3 耐力訓(xùn)練對高脂飲食小鼠脂肪組織炎癥小體的影響

脂肪組織巨噬細(xì)胞釋放的IL-1β可在局部作用于脂肪細(xì)胞，影響脂肪細(xì)胞的胰島素敏感性、脂肪生成，為肥胖相關(guān)胰島素抵抗的關(guān)鍵機制[10]。脂肪組織巨噬細(xì)胞釋放成熟IL-1β分子的過程需要兩個信號嚴(yán)格調(diào)控。1）飽和脂肪酸、TNF-α等炎癥介質(zhì)通過TLR4/NF-КB信號通路提高巨噬細(xì)胞IL-1β基因表達(dá)，合成前體IL-1β，前體IL-1β沒有生物活性[36]。2）NLRP3炎癥小體通過激活半胱氨酸蛋白酶caspase1剪切前體IL-1β分子，形成IL-1β，分泌到局部或外周血[22]。有幾項研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體為肥胖相關(guān)危險信號的感受器，NLRP3炎癥小體激活與代謝紊亂密切相關(guān)。Vandanmagsar等[41]發(fā)現(xiàn)，長時間高脂飲食顯著提高小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞表達(dá)NLRP3、ASC mRNA，而脂肪細(xì)胞NLRP3、ASC mRNA表達(dá)量極少。高脂飲食顯著激活皮下和內(nèi)臟脂肪NLRP3炎癥小體(Caspase1活化)，內(nèi)臟脂肪尤為顯著，附睪脂肪Caspase1隨高脂飲食干預(yù)時間延長活化水平進(jìn)一步提高。NLRP3-/-小鼠對肥胖誘導(dǎo)的脂肪組織NLRP3炎癥小體激活產(chǎn)生抵抗，同時胰島素敏感性顯著高于正?；蛐托∈螅贸齆LRP3基因還能降低脂肪組織IFN-γ、IL-1β mRNA表達(dá)，提高初始T細(xì)胞數(shù)量，降低效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量。Stienstra等[38]通過研究NLRP3-/-、ASC-/-、Caspase1-/-3種小鼠同樣發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體通路在肥胖誘導(dǎo)的炎癥和胰島素抵抗中起重要作用。NLRP3-ASC炎癥小體通路還在肥胖誘導(dǎo)的胰腺炎癥中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)節(jié)IL-1β分泌影響胰島β細(xì)胞功能和胰島素分泌[43]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16周高脂飲食顯著提高了脂肪組織NLRP3、ASC、Caspase1 mRNA表達(dá)，NLRP3 、ASC 蛋白表達(dá)同樣顯著提高，Caspase1顯著激活，提示，高脂飲食激活了脂肪組織NLRP3炎癥小體。Vandanmagsar等[41]的研究還發(fā)現(xiàn)，熱量限制、運動訓(xùn)練均能顯著降低肥胖的2型糖尿病患者脂肪組織NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)。然而，目前，耐力訓(xùn)練對高脂飲食動物脂肪組織NLRP3炎癥小體通路的影響尚不清楚，本實驗首次發(fā)現(xiàn)，16周有氧耐力訓(xùn)練顯著抑制了脂肪組織炎癥小體激活，降低了NLRP3、ASC、Caspase1 mRNA表達(dá)，降低了NLRP3、ASC蛋白含量，抑制caspase1激活。

3.4 耐力訓(xùn)練對高脂飲食小鼠脂肪組織氧化應(yīng)激的影響

肥胖總是伴隨脂肪組織氧化應(yīng)激水平提高[15]和抗氧化酶活性下降，提示脂肪組織氧化還原平衡被破壞[32]。長期高脂飲食還提高了氧化應(yīng)激相關(guān)的基因表達(dá)，Ko等[29]發(fā)現(xiàn)，5周高脂飲食顯著提高了小鼠附睪脂肪NADPH氧化酶(NOX2)mRNA表達(dá)，NOX為脂肪細(xì)胞活性氧(ROS)主要來源。脂肪組織氧化應(yīng)激在高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗中扮演著重要角色，超氧化物歧化酶(SOD)模擬物可以降低高脂飲食小鼠脂肪含量，改善脂肪組織炎癥[37]。有意思的是，脂肪細(xì)胞特異性敲除錳超氧化物氣化酶(Mn-SOD)的小鼠雖然脂肪組織超氧化物水平提高，但該小鼠對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖產(chǎn)生抵抗，因為Mn-SOD的缺失刺激了線粒體生物發(fā)生和解偶聯(lián)呼吸，提高了能量消耗和代謝率[18]。氧化應(yīng)激為脂肪組織炎癥的一個重要機制，NOX產(chǎn)生的ROS可以上調(diào)脂肪細(xì)胞炎癥因子IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)表達(dá)[17]。MCP-1為募集外周血單核/巨噬細(xì)胞浸潤脂肪組織的主要趨化因子，在高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織慢性炎癥中扮演著重要角色[23]。ROS還是激活NLRP3炎癥小體信號通路的一個重要機制[9]。Furukawa等[15]發(fā)現(xiàn)，高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織產(chǎn)生大量的過氧化氫(H2O2)，抗氧化酶表達(dá)和活性下降，NOX蛋白表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，16周高脂飼料喂養(yǎng)提高了小鼠脂肪組織脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物MDA和H2O2的含量，提示氧化應(yīng)激水平提高，另外，NOX活性顯著提高，Mn-SOD活性下降。有氧運動訓(xùn)練可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織氧化應(yīng)激，降低脂質(zhì)過氧化(MDA)，提高抗氧化酶表達(dá)[5,29]。Ko等[5]發(fā)現(xiàn)，8周遞增負(fù)荷耐力運動顯著降低了高脂飲食小鼠附睪脂肪NOX2 mRNA表達(dá)，提高了MnSOD mRNA表達(dá)，同時脂肪組織慢性炎癥得到改善，提示，運動對慢性炎癥的改善與氧化應(yīng)激下降有關(guān)。本文也發(fā)現(xiàn)，16周有氧耐力訓(xùn)練能降低高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織氧化應(yīng)激，MDA、H2O2水平下降，NOX活性降低，同時Mn-SOD活性提高。

4 結(jié)論

長期高脂飲食不但可激活小鼠脂肪組織NLRP3炎癥小體信號通路，還能提高NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)基因表達(dá)；長期耐力訓(xùn)練可明顯緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪組織炎癥，抑制NLRP3炎癥小體信號通路激活和相關(guān)基因表達(dá)，這可能與脂肪組織氧化應(yīng)激降低有關(guān)。

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The Effects of Endurance Training on NLRP3 Inflammasome Pathway in Adipose Tissue of Mice Fed a High-fat Diet

CHENG Yan, HUANG Xu-gen

Anhui Normal University, Wuhu 241000, China.

Objective: The aim of this study was to investigate the effects of endurance training on NLRP3 inflammasome signaling pathway in adipose tissue of mice fed a high-fat diet. Methods: 4-week old male C57BL/6 mice were randomly divided into normal diet control group(NC, n=10), normal diet exercise group(NE, n=10), high fat diet control group (HC, n=12) and high fat diet exercise group (HE, n=12). Exercise groups were trained on a motorized treadmill for 60 min/d at running speeds of 12-20 m/min, 5 times/week, for 16 weeks. NLRP3 inflammasome-related gene, protein changes and oxidative stress in adipose tissue were measured. Results:1) Compared with NC group, body mass, epididymal fat mass in HC group was significantly increased (<0.01), serum TG, TC, LDL-c, FFAs were significantly elevated (<0.01); epididymal fat NLRP3, ASC, Caspase1, TNF-α, IL-6 and IL-1β mRNA were markedly increased (<0.01), NLRP3, ASC, pro-casp1 and the clevaged caspase1 (p20) protein were also significantly increased (<0.01), epididymal fat MDA, H2O2 levels and NOX activity were increased significantly (<0.01) while Mn-SOD activity was reduced significantly (<0.01). 2) Compared with NC group, no significant difference was found among all parameters in NE group. 3) Compared with HC group, body mass, serum TG, FFAs in HE group was significantly reduced (<0.05). Although epididymal fat mass was not significantly reduced, NLRP3, ASC, Caspase1, TNF-α, IL-6 and IL-1β mRNA expression and NLRP3, ASC protein content were significantly reduced (<0.05 or<0.01). While the pro-casp1 protein was not significantly changed, p20 was significantly reduced (<0.05). In addition, epididymal fat MDA, H2O2 levels and NOX activity were significantly reduced (<0.05) while Mn-SOD activity was increased significantly (<0.05). 4) Compared with NE group, body mass, serum TG, FFAs, epididymal fat NLRP3, ASC, Caspase1, TNF-α, IL-6 and IL-1β mRNA expression and NLRP3 protein in HE group was significantly higher than NE group (<0.05 or<0.01). Conclusion: Long-term incremental load endurance training obviously inhibited the activation of NLRP3 signaling pathway and inflammation in adipose tissue-induced by high fat diet, possibly by reducing oxidative stress.

1000-677X(2018)02-0065-09

10.16469/j.css.201802006

G804.7

A

2017-12-13；

2018-02-02

安徽省高校省級自然科學(xué)基金重點項目(KJ2014A086)。

程燕,女,講師,碩士,主要研究方向為運動與健康促進(jìn),E-mail:1198601755@qq.com;黃徐根,男,副教授,博士,主要研究方向為肥胖與胰島素抵抗的運動干預(yù), Email:xugen huang@126.com。