王培培 劉長寧

摘要：指出了基因家族是植物基因組的重要組成部分，在植物整個生長發(fā)育過程中扮演著重要角色，參與各種生物、非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，而且在植物環(huán)境適應(yīng)性進化過程中可發(fā)揮重要作用。植物基因家族分析方法多樣，可選擇軟件較多，參數(shù)設(shè)置繁瑣，分析流程缺少規(guī)范性。為拉低學(xué)科差異的鴻溝與大數(shù)據(jù)分析的繁瑣性，構(gòu)建了一個植物基因家族全基因組鑒定與分析平臺，以小桐子Dof轉(zhuǎn)錄因子基因家族全基因組分析為例進行了平臺測試，可為植物基因家族的研究提供一個流程化參考。

關(guān)鍵詞：基因家族;分析平臺;全基因組分析

中圖分類號：S432.2+3

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9944（2018）07-0001-05

1 研究概況

由于存在物種特異性擴張，高等生物基因組中有豐富的多基因家族及超基因家族（superfamilies），20世紀70年代開始，人們逐漸對這種在生物個體和群體中產(chǎn)生遺傳變異并與基因組冗余有微妙關(guān)系的基因家族的研究產(chǎn)生了興趣[1]?；蚣易宄蓡T以簇狀或無規(guī)律形式分布于基因組的不同位置并在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）是基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控復(fù)雜的DNA到RNA的時空特異性表達，轉(zhuǎn)錄因子基因家族是植物中最大、作用最廣泛的基因家族之一[2]。由轉(zhuǎn)錄因子組成的轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物可以偶聯(lián)靶基因啟動子中的順式作用元件并啟動基因轉(zhuǎn)錄。例如，轉(zhuǎn)錄因子通過招募啟動子共激活因子、一般轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑因子等蛋白因子構(gòu)成轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物并激活RNA聚合酶，促進RNA轉(zhuǎn)錄鏈的起始及延伸[3]。

伴隨著二代測序的廣泛應(yīng)用及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，解析大數(shù)據(jù)密碼所隱含的生物學(xué)現(xiàn)象是生命科學(xué)研究者要解決的首要問題.基于這樣的契機，流程化分析平臺應(yīng)運而生。一些不斷更新的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫作為基因組序列的倉儲，為在全基因組水平研究轉(zhuǎn)錄因子基因家族提供了便利，常用的比較全面的大型數(shù)據(jù)庫比如NCBI、Ensembl和DDBJ等是轉(zhuǎn)錄因子研究的重要數(shù)據(jù)來源。常用的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫包括PlantTFDB4.0（ http： //planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）和PlnTFDB 3.0（ http：//plntfdb.bio.unipotsdam.de/v3.0/）等，為植物轉(zhuǎn)錄因子的研究提供了豐富的開源數(shù)據(jù)。

目前，有關(guān)植物基因家族全基因組分析的研究大部分都集中在一些重要的轉(zhuǎn)錄因子上，比如bZIP、MADS- box、SBP - box、WRKY、AP2/ERP、NAC等等，而對Dof（ DNA- binding with one zinc finger）鋅指蛋白的報道相對較少，它是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子基因家族，屬于鋅指蛋白超家族（ zine finger super - family）。Dof在多種代謝途徑及植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，包括C、N代謝、光響應(yīng)、種子發(fā)育和萌發(fā)等[4]。首個Dof轉(zhuǎn)錄因子蛋白被發(fā)現(xiàn)于玉米中（ZmDofl），在玉米糊粉層形成過程中有重要功能朝。近年來，相繼從擬南芥[6]、水稻[7]、大麥[8]、小麥[9]、大豆[10]、蓖麻[11]等物種中鑒定出Dof基因，并對其功能進行了深入地研究，不斷證實了Dof基因的功能重要性。

各種模式生物基因組測序工作完成之后，基因家族成為功能基因組學(xué)的研究熱點之一。基因家族全基因組分析的專業(yè)人士可以根據(jù)數(shù)據(jù)特征及分析目的自主選擇分析策略。但是，對于非專業(yè)的基因家族研究者而言，目前缺少一個流程化的分析平臺?；诜肿由飳W(xué)和生物信息學(xué)研究背景的復(fù)雜性，搭建一個基因家族分析平臺有其重要的現(xiàn)實意義。目前關(guān)于基因家族分析有很多值得借鑒的軟件工具與操作方法，但仍然存在很多值得完善的地方。例如，分析方法多樣化，可選擇軟件較多，參數(shù)設(shè)置繁復(fù)，分析流程復(fù)雜等。研究參考已有的分析方法，利用現(xiàn)有的硬件設(shè)施選擇合適的分析工具初步搭建了植物基因家族全基因組分析平臺，為植物基因家族流程化、規(guī)范化分析提供參考。

2 平臺搭建

輸入并整合分析蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)、核酸數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合基因家族全基因組鑒定模塊與挖掘分析模塊，完成流程化基因家族全基因組鑒定與分析。

2.1 測試數(shù)據(jù)來源

平臺應(yīng)用測試所涉及到的物種基因組信息是 從以下數(shù)據(jù)倉儲網(wǎng)站下載：小桐子最完整版基因組數(shù)據(jù)（Assembly JatCur1.0）來源于NCBI（ https：//WWW.ncbi. nlm. nih. gov/）;擬南芥Dof基因家族蛋白質(zhì)序列與核酸序列數(shù)據(jù)來源：TAIR 9.0（http：//www. arabi-dopsis. org/）;蓖麻Dof基因家族蛋白質(zhì)序列與核酸序列數(shù)據(jù)來源：PlantTFDB database（ http：//planttfdb.cbi. pku. edu.cn/）;小桐子Dof基因表達量數(shù)據(jù)收集于：SRA數(shù)據(jù)庫（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）。

2.2 平臺流程

平臺分析流程主要包括以下幾個步驟：基因家族成員鑒定與理化性質(zhì)分析;基因家族保守性分析;基因家族系統(tǒng)進化分析;基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守基序分析;基因在染色體上的位置與復(fù)制分析;基因表達模式分析;進化壓力分析（圖1）。分析流程中參考已有的分析策略結(jié)合現(xiàn)有的硬件設(shè)備，選擇了一系列較為高效便捷的軟件工具（圖2）。

2.3 結(jié)構(gòu)模塊

平臺沒計主要包括三個模塊，分別為可視化模塊、邏輯操作模塊和數(shù)據(jù)服務(wù)模塊。其中可視化用戶服務(wù)界面主要通過snakemake實現(xiàn);邏輯操作模塊主要包含各個分析模塊及其涉及到的應(yīng)用軟件T具;數(shù)據(jù)服務(wù)模塊主要是指基因家族分析使用的公共數(shù)據(jù)庫中的基因組數(shù)據(jù)（圖2）。

3 方法步驟

3.1 基因家族成員鑒定

為篩選出某物種基因家族所有成員，結(jié)合Blastp和hmmsearch兩種程序?qū)θ蚪M數(shù)據(jù)進行全面搜索。首先，利用待鑒定物種的全基因組蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，構(gòu)建本地Blast數(shù)據(jù)庫，以模式植物擬南芥轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)作為query序列執(zhí)行本地blastp程序（e- value設(shè)置為le-10）。其次，以Pfam蛋白結(jié)構(gòu)域模型作為hm-mquery序列，以物種全基因組數(shù)據(jù)作為HMM數(shù)據(jù)庫，執(zhí)行本地hmmsearch程序。兩部分篩選結(jié)果取交集，刪除冗余，所得候選序列利用SMART及NCBI- CDD工具進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測[12，13]，刪除不含目標轉(zhuǎn)錄因子特定功能結(jié)構(gòu)域的序列，同時剔除不含完整讀碼框的序列。利用ExPASy Proteomics Server（http：//ex-pasy. org/）工具對所有目標轉(zhuǎn)錄因子蛋白氨基酸序列進行分子量、蛋白質(zhì)長度以及等電點等理化性質(zhì)預(yù)測分析[14]。

3.2 蛋白質(zhì)保守性分析

為可視化分析目標轉(zhuǎn)錄因子蛋白的保守性，首先，使用DNAMAN軟件來提取目標基因家族蛋白質(zhì)的保守區(qū)域，結(jié)合smart驗證目標蛋白是否含有該家族特定的保守的功能domain[15];其次，通過ClustalW軟件對目標基因家族成員進行多序列聯(lián)配比對分析，鑒定出高度保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域.找到標志性功能位點，并用同種顏色標示保守的氨基酸[16]。

3.3 系統(tǒng)演化分析

首先，利用guidance2 工具對蛋白質(zhì)序列進行多序列聯(lián)配比對分析，設(shè)置梯度參數(shù)獲得信任值比較高的columns[17]。其次，使用提取得到的蛋白質(zhì)序列，結(jié)合MEGA6 [18]軟件采用鄰接法（Neighbor - Joining NJ）生成目標基因家族的系統(tǒng)演化樹，替換模式選用“poissonmodel”，校驗參數(shù)Bootstrap設(shè)置為1000。最后，使用在線的進化樹美化軟件EvolView等軟件對系統(tǒng)演化樹進行二次編輯修飾[19]。

3.4 基因家族蛋白結(jié)構(gòu)和功能基序的預(yù)測

每個成員基因核酸序列與核酸序列對應(yīng)的CDS序列，提交到Gene Structure Display Server（ GSDS2.0：http：//gsds2. cbi. pku. edu. cn/）[20]軟件分析基因結(jié)構(gòu)組成模式，包括內(nèi)含子、外顯子分布模式和數(shù)量特征等;利用在線工具MEME （multiple expectation maximiza-tion for motif elicitation）[21]對轉(zhuǎn)錄因子蛋白的功能mo-tif進行預(yù)測分析，長度參數(shù)設(shè)定為5～150，預(yù)測數(shù)量設(shè)置為10。

3.5 染色體定位和基因復(fù)制分析

結(jié)合物種基因組注釋GFF3文件，提取目標基因在染色體上的位置信息，將所有目標基因定位在該物種的染色體上，通過MapInspect[22]繪圖軟件繪制目標基因家族基因組染色體定位圖。利用McScanX[23]軟件判定基因發(fā)生片段復(fù)制，軟件執(zhí)行物種all-against-allblastp文件和包含基因位置信息的GFF3文件.計算該物種基因組中的共線性區(qū)段（e-value=le-10）.發(fā)生于同一個共線性區(qū)段的目的基因?qū)Ρ徽J為是發(fā)生片段復(fù)制的基因?qū)?另外，基因發(fā)生串聯(lián)復(fù)制事件的判定條件為：①兩個基因序列相匹配部分的長度大于較長序列的80%;②兩個基因序列相匹配部分的相似性應(yīng)大于80%;③緊密相連的基因中，只參與一次復(fù)制事件。結(jié)合基因在染色體上的位置，兩個基因應(yīng)位于同一條染色體上[24]。

3.6 選擇壓力分析

每一對發(fā)生復(fù)制的基因，根據(jù)其CDS序列，利用DnaSP[25]軟件計算復(fù)制基因?qū)Φ姆峭x替換率（Ka）和同義替換率（Ks）以及Ka/Ks值.分析發(fā)生復(fù)制事件的基因所受到的環(huán)境選擇壓力。①若Ka/Ks>1，正選擇壓力;②若Ka/Ks=1，受到中性選擇或自然選擇壓力;③若Ka/Ks<1，存在純化選擇作用。

3.7 基因家族的表達模式分析

基因的差異表達模式分析是基因功能研究的重要方法，為了進一步探究目標轉(zhuǎn)錄因子基因功能，收集基因在不同環(huán)境條件下（例如激素處理、鹽脅迫、干旱脅迫等）以及不同組織器官中的表達量數(shù)據(jù)（RNA - seq數(shù)據(jù)、表達芯片數(shù)據(jù)等），基因表達數(shù)據(jù)進行標準化處理之后，利用R、Heml[26]等軟件繪制表達譜熱圖。

4 測試與應(yīng)用

鑒于植物基因家族分析缺少流程化、規(guī)范化平臺，構(gòu)建了一個初級的基因家族全基因組鑒定與分析的平臺，依據(jù)其具體流程步驟，以小桐子Dof基因家族的全基因組鑒定與分析為例，對該平臺的方法進行實踐測試。小桐子是大戟科重要的多年生木本植物，因其種子含油量較高及花發(fā)育過程的特殊性是大戟科研究的一個潛在的模式植物。平臺測試分析過程中，對小桐子Dof基因進行全基因組篩選與鑒定，并對鑒定到的基因進行理化性質(zhì)、保守性、基因進化、基因結(jié)構(gòu)及功能mo-tif、染色體定位、表達譜、選擇壓力等進行系統(tǒng)性地研究分析，為小桐子Dof基因后續(xù)功能研究與開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)（表1）。

一共鑒定出了24個Dof基因，共編碼33條Dof蛋白，均屬于大分子蛋白，其理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果列表如表2。

5 總結(jié)

越來越多的植物全基因組測序完成，對基因家族的研究也越來越普遍，本研究初步搭建了一個植物基因組分析平臺。主要成果包括：整理了基因家族分析的比較常見的分析方法，歸納出了主要分析流程;設(shè)計了分析平臺主要結(jié)構(gòu)模塊主要包括可視化層一邏輯操作層一數(shù)據(jù)服務(wù)層等主要框架。利用小桐子Dof基因的流程化分析對該植物基因家族分析平臺進行了測試應(yīng)用，驗證了平臺的可行性。隨著高通量測序的大量產(chǎn)出和發(fā)布，本課題的研究工作能為從事植物基因家族分析的工作者提供參考，輔助其完成不同目的的基因家族分析。此外，本課題的工作對相關(guān)生物信息學(xué)平臺的設(shè)計與構(gòu)建也有一定的參考價值。

6 展望

目前，由于時間的限制、技術(shù)的不成熟等原因，該分析平臺仍然存在很多值得完善的地方。比如：本研究平臺初步建立，經(jīng)驗不足.有待繼續(xù)完善;自動化程度較低，后續(xù)snakemake可視化分析需要完善;本平臺可以為基因家族功能性分析及其分析平臺設(shè)計提供一定的參考。

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