王鳳婷， 靳盼盼， 劉 芳， 孫芝蘭， 吳海虹， 王道營， 許曉曦， 徐為民

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014； 2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

食品的安全、質(zhì)量及營養(yǎng)價值是人們密切關(guān)注的問題[1]。食品在收獲、加工、運輸、儲藏過程中容易變質(zhì)[2]，產(chǎn)生有害物質(zhì)或滋生新的致病菌[3]危害人體健康。腸球菌存在于人或動物消化道內(nèi)，特定條件下會成為病原體引發(fā)感染性疾病[4]，人感染會引起泌尿系統(tǒng)感染、心內(nèi)膜炎、傷口感染等，動物感染會引發(fā)腦炎、關(guān)節(jié)炎等[5]。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)為腸球菌屬革蘭氏陽性菌，屬于消化道內(nèi)正常菌群，但污染食品后會引發(fā)疾病發(fā)生，作為食源性致病菌已在生的豬肉、雞肉、牛肉及其他動物源食品中檢出[6-7]。由于抗生素的大量使用，糞腸球菌已經(jīng)對其產(chǎn)生耐藥性，因此在臨床治療中有一定難度[8]。吳悠[9]等使用齊墩果酸和二甲基亞砜有效抑制了糞腸球菌的生長，Tong等[10]研究了多西環(huán)素、枸櫞酸和去污劑組成的混合物(MTAD)與乳酸鏈球菌素(Nisin)復配對糞腸球菌的抑菌機理。

在肉類和家禽加工廠中使用最普遍的消毒劑即為有機酸[11]，乳酸作為三大有機酸之一[12]，能夠參與人體正常的代謝[13]，在達到殺菌目的的同時不對人體產(chǎn)生危害。乳酸具有很強的防腐保鮮功能，可作為食品添加劑用于果酒、飲料、肉類、食品等的加工中，具有調(diào)節(jié)pH、抑菌、調(diào)味、保持色澤等作用[14]。乳酸并非食物[15]，廣泛存在于發(fā)酵類食品中[16]，如酸奶、干酪、泡菜等。國內(nèi)外有很多關(guān)于乳酸菌及其細菌類產(chǎn)物抑菌特性及機理的報道[17-18]，但關(guān)于乳酸抑菌效果及機理的研究較少。本研究擬以一株從肉制品中分離得到的糞腸球菌為試驗菌株，研究乳酸對其的殺菌作用及機理，以期為今后以乳酸為基礎(chǔ)殺菌劑和保鮮劑的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用菌株為糞腸球菌(EnterococcusfaecalisR612-Z1)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所保存。試驗用的腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基購自北京陸橋生物公司。乳酸購自天津科密歐生物技術(shù)公司，熒光探針羧基熒光素雙乙酸酯[5(6)-cFDA]和3,3-Dipropylthiadicarbocyanine iodide[DiSC3(5)]均購自Sigma公司，碘化丙啶(PI)購自生工生物工程公司，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.2 儀器與設(shè)備

所用儀器和設(shè)備主要有Accuri C6流式細胞儀(BD公司產(chǎn)品)，PE(Ultra View VOX)轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦顯微鏡(鉑金埃爾默公司產(chǎn)品)，EVO-LS10掃描電子顯微鏡(蔡司公司產(chǎn)品)和BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司產(chǎn)品)。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng) 將凍存管中的糞腸球菌R612-Z1接種于新鮮的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，待生長至對數(shù)期時再次轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基中，重復3次，備用。

1.3.2 細菌活性試驗 按培養(yǎng)基體積1.00%接種活化后的糞腸球菌R612-Z1菌液于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)到OD600值為1.0時，取20 ml菌液分別置于不同的離心管中，4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌體沉淀，然后在各管中分別加入相同體積的乳酸溶液，其濃度分別為0.25%、0.50%、1.00%。將菌懸液放入搖床中，分別在0 min、10 min、30 min、60 min、120 min、180 min取樣，使用0.1 mol/L PBS緩沖液按照10倍遞增稀釋法[19]稀釋樣品至相應(yīng)濃度，取100 μl均勻涂布于BHI固體平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄菌數(shù)。

1.3.3 掃描電鏡 按培養(yǎng)基體積1.0%接種活化后的糞腸球菌R612-Z1菌液于BHI液體培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中培養(yǎng)至對數(shù)期，4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌體沉淀，用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌，去掉上清，加入同體積且質(zhì)量濃度為1.0%的乳酸，以只加入相同體積PBS緩沖液為對照。37 ℃處理2 h，4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌體沉淀，再用PBS緩沖液洗滌3次，除凈上清，4 ℃下用2.5%的戊二醛固定12 h[20]。在掃描電子顯微鏡下觀察菌體表面形態(tài)的變化。

1.3.4 細胞膜滲透性試驗

1.3.4.1 激光共聚焦顯微鏡檢測 使用羧基熒光素雙乙酸酯[5(6)-cFDA]和碘化丙啶(PI)來區(qū)分活細胞與死細胞[21]。取對數(shù)期的菌液在4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌體沉淀，用0.85%NaCl溶液洗滌菌泥后，其中一份加入同體積質(zhì)量濃度為1.00%的乳酸，另一份加入同體積生理鹽水的菌懸液作為對照，室溫下處理2 h，每15 min振蕩1次。收集菌泥重新懸浮在500 μl的生理鹽水中，加入熒光探針cFDA(終濃度為100 μmol/L)，避光保存10 min，然后加入PI(終濃度為30 μmol/L)，避光反應(yīng)10 min。混合液離心后用500 μl生理鹽水懸浮菌泥，取3 μl菌液到載玻片上，加上蓋玻片，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4.2 胞外ATP及紫外吸收物質(zhì)的檢測 取對數(shù)期的菌液在4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌泥，使用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌3次，將菌泥懸浮在質(zhì)量濃度為1%的乳酸溶液中，25 ℃下處理，分別在0 min、10 min、30 min、60 min、120 min、180 min取樣。將樣品于4 ℃、10 000g下離心1 min，取上清測定其胞外小分子ATP濃度和紫外吸收物質(zhì)(主要為核酸和蛋白質(zhì)等)濃度的變化。按照ATP測定試劑盒說明書測定樣品中ATP的含量，先測出ATP濃度與熒光值的標準曲線，然后在樣品中加入ATP檢測試劑，混合均勻后通過測定其化學發(fā)光值來確定ATP的濃度[22]。紫外吸收物質(zhì)的濃度以紫外分光光度計測定的OD260值來表示。

1.3.5 流式細胞儀 使用方法1.3.4.1中處理好的菌液，依次用cFDA和PI染色[23]，于4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌體，除去多余的熒光探針后，重懸于0.01 mol/L PBS緩沖液中。在檢測過程中以低速率(1 s 400～600個)收集50 000個細胞，分別在525 nm和620 nm處檢測樣品綠色熒光和紅色熒光，然后轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。通過分析每個區(qū)域細胞的百分比來確定糞腸球菌的損傷程度。

1.3.6 細胞電勢能的測定 使用熒光探針3,3-Dipropylthiadicarbocyanine iodide[DiSC3(5)]來測定糞腸球菌膜電位的變化。將活化好的菌液按培養(yǎng)基體積的1%接種于腦心浸液肉湯(BHI)液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)至對數(shù)期，于4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌泥。使用5.0 mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)與5.0 mmol/L葡萄糖配置的緩沖液(緩沖液A)洗滌菌泥2次[24]，然后將菌泥重懸于緩沖液A中，加入終濃度為0.5 μmol/L的熒光探針DiSC3(5)，室溫放置15 min，加入終濃度為100.0 mmol/L的KCl溶液，平衡K+濃度后，在樣品中加入乳酸，每個樣品取200 μl加入黑色的NBS板中，使用酶標儀檢測其熒光強度變化(激發(fā)波長為622 nm，發(fā)射波長為670 nm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的乳酸對糞腸球菌R612-Z1的殺菌效果

不同濃度的乳酸對糞腸球菌R612-Z1的殺菌效果如圖1顯示，樣品的初始菌數(shù)約為 1×108，質(zhì)量分數(shù)為1.00%的乳酸在10 min內(nèi)全部殺死細菌，0.25%和0.50%的乳酸全部殺死細菌分別需要60 min和30 min。在最初檢測點(0 min)，與對照相比，加入乳酸的樣品的菌數(shù)均有減少，這是由于樣品中添加乳酸后從混勻到取樣需要一定時間，同時也說明乳酸對糞腸球菌的殺菌作用明顯，并且殺菌迅速。

糞腸球菌菌數(shù)的對數(shù)值小于等于1.4時，菌數(shù)不可檢測；未加入乳酸的樣品為對照。圖1 不同濃度的乳酸對糞腸球菌R612-Z1的殺菌效果Fig.1 The antibacterial effect of lactic acid(LA) on Enterococcus faecalis R612-Z1 at different concentrations

2.2 乳酸對糞腸球菌R612-Z1細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖2顯示，未經(jīng)乳酸處理的對照組細胞完整，表面光滑，呈規(guī)則的球形，細胞間隙明顯。經(jīng)過質(zhì)量濃度為1.00%的乳酸處理1 h后，細胞外膜溶解，部分細胞壁缺失，菌體連成片，細胞嚴重變形，呈不規(guī)則球形，胞外能明顯看到有內(nèi)容物漏出。乳酸處理對糞腸球菌R612-Z1的細胞壁和細胞質(zhì)膜造成破壞[25]，導致內(nèi)容物漏出。

2.3 乳酸對糞腸球菌R612-Z1細胞膜滲透性的影響

2.3.1 轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦結(jié)果 細菌細胞通過核酸熒光探針5(6)-cFDA和核酸熒光探針PI進行染色，根據(jù)染色結(jié)果(圖3)可以直觀地看出細胞膜通透性的變化情況。5(6)-cFDA是一種疏水性復合物[21]，能進入具有完整細胞膜結(jié)構(gòu)的細胞，在非特異性脂酶水解作用下生成羧基熒光素(cF)，呈綠色熒光。PI僅能進入受損細胞，與DNA或RNA結(jié)合后呈現(xiàn)紅色熒光，PI進入胞內(nèi)后，cFDA發(fā)出的熒光變?nèi)鮗26]。因此，未受損的細胞呈綠色，破損的細胞呈紅色。未經(jīng)乳酸處理的樣品(圖3A)主要為綠色熒光，經(jīng)過質(zhì)量濃度為1.00%的乳酸處理后幾乎所有細胞表現(xiàn)為紅色熒光(圖3B)，有少量的細胞損傷較輕，呈黃色，說明乳酸處理后糞腸球菌R612-Z1細胞膜的通透性增加了。

A：未經(jīng)乳酸處理的對照組細胞；B：經(jīng)過質(zhì)量濃度為1.00%的乳酸處理1 h后的細胞。圖2 乳酸處理糞腸球菌的掃描電鏡觀察Fig.2 SEM images of LA-treated E. faecalis cells

A：未經(jīng)乳酸處理的對照組細胞；B：經(jīng)過質(zhì)量濃度為1.00%乳酸處理1 h后的細胞。圖3 乳酸處理糞腸球菌后的激光共聚焦結(jié)果Fig.3 CLSM images of LA-treated E. faecalis cells

2.3.2 胞外ATP及紫外吸收物質(zhì) 使用試劑盒中提供的ATP標準品確定ATP濃度與熒光值的定量關(guān)系(Y=222 856.00x+784.01，R2=0.999)，然后通過測定樣品熒光值來確定樣品中ATP的濃度。圖4顯示，0 min時，對照組樣品的ATP濃度為7.28 nmol/ml，檢測期間濃度變化不大，質(zhì)量濃度為1.00%乳酸處理樣品的ATP濃度為126.72 nmol/ml，在隨后測定的3 h內(nèi)，ATP濃度基本維持穩(wěn)定。通過測定紫外吸收物質(zhì)的濃度來確定乳酸對細胞膜通透性的影響，260 nm處主要為DNA、RNA、代謝產(chǎn)物、離子等物質(zhì)的吸收峰[27]。圖5顯示，0 min時，對照組樣品吸光度為0.25，3 h內(nèi)保持穩(wěn)定，乳酸處理組吸光度為1.03，其后吸光度保持在 0.90～1.00，說明乳酸處理后，細胞膜通透性增強，胞內(nèi)ATP及核酸物質(zhì)泄漏。由于加入乳酸后從混勻到取樣需要一定時間，因此在0 min測得吸光度值較高，由此也可以說明，質(zhì)量分數(shù)為1.00%的乳酸作用迅速，瞬間對細胞膜造成破壞。

未經(jīng)乳酸處理的樣品為對照。圖4 胞外ATP濃度的變化Fig.4 Changes of concentrations of extracellular ATP

2.3.3 流式細胞儀檢測結(jié)果 通過熒光探針cFDA和PI雙染[28]對細胞的完整性進行驗證，cFDA可以進入所有細胞，而PI僅能進入膜損傷的細胞且與核酸親和力更強，可代替已進入細胞內(nèi)的cFDA分子。流式細胞儀分析后，可按細菌細胞的損傷狀態(tài)將其分為完整細胞、受損細胞、死亡細胞和未染色細胞。細菌樣品處理后，利用流式細胞儀獲得糞腸球菌流式點狀圖，首先以對照組樣品為基準劃分象限，象限Q1-LR為cFDA染色的完整活細胞，象限Q1-UR為雙重染色的受損活細胞，象限Q1-UL為PI染色的死亡細胞，象限Q1-LL為未染色細胞。圖6顯示，糞腸球菌R612-Z1經(jīng)過1.00%乳酸處理后細胞的分布與對照樣品有明顯差異，未經(jīng)乳酸處理的細菌樣品中99.7%為活細胞，經(jīng)過乳酸處理后的細菌樣品中93.8%為死細胞，5.2%為受損細胞。Booyens[23]根據(jù)流式細胞儀的結(jié)果，分析大蒜精油處理3種雙歧桿菌前后其細胞膜的損傷程度。對照組樣品和處理組樣品中分別存在0.2%和1.0%未染色細胞，Silva[29]也指出流式數(shù)據(jù)中存在未能染色的細胞，對這種細胞存在的原因有2種猜測[23]。第一，有一部分細胞膜在處理過程中經(jīng)歷嚴重的破壞，導致其核酸流出，而2種熒光探針均是對核酸進行染色，Wang[25]也指出乳酸能夠破壞細胞質(zhì)膜及胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)。第二，細胞聚集成團或成鏈，降低了染色率。綜上所述，糞腸球菌R612-Z1經(jīng)過1.00%乳酸處理后大部分細菌死亡，少部分受損，與激光共聚焦的結(jié)果相呼應(yīng)，說明乳酸對糞腸球菌具有嚴重的破壞作用，可對其細胞膜造成損傷。

未經(jīng)乳酸處理的樣品為對照。圖5 紫外吸收物質(zhì)吸光度變化Fig.5 Changes of absorbance of UV-absorbing materials

A：未經(jīng)乳酸處理的細菌樣品；B：經(jīng)過乳酸處理后的細菌樣品。Q1-LR：cFDA染色的完整活細胞；Q1-UR：雙重染色的受損活細胞；Q1-UL：PI染色的死亡細胞；Q1-LL：未染色細胞。圖6 乳酸處理后的糞腸球菌流式點狀圖Fig.6 Flow cytometry dot plots of LA-treated E. faecalis cells

2.4 乳酸對糞腸球菌R612-Z1細胞膜電勢能的影響

通過測定細胞膜電勢能變化，進一步研究乳酸對糞腸球菌的作用。熒光探針DiSC3(5)是一種對膜電勢變化敏感的陽離子熒光染料[30]，能夠在完整的極化細胞膜中累積并且自行淬滅，乳酸處理后細胞膜去極化[31]，導致與細菌細胞結(jié)合的熒光探針脫落進入溶液中，熒光值增加。對樣品在670 nm處的熒光進行檢測(圖7)，尼日利亞菌素和纈氨霉素分別作為陰性對照和陽性對照，加入KCl平衡細胞內(nèi)外K+濃度后測定熒光值為13 000左右，對照組樣品熒光值在測定期間保持穩(wěn)定，加入尼日利亞菌素后略有下降，加入K+載體纈氨霉素后熒光值迅速上升，處理1 min時熒光值為28 159，加入1.00%乳酸處理后的樣品的熒光值在1 min內(nèi)變化較快，之后趨于穩(wěn)定，但熒光值低于陽性對照樣品的熒光值。熒光值的迅速上升說明乳酸對糞腸球菌作用迅速，細胞膜快速去極化對其功能造成破壞。

未經(jīng)乳酸處理的樣品為對照。圖7 乳酸處理后糞腸球菌膜電勢變化Fig.7 Change of membrane potential of LA-treated E. faecalis cells

3 結(jié) 論

乳酸殺菌迅速，加入乳酸后菌數(shù)迅速下降，濃度為0.25%、0.50%、1.00%的乳酸分別在60 min、30 min、10 min內(nèi)達到完全殺菌的效果，乳酸作用于糞腸球菌R612-Z1后使其胞內(nèi)ATP及核酸類物質(zhì)快速釋放到胞外。Sun等[32]的研究結(jié)果表明，單獨使用乳酸鏈球菌素(Nisin)和乳酸桿菌表層分離蛋白SlpB或者2種物質(zhì)復配使用后也會使胞外ATP和核酸物質(zhì)增加，ATP濃度在反應(yīng)1.5 h時達到最高，260 nm處的吸光值在反應(yīng)6.0 h時達到最大，說明復配物對細菌作用緩慢。乳酸處理糞腸球菌后，細胞形狀無明顯變化，但有胞內(nèi)物質(zhì)流出。乳酸對于細菌的破壞主要是破壞其膜通透性，對細胞整體形態(tài)無明顯影響[33-34]。使用肉桂醛作為抑菌劑處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌時，胞外核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量增多，電導率增大，細胞膜電勢變化[35]。因此，細胞膜通透性的變化是多種抑菌物質(zhì)達到抑菌或殺菌作用的原因。通過研究發(fā)現(xiàn)，乳酸處理迅速改變了細胞膜內(nèi)外電勢，增加了細胞膜通透性，導致內(nèi)容物流出，從而起到了抑菌作用，但乳酸導致細胞膜分子結(jié)構(gòu)階段損傷的作用機制仍需要深入研究。

質(zhì)量濃度為1.00%的乳酸處理細菌1 h后，通過掃描電鏡觀察到細胞外部被內(nèi)容物包裹，同時胞外ATP濃度及紫外吸收物質(zhì)濃度的增加也說明胞內(nèi)有物質(zhì)滲漏。通過cFDA和PI染色，在激光共焦顯微鏡與流式細胞儀下觀察，乳酸處理后大部分細胞死亡，紅色熒光明顯增強，表明細胞膜通透性增強，導致熒光探針PI進入胞內(nèi)。因此，乳酸作用于糞腸球菌時會快速破壞其細胞壁及細胞膜結(jié)構(gòu)，使其細胞膜通透性增強，胞內(nèi)的內(nèi)容物如ATP、核酸等快速滲出，達到殺菌效果。

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