肖 婷， 陳 露， 張建華， 芮東明， 許 媛， 吉沐祥， 楊敬輝

(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400)

灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的，該菌寄主范圍廣泛，可侵染多種水果、蔬菜和觀賞植物的葉、莖、花以及果實(shí)，給生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失?？刂撇『Πl(fā)展的化學(xué)常規(guī)用藥以多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺、啶酰菌胺等殺菌劑為主打藥劑[1-3]。啶酰菌胺屬于新型煙酰胺類殺菌劑[4]，主要用于防治腐爛病、白粉病和灰霉病等，該類藥劑作為線粒體呼吸鏈中琥珀酸輔酶Q還原酶的抑制劑，對孢子萌發(fā)有很強(qiáng)的抑制能力，且與其他殺菌劑無交互抗性。近幾年,啶酰菌胺在中國大量使用，但由于琥珀酸脫氨酶抑制劑(SDHIs)類殺菌劑屬于單一作用位點(diǎn)類型，其抗性風(fēng)險(xiǎn)備受關(guān)注，與其相關(guān)的抗藥性研究也已經(jīng)有很多報(bào)道[5-9]，這些抗性菌株可能與靶標(biāo)位點(diǎn)的改變或多藥抗藥性機(jī)制有關(guān)。田間最常見的灰葡萄孢菌(B.cinerea)對啶酰菌胺的抗性是由于SdhB亞基上第272位上的氨基酸(H272Y/R)突變所致[10]，也有報(bào)道稱SdhB亞基上第272位點(diǎn)上組氨酸突變?yōu)榱涟彼?H272L)也會引起菌株的抗藥性，但此類型發(fā)現(xiàn)較少[11-12]。另外，SdhB亞基上第225位點(diǎn)由脯氨酸突變?yōu)楸奖彼?P225F)、蘇氨酸(P225T)或亮氨酸(P225L)，第230位點(diǎn)天冬氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?N230I)都是引起菌株抗性的原因[13-14]。

本研究擬結(jié)合本地區(qū)生產(chǎn)實(shí)際，連續(xù)2年采集設(shè)施葡萄和設(shè)施草莓的灰霉病菌，結(jié)合農(nóng)戶化學(xué)防治主打藥劑，檢測本地區(qū)灰霉病菌對啶酰菌胺的抗藥性，分析抗藥性的發(fā)展過程，并通過分子手段揭示抗性機(jī)理，明晰突變種類和分布，以期為生產(chǎn)中科學(xué)用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2015年和2016年分別在江蘇省句容市葡萄、草莓主產(chǎn)區(qū)隨機(jī)采集灰霉病菌(B.cinerea)，實(shí)驗(yàn)室分離獲得單孢菌株(表1)，采用濾紙片法將其保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2 供試藥劑

98.95%啶酰菌胺原藥，由先正達(dá)公司提供。藥劑均用丙酮配制成10 000 mg/L的母液，母液置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1菌株信息

Table1InformationofBotrytiscinereaisolatescollectedinJurong，Jiangsuprovince

菌株號菌株數(shù)作物地點(diǎn)時間PTB16-2、PTB16-4、PTB16-5、PTB16-8、PTB16-9、PTB16-11、PTB16-12、PTB16-14、PTB16-159葡萄唐莊2016PTB16-17、PTB16-18、PTB16-19、PTB16-204葡萄興發(fā)葡萄園2016PTB16-24、PTB16-25、PTB16-26、PTB16-28、PTB16-29、PTB16-36、PTB16-397葡萄柳埝2016PTB16-49、PTB16-50、PTB16-51、PTB16-52、PTB16-69、PTB16-70、PTB16-71、PTB16-72、PTB16-75、PTB16-79、PTB16-81、PTB16-82、PTB16-83、PTB16-84、PTB16-85、PTB16-88、PTB16-86、PTB16-87、PTB16-8919葡萄白兔2016PTB16-58、PTB16-59、PTB16-60、PTB16-614葡萄倪塘2016PTB16-31、PTB16-32、PTB16-343葡萄華陽鎮(zhèn)2016PTB16-93、PTB16-96、PTB16-101、PTB16-102、PTB16-107、PTB16-1096葡萄茅山鎮(zhèn)2016B15-11、B15-14、B15-15、B15-16、B15-19、B15-38、B15-39、B15-40、B15-52、B15-53、B15-54、B15-6012草莓茅山鎮(zhèn)2015B15-21、B15-26、B15-27、B15-61、B15-64、B15-656草莓后白鎮(zhèn)2015B15-2、B15-8、B15-9、B15-104草莓天王鎮(zhèn)2015B15-214、B15-217、B15-227、B15-216、B15-2255草莓淳化鎮(zhèn)2015B15-239、B15-250、B15-251、B15-249、B15-252、B15-253、B15-2547草莓土橋鎮(zhèn)2015B15-78、B15-82、B15-146、B15-147、B15-84、B15-148、B15-1507草莓華陽鎮(zhèn)2015B15-111、B15-113、B15-134、B15-139、B15-151、B15-152、B15-158、B15-176、B15-179、B15-187、B15-188、B15-189、B15-112、B15-116、B15-121、B15-123、B15-124、B15-125、B15-133、B15-137、B15-140、B15-156、B15-157、B15-159、B15-160、B15-180、B15-181、B15-190、B15-19429草莓白兔鎮(zhèn)2015

1.3 灰霉病菌對啶酰菌胺抗藥性的檢測

采用區(qū)分劑量法測定啶酰菌胺濃度為1 mg/L[15]時，灰霉病菌孢子的萌發(fā)生長是否正常。培養(yǎng)基為YBA培養(yǎng)基，制作藥皿，設(shè)不加藥劑的空白為對照。具體方法如下：事先培養(yǎng)病原菌并確保長出分生孢子，用滅菌牙簽蘸取事先培養(yǎng)好的病菌孢子，點(diǎn)在藥皿上，23 ℃培養(yǎng)72 h后觀察。平板上病菌孢子正常萌發(fā)且菌絲正常生長的確定為抗性菌株，不能正常生長的確定為敏感菌株，重復(fù)2次。

1.4 灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性測定

采用孢子萌發(fā)法，挑取9株敏感菌株(事先在PDA平板上活化培養(yǎng)7 d)，用無菌水清洗灰霉孢子，稀釋到1 ml 1×106個，取100 μl加入到含啶酰菌胺系列質(zhì)量濃度(0.003 mg/L、0.010 mg/L、0.030 mg/L、0.100 mg/L、0.300 mg/L和1.000 mg/L)的YBA平板表面，用三角涂布棒涂抹均勻。同樣方法測定抗性菌株的敏感性，所不同的是藥劑質(zhì)量濃度設(shè)為0.100 mg/L、0.300 mg/L、1.000 mg/L、3.000 mg/L、10.000 mg/L和30.000 mg/L，以不含藥劑的平板為對照，每個處理重復(fù)4次，23 ℃培養(yǎng)20 h后鏡檢。采用五點(diǎn)取樣法，量取一個視野中各孢子萌發(fā)的芽管長度，計(jì)算平均值，與對照比較，計(jì)算抑菌率。利用DPS軟件，通過濃度對數(shù)值(x)與抑制率幾率值(y)之間的線性回歸關(guān)系，求出毒力回歸方程和有效抑制中濃度(EC50)，根據(jù)各菌株的EC50值求得抗性菌株抗性因子的RF值(抗性菌株EC50/敏感菌株EC50)。菌株敏感性表型按RF值大小劃分如下：敏感菌株(RF<2，S)、敏感性下降菌株(2≤RF<3，RS)、低抗菌株(3≤RF<10，LR)、中抗菌株(10≤RF<100，MR)和高抗菌株(RF≥100，HR)[16]。

1.5 抗藥性分子機(jī)制

選取9株敏感菌株和所有抗性菌株，按DNA試劑盒(OMEGA)法提取基因組DNA。引物序列：IpBcBeg(5′-CCACTCCTCCATAATGGCTGCTCTCCGC-3′)+IpBcEnd2(5′-CTCATCAAGCCCCCTCATTGATATC-3′)[17]。采用50 μl反應(yīng)體系，95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后68 ℃延伸4 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行產(chǎn)物純化和序列測定。抗性靶標(biāo)基因序列比對分析用NCBI中的BLAST軟件進(jìn)行，序列編輯用DNASRAR軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰霉病菌對啶酰菌胺的抗藥性

在含有1 mg/L啶酰菌胺的YBA平板上，灰霉病菌孢子正常萌發(fā)生長的判定為抗性菌株，不能正常萌發(fā)生長的菌株判定為敏感菌株。供測的122株菌株中，抗性菌株52株(42.6%)，敏感菌株70株(57.4%)。其中葡萄灰霉病菌抗性菌株31株，占所有葡萄灰霉病菌菌株的53.85%，草莓灰霉病菌抗性菌株21株，占所有草莓灰霉病菌菌株的32.86%。由此可見，本地區(qū)灰霉病菌種群中已形成了抗啶酰菌胺的穩(wěn)定種群。從取樣作物來看，葡萄果實(shí)上取樣的灰霉病菌種群抗性頻率遠(yuǎn)大于草莓果實(shí)上取樣的灰霉病菌種群。從地區(qū)分布來看，不同地區(qū)用藥水平不同，抗性頻率亦不同，葡萄和草莓主產(chǎn)區(qū)白兔鎮(zhèn)所采集的樣品對啶酰菌胺的抗性頻率最高(53.42%)，其次為石獅鎮(zhèn)(41.67%)、華陽鎮(zhèn)(40%)、茅山鎮(zhèn)(16.67%)，在新興草莓種植地區(qū)(天王鎮(zhèn)和后白鎮(zhèn))的樣品中沒有檢測到抗性菌株(圖1)。

圖1 灰霉病菌對啶酰菌胺的抗藥性Fig.1 Percentage of resistant isolates of Botrytis cinerea collected from different sites

2.2 灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性表型

9株對啶酰菌胺敏感的灰霉病菌菌株EC50平均值為0.035 3 mg/L，其中8株敏感菌株的EC50值小于0.100 0 mg/L(88.89%)(圖2A)?？剐跃闑C50值主要集中在0.500 1～2.000 0 mg/L(79.17%)(圖2B)。根據(jù)抗性菌株與敏感菌株EC50比值(RF)的大小，可將菌株的敏感性表型進(jìn)行劃分。本研究中敏感性表型S(8株)、RS(1株)、LR(8株)、MR(42株)和HR(2株)菌株的EC50平均值分別為0.044 8 mg/L、0.131 7 mg/L、0.326 1 mg/L、1.255 5 mg/L和11.170 7 mg/L(圖3A、圖3B)。

A：敏感菌株；B：抗性菌株。圖2 灰霉病菌對啶酰菌胺的EC50分布頻率Fig.2 Effective concentration resulting in 50% mycelial growth inhibition(EC50) for nine boscalid-sensitive isolates(A) and 52 boscalid-resistant isolates(B) of B. cinerea

A：敏感菌株；B：抗性菌株。圖3 灰霉病菌對啶酰菌胺的RF值分布頻率Fig.3 Resistance factors(RF) for nine boscalid-sensitive isolates(A) and 52 boscalid-resistant isolates(B) of B. cinerea

2.3 灰霉病菌對啶酰菌胺的抗藥性分子機(jī)理

對9株敏感菌株和所有抗性菌株的抗性靶標(biāo)基因(sdhB、sdhC和sdhD)進(jìn)行測序分析，結(jié)果(表2)表明，敏感菌株sdhB、sdhC和sdhD3個亞基上均未發(fā)現(xiàn)氨基酸的取代，與敏感菌株相比，27株葡萄灰霉病菌抗性菌株和21株草莓灰霉病菌抗性菌株sdhB基因第272位密碼子由CAC(編碼組氨酸，H)突變成為CGC(編碼精氨酸，R)，即H272R突變。1株葡萄灰霉病菌抗性菌株sdhB基因第272位密碼子由CAC(編碼組氨酸，H)突變成為CGT(編碼精氨酸，R)，即H272R突變。3株葡萄灰霉病菌抗性菌株sdhB基因第272位密碼子由CAC(編碼組氨酸，H)突變成為TAC(編碼酪氨酸，Y)，即H272Y突變，未檢測到在sdhC和sdhD亞基上發(fā)生突變的抗性菌株。

3 討 論

琥珀酸脫氨酶抑制劑包括啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺等23種藥劑[18]，是目前較為暢銷的殺菌劑。該類藥劑的作用位點(diǎn)在線粒體呼吸鏈細(xì)胞色素b560的琥珀酸脫氫酶(琥珀酸泛醌氧化還原酶)復(fù)合體II亞基上(該酶復(fù)合體是線粒體電子傳遞通路和三羧酸循環(huán)的重要組成部分，催化琥珀酸氧化為延胡索酸以及醌的還原)，并阻礙細(xì)胞能量和細(xì)胞基本組成物質(zhì)的產(chǎn)生，干擾細(xì)胞的分裂和生長，SDHIs類藥劑與現(xiàn)有其他種類藥劑間不存在交互抗性[19]。

表2灰霉病菌sdhB基因突變及敏感性表型檢測結(jié)果

Table2MutationsinsubunitsdhBandcorrespondingphenotypesofB.cinereaisolates

菌株號菌株數(shù)EC50作物敏感性表型sdhB突變位點(diǎn)RF值B15-8、B15-9、B15-10、B15-14、B15-53、B15-64、B15-124、B15-18080.0448草莓S--B15-2610.1317草莓RS--PTB16-9、PTB16-21、PTB16-6930.3031葡萄LRH272R4.03～7.78B15-134、B15-189、B15-194、B15-251、B15-25450.3400草莓LRH272R2.63～9.51B15-11、B15-39、B15-60、B15-78、B15-113、B15-137、B15-147、B15-151、B15-158、B15-160、B15-188、B15-216、B15-225、B15-250141.0942草莓MRH272R10.18～35.14PTB16-5、PTB16-8、PTB16-11、PTB16-12、PTB16-14、PTB16-15、PTB16-18、PTB16-19、PTB16-20、PTB16-26、PTB16-28、PTB16-31、PTB16-35、PTB16-39、PTB16-70、PTB16-71、PTB16-72、PTB16-75、PTB16-79、PTB16-81、PTB16-83、PTB16-86、PTB16-87、PTB16-89、PTB16-109251.3220葡萄MRH272R10.06～77.65B15-225、B15-239211.1707草莓HRH272R151.43～259.15PTB16-73、PTB16-78、PTB16-8231.4552葡萄MRH272Y26.27

-：未檢測到突變；S：敏感；RS：敏感性下降；LR：低抗；MR：中抗；HR：高抗。

江蘇丘陵句容地區(qū)采用啶酰菌胺防治灰霉病已超8年，近幾年拜耳公司研制的氟吡菌酰胺和肟菌酯的復(fù)配制劑(露娜森)也開始在草莓上使用。隨著使用時間和頻次的增加，病菌對啶酰菌胺的抗藥性也逐漸顯露。鑒于此，本研究在2015年和2016年采集不同作物(草莓、葡萄)灰霉病菌，采用區(qū)分計(jì)量法測定其抗藥性水平，發(fā)現(xiàn)本地區(qū)啶酰菌胺抗性菌株頻率均值已達(dá)42.60%，但不同地區(qū)不同作物抗藥性頻率間存在顯著差異。句容市天王鎮(zhèn)和后白鎮(zhèn)均未發(fā)現(xiàn)抗性菌株，主要是因?yàn)檫@2個鄉(xiāng)鎮(zhèn)草莓和葡萄的種植時間較短，而白兔鎮(zhèn)、石獅鎮(zhèn)和華陽鎮(zhèn)草莓種植已有20多年，檢測到灰霉病菌種群的抗藥性頻率較高，分別達(dá)53.42%、41.67%和40.00%。此外，葡萄果實(shí)灰霉病菌種群的抗性菌株頻率還略高于草莓果實(shí)灰霉病菌種群，這是因?yàn)猷＞肥瞧咸鸦颐共》乐蔚闹鞔蛩巹?。以上結(jié)果充分說明，在草莓和葡萄園里灰霉病菌抗啶酰菌胺種群已經(jīng)穩(wěn)定存在。

灰霉病菌對啶酰菌胺敏感性的測定結(jié)果表明，本地區(qū)灰霉病菌對啶酰菌胺的抗藥性以中抗菌株為主。對所有抗性菌株靶標(biāo)基因(sdhB、sdhC和sdhD)進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明，所有抗性菌株的突變都只發(fā)生在sdhB基因的第272位，且只發(fā)現(xiàn)H272R和H272Y 2種突變類型。以上研究結(jié)果與Veloukas等[16]報(bào)道的結(jié)果相似，所不同的是本研究中未檢測到H272L、P225F和N230I等突變類型。綜上所述，灰霉病菌sdhB基因不同的突變類型與藥劑敏感性之間有相關(guān)性。

有研究將灰霉病菌sdhB基因突變中H272L和P225F類型的菌株用于草莓果實(shí)離體防治試驗(yàn)中，啶酰菌胺對其失去防效[16]，鑒于此，為了及時提供抗藥性信息，需持續(xù)監(jiān)測本地灰霉病菌種群對啶酰菌胺抗藥性的動態(tài)變化，特別是明確是否還有其他新的突變類型。

在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，灰霉病菌敏感菌株和抗性菌株對溫度的敏感性、菌絲生長速度、產(chǎn)孢能力和孢子萌發(fā)能力等無顯著差異[18,20]。在田間條件下，用殺菌劑防治灰霉病菌利于抗性菌株獲得有利的選擇優(yōu)勢，在持續(xù)的藥劑選擇壓力下，抗性菌群會逐漸成為主導(dǎo)種群。因此，利用抗藥性監(jiān)測的結(jié)果，因地制宜指導(dǎo)各地農(nóng)戶合理使用不同作用機(jī)制的農(nóng)藥，不但能有效遏制植物病原菌抗性種群的發(fā)展，延長藥劑的使用壽命，還能為各地農(nóng)藥的減量使用提供理論依據(jù)。

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