任春梅， 楊 柳， 繆 倩， 程兆榜

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

小麥黃花葉病是由禾谷多黏菌(PolymyxagraminisL.)傳播的一種麥類土傳病毒——小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)引起的[1-2]，該病早在1927年就由日本的Sawada發(fā)現(xiàn)和報道[3]，至今仍對小麥的生產(chǎn)造成一定危害。在自然條件下，中國小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)與WYMV一樣易感染小麥，導(dǎo)致嚴重的田間病害[4]，且兩者常發(fā)生復(fù)合侵染，因病害癥狀極其相似，給鑒定工作帶來了一定難度。在中國，目前該病主要分布于淮河流域的河南、湖北、安徽、山東以及長江、黃河中下游的四川、陜西、江蘇、浙江等省，據(jù)2013年的統(tǒng)計，在中國的發(fā)生總面積達2.00×106hm2[5-7]，已經(jīng)對中國的小麥產(chǎn)量和品質(zhì)都造成了嚴重影響，因此急需建立一種能夠準確、規(guī)?；瘷z測該病毒的方法，為小麥黃花葉病的防控提供技術(shù)保障。

目前，針對WYMV的檢測主要有電鏡觀察、血清學、分子生物學等方法。早在2000年葉榮等就采用電鏡觀察法對WYMV的典型病毒粒子進行了診斷[8]，但此方法的儀器精密，價格昂貴；血清學檢測，Xing等以P2蛋白[9]、向榮等以P1蛋白[10]、韓成貴等以CP蛋白[11]的原核表達產(chǎn)物制備了相應(yīng)抗血清，尚巧霞等[12]根據(jù)CP的原核表達建立了WYMV 的ELISA檢測系統(tǒng)，耿波等[13]利用異種動物抗血清建立了雙抗夾心ELISA 檢測技術(shù)，但這些血清學方法應(yīng)用于田間大規(guī)模樣品的檢測還未見報道；分子生物學檢測，叢倩倩等[14]利用RT-PCR檢測了山東地區(qū)小麥黃花葉病的發(fā)生情況，繆倩等建立了一步法快速檢測WYMV和CWMV的RT-PCR方法， Tao等[15]建立了包括WYMV在內(nèi)的小麥多種病毒的多重PCR檢測體系，Zhang等[16]建立了檢測WYMV的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)體系，F(xiàn)ukuta等[17]建立了包括WYMV在內(nèi)的土傳小麥花葉病毒多重RT-LAMP檢測體系，但該技術(shù)的應(yīng)用受儀器設(shè)備和操作人員技術(shù)的限制，成本高，耗時長，不適于田間大量樣品的檢測。因此本實驗室利用蔗糖硫酸銫密度梯度離心法提純了WYMV病毒粒子，以此為抗原免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)獲得了3個分泌抗WYMV的雜交瘤細胞株，以此制備了WYMV的單抗腹水,并利用其中最靈敏的一株單抗建立了檢測WYMV的ACP-ELISA方法，成功地應(yīng)用于田間小麥黃花葉病毒的檢測，為WYMV田間大規(guī)模快速檢測的實現(xiàn)提供了物質(zhì)和技術(shù)支撐，從而推動小麥黃花葉病的預(yù)報預(yù)警和科學防控體系的建立。

1 材料和方法

1.1 毒源

WYMV毒源繁殖于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所小麥黃花葉病旱池病圃，經(jīng)RT-PCR鑒定后用于WYMV的提純，-70 ℃冰箱保存提純病毒。中國小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)和大麥黃花葉病毒(Barley yellow mosaic virus, BaYMV)經(jīng)本實驗室鑒定后保存。

1.2 WYMV的提純

WYMV的提純參照任春梅等[18]的方法加以改進，先將約400 g小麥病葉和0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液置于攪拌機，攪碎后用兩層紗布過濾，濾液中加入300 ml 1/4四氯化碳攪拌5 min、靜置10 min，8 000 r/min離心15 min取上清液，加入6% PEG-6000、3% NaCl和1% Triton.X-100，冰浴攪拌至全部溶解，4 ℃下放置6 h或過夜，8 000 r/min離心20 min，沉淀用懸浮緩沖液懸浮，10 000 r/min離心15 min取上清液，上清液加5 ml 30%蔗糖墊(含0.3%Triton.X-100)，25 000 r/min離心2 h，沉淀用懸浮緩沖液懸浮，12 000 r/min離心10 min取上清液。進一步純化采用蔗糖硫酸銫不連續(xù)密度梯度離心法，以 22 000 r/min離心3 h，取離心管上端1/3處為病毒層，用樣品緩沖液稀釋，40 000 r/min離心1 h，沉淀用0.5 ml樣品緩沖液懸浮，即為所提純病毒溶液。提純病毒液經(jīng)2%磷鎢(PTA)染色后置JEM-1200EX電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。以純化的WYMV病毒粒子作為抗原，制備抗WYMV的單克隆抗體。

1.3 小鼠免疫

參照Shang等[19]的免疫程序，選用7周齡左右雌性BALB/c小鼠6只，將提純的WYMV與等體積弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant, FC)混合，首次免疫采用皮下注射，2～3周后加強免疫1次，將抗原與弗氏不完全佐劑(Freund’s imcomplete adjuvant, FC)等體積混合，采用皮下及腹腔注射。4次免疫后采血檢測，通過間接ELISA方法確定抗血清的效價，待效價大于1∶10 000，選擇1～2只小鼠進行細胞融合。

1.4 細胞融合、篩選與亞克隆

1.4.1 細胞融合 首先依據(jù)Wu等[20]的方法，制備數(shù)量比為20∶1免疫小鼠的脾細胞和SP2/0鼠骨髓瘤細胞，再用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋細胞并用冷凍離心機離心棄上清，搖動離心管使細胞均勻，緩慢加入0.8 ml 50% PEG，反應(yīng)90 s，加入20～30 ml DMEM培養(yǎng)基終止PEG，把融合的細胞放到37 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，再離心棄上清液加入HAT DMEM培養(yǎng)基，最后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合10 d后開始篩選檢測。

1.4.2 融合篩選 檢測前1 d，用PBS包被5 μg/ml抗原于ELISA板，過夜。次日吸取細胞上清液1孔100 μl進行間接ELISA檢測，以提純的WYMV和感染W(wǎng)YMV的病葉為陽性，健康小麥葉片為陰性，根據(jù)ELISA結(jié)果，判斷是否陽性(樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽性)。用單道移液器挑檢整板檢測出的陽性孔，進行第二次ELISA確認檢測，確定后的陽性孔細胞進行亞克隆。

1.4.3 亞克隆 參考Wu等[20]的方法，將強陽性反應(yīng)雜交瘤細胞進行3次連續(xù)細胞克隆，挑出穩(wěn)定傳代細胞的單克隆擴大培養(yǎng)。

1.5 腹水制備和抗體純化

1.5.1 腹水制備 參考Wu等[20]的方法，將雜交瘤細胞懸液注射入小鼠腹腔，再收集腹部明顯膨大的小鼠腹水，離心取上清液即為腹水單克隆抗體，-20 ℃保存?zhèn)溆?，待測定效價。

1.5.2 抗體純化 參照汪謙[21]采用的辛酸硫酸銨方法純化抗體，最后取少量進行效價測定。

1.6 抗體類型鑒定、效價測定和特異性分析

1.6.1 抗體類型及亞類鑒定 鑒定依據(jù)美國Sigma公司的抗體類型鑒定試劑盒操作說明進行。

1.6.2 抗體效價測定 將提純的WYMV用碳酸鹽包被液稀釋為1 g/ml作為抗原，一抗采用倍比稀釋的單抗，二抗應(yīng)用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，參照Wu等[20]采用的間接ELISA方法測定腹水的效價。

1.6.3 Western blot分析單抗的特異性 選用WYMV和CWMV感染的小麥葉片、BaYMV感染的大麥葉片、健康小麥葉片為分析對象，參考劉歡等[22]的方法進行Western blot分析，SDS-PAGE電泳膠一部分用于考馬斯亮藍染色觀察，另一部分電轉(zhuǎn)移硝酸纖維素膜(NC)后與不同株單抗進行Western blot分析，測定單抗的特異性反應(yīng)情況。

1.7 ACP-ELISA方法的建立

1.7.1 ACP-ELISA抗體最適工作濃度 根據(jù)劉歡等[22]的方法，利用WYMV的單克隆抗體建立其ACP-ELISA檢測方法。用方陣實驗確定單抗和酶標抗體的最適工作濃度。設(shè)置WYMV單抗?jié)舛龋?.000 μg/ml、2.000 μg/ml、1.000 μg/ml、0.500 μg/ml、0.250 μg/ml、0.125 μg/ml、0.062 μg/ml、0.032 μg/ml、0.016 μg/ml和0.008 μg/ml；HRP酶標記的羊抗鼠IgG二抗?jié)舛龋?.248 μg/ml、0.124 μg/ml、0.062 μg/ml、0.032 μg/ml、0.016 μg/ml、0.008 μg/ml、0.004 μg/ml和0.002 μg/ml，測定酶標儀上的OD450值。同時設(shè)健康小麥為陰性，每個處理3次重復(fù)。選取方陣中間OD450≈1.5，陰性,OD450<0.2對應(yīng)的WYMV單抗和酶標二抗的稀釋倍數(shù)作為最佳工作濃度。

1.7.2 ACP-ELISA特異性分析 利用以上建立的ACP-ELISA檢測方法，測定WYMV感染小麥、CWMV感染小麥、BaYMV感染大麥病葉和健康小麥葉片在酶標儀上的OD450值，分析ACP-ELISA方法的特異性。

1.7.3 ACP-ELISA靈敏度分析 同上，以WYMV感染小麥病葉為陽性，健康小麥葉片為陰性，用0.01 mol/L的PBS(PH7.4)將小麥病葉從1∶100到 1∶102 400(g/ml)倍比稀釋，健康小麥葉片作同樣倍比稀釋，進行ACP-ELISA方法的靈敏度分析。

1.8 ACP-ELISA方法的檢測應(yīng)用

應(yīng)用建立的ACP-ELISA檢測方法，對采自于江蘇的高郵、寶應(yīng)、儀征、常州、姜堰、興化、鹽都、淮安和大豐，安徽的壽縣和來安，河南的遂平，山東的臨沂、泰安和濟寧等的小麥中小麥黃化葉病疑似樣品進行檢測，用溫室生長的小麥健康葉片為陰性對照，病圃中經(jīng)檢測為小麥黃化葉病病葉為陽性對照，每個處理設(shè)3個重復(fù)，以P/N>2.1作為陽性判斷標準。再對每個樣品用RT-PCR方法進行驗證，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥黃花葉病毒的提純

用改進的方法提純小麥黃花葉病毒樣品，經(jīng)2%磷鎢酸負染后在透射電鏡下觀察到較純且濃密的病毒粒子(圖1)，粒子形狀呈直線狀，長度約200 nm，直徑約13 nm。用紫外分光光度法測得的濃度為5.44 mg/ml。

圖1 WYMV病毒粒子的電鏡觀察Fig.1 Electron microscopic observation of wheat yellow mosaic virus (WYMV) particles

2.2 雜交瘤細胞的融合率、陽性率和克隆

提純的WYMV免疫小鼠，經(jīng)融合、篩選和培養(yǎng)后，18塊96孔板細胞的融合率達到100%。當雜交瘤細胞生長至覆蓋孔底 20～30%時，以提純病毒為包被抗原采用間接ELISA方法對融合細胞進行陽性篩選，結(jié)果顯示陽性率為9.5%。利用有限稀釋法對5個陽性反應(yīng)強、特異性好的雜交瘤細胞進行3次細胞克隆，最終獲得6F4、2D3和2D4共3株生長良好且能穩(wěn)定分泌抗WYMV的單抗雜交瘤細胞株。

2.3 抗體的制備和特性鑒定

用克隆好的雜交瘤細胞注射BALB/c小鼠腹腔，采集腹水，最終3個細胞株各獲得約25 ml腹水。3株腹水純化后的IgG含量在1.45～3.10 mg/ml(表1)，經(jīng)試劑盒鑒定，3個抗體均為IgG1、κ鏈，間接ELISA方法測得3株腹水單抗的效價達 10-7～10-6(表1)。

表1WYMV單克隆抗體(MAbs)的特性

Table1Propertiesofmonoclonalantibodies(MAbs)againstWYMV

單克隆抗體單克隆抗體類型單克隆抗體腹水效價IgG含量(mg/ml)6F4IgG1,κ鏈10-61.452D3IgG1,κ鏈10-62.302D4IgG1,κ鏈10-73.10

2.4 單抗的特異性分析

Western blot結(jié)果表明，6F4和2D4兩株抗體均能與WYMV病葉中1條約32 kD的蛋白亞基結(jié)合，而在CWMV和BaYMV病葉、健康小麥葉片中均沒有出現(xiàn)任何條帶(圖2)，說明這兩株單抗均能與WYMV外殼蛋白亞基特異性結(jié)合。2D3抗體在WYMV、CWMV、BaYMV病葉、健康小麥葉片中均未檢測到任何條帶，但ACP-ELISA檢測時2D3抗體與WMVY病毒呈陽性反應(yīng)，故推測2D3單抗是針對WYMV構(gòu)象型的抗原決定簇，具有一定的空間構(gòu)象，其空間結(jié)構(gòu)由于電泳過程中的變性而被破壞，使得單抗不能與抗原結(jié)合。

2.5 ACP-ELISA法的條件優(yōu)化

經(jīng)方陣實驗， ACP-ELISA法中6F4、2D4和2D3的3個單抗的最適工作濃度分別為0.50 μg/ml、0.25 μg/ml和2.00 μg/ml，酶標二抗的最適工作濃度為0.062 μg/ml。

M：蛋白marker；1、5和9：WYMV感染小麥病葉提取液；2、6和10：CWMV感染小麥病葉提取液；3、7和11：BaYMV感染大麥病葉提取液；4、8和12：健康小麥葉片提取液。圖2 WYMV單克隆抗體(MAbs)與病毒衣殼蛋白的Western blot分析Fig.2 Western blot analysis of WYMV coat protein with monoclonal antibodies(MAbs)

2.6 ACP-ELISA法的特異性分析

3個抗體建立的ACP-ELISA法的特異性分析見圖3，結(jié)果顯示3個單抗的ACP-ELISA檢測中，只有WYMV感染病葉出現(xiàn)了強陽性反應(yīng)，而CWMV和BaYMV感染病葉與健康小麥葉片為陰性反應(yīng)，說明這3種單抗建立的ACP-ELISA方法均具有很好的特異性。

W：WYMV感染的小麥葉片；C：CWMV感染的小麥葉片；B：BaYMV感染的大麥葉片；CK：健康小麥葉片。圖3 ACP-ELISA的特異性Fig.3 Specificity of the ACP-ELISA

2.7 ACP-ELISA法的靈敏度

靈敏度分析結(jié)果表明，以2D4單抗建立的ACP-ELISA檢測病葉的靈敏度最高，當小麥病葉以1∶25 600倍稀釋時，仍呈陽性反應(yīng)；而以6F4和2D3單抗建立的ACP-ELISA檢測病葉的靈敏度稍差(圖4)。

圖4 ACP-ELISA的靈敏度Fig.4 Sensitivity of the ACP-ELISA

2.8 ACP-ELISA法的檢測應(yīng)用

應(yīng)用最靈敏的2D4單抗建立的ACP-ELISA檢測方法對采自中國4個省15個縣、市的60個樣品進行檢測，結(jié)果見表2。由表可知，WYMV的分布廣泛，除江蘇的淮安、大豐和儀征三地的小麥樣品中未檢到外，其余12個縣、市均有分布，陽性檢出率在63.63%以上，說明WYMV目前仍是麥子上較為流行的主要病毒。同時，小麥樣品進一步用RT-PCR檢測驗證，結(jié)果表明與ACP-ELISA檢測的陽性結(jié)果高度一致(圖5)，此外，陽性RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸測序驗證均為WYMV。說明本研究建立的檢測WYMV的ACP-ELISA方法能夠可靠、準確地用于小麥中WYMV的檢測。

3 討 論

單克隆抗體(monoclonal antibody, MAb)是由一個B淋巴細胞產(chǎn)生的針對一種抗原決定簇的抗體，因其特異性強、靈敏度高、可無限量生產(chǎn)等特點而被廣泛應(yīng)用，目前已被應(yīng)用于生物學和醫(yī)學的各個研究領(lǐng)域，促進了細胞學、遺傳學、免疫學和病毒學等眾多學科的發(fā)展[23]。自1982年西德科學家成功研制了煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)的單克隆抗體，目前單抗在植物病毒學的檢測方面得到了廣泛應(yīng)用。國內(nèi)外學者已經(jīng)制備了水稻、玉米、蔬菜等作物上幾十種植物病毒的單抗，大部分都已應(yīng)用于田間樣品的檢測，對控制病毒病害在田間的發(fā)生，減少經(jīng)濟損失，抗病篩選和病害流行預(yù)測都起到了十分重要的作用。

表2ACP-ELISA法檢測田間疑似小麥黃化葉病樣品結(jié)果

Table2DetectionresultsoffieldwheatsamplestestedbyACP-ELISA

采集地點樣品數(shù)(個)陽性數(shù)(個)ACP-ELISART-PCR吻合率(%)江蘇高郵322100江蘇寶應(yīng)111100江蘇儀征500100江蘇常州444100江蘇姜堰744100江蘇興化555100江蘇鹽都111100江蘇淮安300100江蘇大豐700100安徽壽縣333100安徽來安222100河南遂平544100山東臨沂333100山東泰安444100山東濟寧211100

A: ACP-ELISA檢測方法;B: RT-PCR檢測方法;M：DNA分子量marker；1-9：田間小麥樣品；10：WYMV感染小麥樣品(陽性對照)；11：健康小麥樣品(陰性對照)；圖中擴增帶均為520 bp WYMV目的條帶。圖5 ACP-ELISA法(A)和RT-PCR法(B)檢測結(jié)果的吻合度Fig.5 Detection results of field wheat samples tested by ACP-ELISA(A) and RT-PCR(B)

近幾年，隨著耕作制度和推廣品種的交替變化，小麥黃花葉病在山東、河南、江蘇、安徽等冬小麥上發(fā)生仍然嚴重[24-25]，因此亟待尋找到控制該病害的有效方法。其中病害的預(yù)測預(yù)報是前提，抗病品種的應(yīng)用是首選，這些策略都會產(chǎn)生大量需要檢測的樣品。因為田間小麥黃花葉和小麥花葉病毒病的發(fā)病癥狀極其相似，而且常常發(fā)生復(fù)合侵染、隱癥等現(xiàn)象，生物學方法不可有效鑒定。雖然分子生物學方法的靈敏度強且特異性好，但其需要更高的成本和更精密的儀器，且對操作者的要求比較高，所以一般只局限于實驗室使用。綜合而言，血清學方法的操作相對簡便，且具有特異性好、靈敏度高、成本低等特點，所以更適用于大規(guī)模田間樣品的檢測，也易于在基層進行推廣?；诖?，本研究從自建的小麥黃花葉病病圃中采集了大量病葉，用蔗糖硫酸銫密度梯度離心提純病毒，免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)得到了3株能高效分泌WYMV的單克隆抗體細胞株并制備了單抗腹水，其效價達10-7～10-6，以其為核心建立了檢測WYMV的ACP-ELISA方法，其檢測病葉的靈敏度達1∶25 600倍稀釋，且特異性強。利用建立的ACP-ELISA方法測定中國小麥主產(chǎn)區(qū)小麥黃花葉病的發(fā)生情況，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)WYMV的感染率高達63.64%，說明該病仍是當下小麥上極易發(fā)生的病毒病害，應(yīng)引起相關(guān)部門足夠的重視，也提示我們快捷、高效、低成本檢測方法研制的必要性。該方法雖不及RT-PCR法的檢測靈敏度高，但檢出率與其一致，說明其檢測的可靠性。相比于多抗建立的檢測方法，其具有特異性高、均質(zhì)性好，且只要得到1株好的細胞株就可以無限量生產(chǎn)等優(yōu)點。強特異性能有效解決田間WYMV和CWMV復(fù)合感染不易區(qū)分的難題，這在田間應(yīng)用中的優(yōu)點尤為明顯。總之，以單抗為核心建立的ACP-ELISA方法具有操作簡便、準確性強、易標準化和大規(guī)模生產(chǎn)等特點，可有效應(yīng)用于田間小麥WYMV的檢測，對該病毒病的診斷、預(yù)測、預(yù)報及防控具有重要意義。

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