卓城潔， 袁 萌， 伍文攀， 鄧娟華， 喻振國(guó)， 向小亮， 胡朝暾

(懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院/民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418008)

近年來(lái)隨著研究的不斷深入，蜘蛛毒素的重要性日益顯現(xiàn)。蜘蛛毒素的專(zhuān)一性和高效性使其成為潛在的新型藥物、離子通道工具試劑和殺蟲(chóng)劑等領(lǐng)域重要的原料來(lái)源[1-2]，其在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、神經(jīng)生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、天然藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。由于蜘蛛毒液分泌量很少，且其毒液是由很多性質(zhì)不同、含量差異很大的成分組成的混合物，除了幾個(gè)主要成分外，大多數(shù)成分在粗毒中含量很低，因此很難獲得足夠的單體毒素用于相關(guān)研究[3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用毒腺cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建結(jié)合基因工程表達(dá)的方法可以有效解決毒素來(lái)源問(wèn)題。近十年來(lái)，已經(jīng)構(gòu)建了很多有毒動(dòng)物毒腺cDNA文庫(kù)[4-9]，獲得了大量的編碼毒素的ESTs序列。

疼痛是世界醫(yī)學(xué)面臨的重大難題，也是急需攻克的頑固性疾病。目前，這種疾病嚴(yán)重影響到數(shù)百萬(wàn)人的生命[10]。研究發(fā)現(xiàn)電壓門(mén)控鈉通道的改變與炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)[11]。能阻斷這些鈉通道亞型的成分具有開(kāi)發(fā)成為治療疼痛的藥物分子的潛能。由于蜘蛛毒素是一類(lèi)主要作用于離子通道及具有特定藥理學(xué)特性的多肽毒素[12-13]，因此，從蜘蛛粗毒中篩選一些治療疼痛的藥物分子成為研究人員夢(mèng)寐以求的事情。家福捕鳥(niǎo)蛛是一種生活在廣西、云南等地的蜘蛛新種。本實(shí)驗(yàn)室最先對(duì)該蜘蛛毒素進(jìn)行了研究[14]。目前，未見(jiàn)家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺cDNA文庫(kù)相關(guān)研究的報(bào)道。為了闡明家福捕鳥(niǎo)蛛毒素的分子多樣性和獲得其毒素序列，構(gòu)建了一個(gè)定向的毒腺全長(zhǎng)cDNA 文庫(kù)，獲得了752條高質(zhì)量的EST序列，并開(kāi)展了EST聚類(lèi)分析。另外，從家福捕鳥(niǎo)蛛粗毒中篩選到了1種對(duì)DRG細(xì)胞TTX-R鈉通道具有明顯抑制作用的毒素分子(命名為JF-16)，并對(duì)該毒素進(jìn)行了序列分析和活性測(cè)定。這些試驗(yàn)的開(kāi)展為家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺轉(zhuǎn)錄組以及JF-16潛在鎮(zhèn)痛活性分析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 家福捕鳥(niǎo)蛛捕自廣西寧明縣、SD大鼠購(gòu)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。

1.1.2 試劑 cDNA文庫(kù)試劑盒為Clontech公司產(chǎn)品,Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品,DNA Marker、焦碳酸二乙酯、氯霉素、NaOH、葡萄糖、冰乙酸、KCl、MgCl2、溴化乙錠、溴酚藍(lán)、甘油、蛋白酶K、乙醇、氯仿、異丙醇等購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，RNase Free的槍頭和離心管為Axygen公司產(chǎn)品,三氟乙酸(Trifluoroacetic acid ,TFA)、河豚毒素、α-氰基-4-羥基-肉桂酸(CCA)、胰蛋白酶、膠原酶、胰蛋白酶抑制劑、HEPES 、EGTA 、D-glucose 、氯化銫 、氫氧化銫等購(gòu)自Sigma公司，色譜純乙腈購(gòu)自湖南化工研究所，其他為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 儀器 PCR儀和電泳儀均為bio-rad公司產(chǎn)品，MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜儀為Bruker公司產(chǎn)品， U-2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自Hitachi公司，真空冷凍干燥機(jī)為T(mén)hermo Savant公司產(chǎn)品，Waters Alliance 2695高效液相色譜儀為美國(guó)Waters公司產(chǎn)品， EPC-10膜片鉗儀為德國(guó)HEKA公司產(chǎn)品，491型蛋白質(zhì)測(cè)序儀為美國(guó)Applied Biosystem公司產(chǎn)品，高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與分析 將解剖的家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺加入到研缽中液氮研磨30 min至粉狀。采用Trizol試劑提取總RNA，用核酸測(cè)定儀測(cè)定總RNA在260 nm、280 nm處的吸光值，計(jì)算OD260/OD280的值?？俁NA的純度和完整性通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)。

1.2.2 家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺cDNA文庫(kù)構(gòu)建 以總RNA為模板，按照SMARTTM cDNA Library Construction Kit (Clontech) 試劑盒說(shuō)明書(shū)方法合成cDNA第一條鏈，采用LD-PCR法擴(kuò)增合成雙鏈cDNA。將合成的雙鏈cDNA進(jìn)行蛋白酶K消化及SfiI酶切。酶切后雙鏈cDNA用CHROMASPIN- 400 柱分級(jí)分離，選取優(yōu)化的cDNA用T4 DNA 連接酶連接到載體。用電轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coliHST08，將轉(zhuǎn)化后的宿主菌接種到含氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺cDNA文庫(kù)。

1.2.3 cDNA 文庫(kù)的滴度測(cè)定和插入片段檢測(cè) 從文庫(kù)中取1.0 μl 細(xì)菌培養(yǎng)液，分別稀釋不同倍數(shù)，再?gòu)闹腥? μl稀釋菌液與200 μl LB液體培養(yǎng)基混勻后分別涂布于含氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 12～16 h 后計(jì)算菌落生長(zhǎng)個(gè)數(shù)并計(jì)算文庫(kù)滴度。隨機(jī)選取16個(gè)單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)得到插入片段。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；4 ℃冷卻。反應(yīng)完成后，取5 μl產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將符合要求的單克隆菌落送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 EST 序列分析和功能預(yù)測(cè) 將測(cè)序的序列處理后得到高質(zhì)量的EST序列。利用DNAStar 軟件對(duì)EST序列進(jìn)行聚類(lèi)分析。應(yīng)用在線分析軟件Translate tool(http://www.expasy.org/tools/dna.html)對(duì)測(cè)序獲得的EST序列進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列分析。EST及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，可以獲取與目的序列匹配的序列信息及功能注釋。

1.2.5 家福捕鳥(niǎo)蛛毒液采集和JF-16的分離純化 按文獻(xiàn)[3]的方法采集毒液，采集得到的家福捕鳥(niǎo)蛛毒液冷凍干燥后為粗毒。粗毒用超純水配制成濃度為10 mg/ml的溶液，8 000 r/min離心15 min。毒液經(jīng)RP-HPLC分離純化，上樣量為100 μl。反相柱為C18柱 (Phenomenex 100 ?, 4.6 mm×250 mm, 5 μm)。洗脫液A為含0.1 % TFA的水溶液，洗脫液B為含0.1% TFA的乙腈溶液。在50 min內(nèi) 0～50%洗脫液B的線性梯度洗脫，流速為1.0 ml/min ，柱溫40 ℃，在215 nm下收集洗脫峰冷凍干燥或質(zhì)譜分析。

1.2.6 JF-16的MALDI-TOF分析 質(zhì)譜分析在MALDI-TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行。N2激光器，離子源加速電壓為20 kV，檢測(cè)電壓16.5 kV，激光波長(zhǎng)337 nm，陽(yáng)離子模式。用含0.1 % TFA 的50 % 乙腈溶液溶解CCA基質(zhì)至終濃度為10 mg/ml，取 0.5 μl樣品與1.0 μl CCA基質(zhì)液混合，再取0.5 μl混合液點(diǎn)樣室溫干燥后質(zhì)譜鑒定。使用外標(biāo)(混合標(biāo)準(zhǔn)樣品)進(jìn)行校正。

1.2.7 大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的急性分離培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。

1.2.8 鈉電流的全細(xì)胞膜片鉗記錄 將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為細(xì)胞外液，20～25 ℃置于倒置顯微鏡下選擇質(zhì)膜光滑飽滿的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞模式(Whole-cell)膜片鉗試驗(yàn)。玻璃電極經(jīng)電極拉制儀(PC-10，Narishige)兩步拉制后熱拋光，加電極內(nèi)液后電阻為 1.8～3.0 MΩ。電極內(nèi)液：CsCl 145 mmol/L，MgCl24 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，D-Glucose 10 mmol/L，ATP-Mg 2 mmol/L，用1 mol/L CsOH 調(diào)節(jié)pH至7.2。細(xì)胞外液：NaCl 145.0 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，D-glucose 10.0 mmol/L，用1 mol/L NaOH調(diào)至7.2。2種溶液都用蔗糖調(diào)至280 mOsm/L。試驗(yàn)細(xì)胞形成穩(wěn)定電流后經(jīng)過(guò)3 kHz和10 kHz的雙重過(guò)濾，采用P/4程序刪除電容電流和線性漏電流。采用低壓微量進(jìn)樣器施加毒素。毒素先配制成1 mmol/L的母液，-20 ℃儲(chǔ)存。試驗(yàn)時(shí)稀釋至目的濃度，加藥劑量為10 μl。

1.2.9 JF-16的氨基酸序列測(cè)定 氨基酸序列分析是利用Edman降解原理，在Perkin Elmer Procise 491A型氣相測(cè)序儀上進(jìn)行的。選用碘乙酰胺烷基化修飾后的毒素肽作為測(cè)序樣品。根據(jù)毒素分子量大小設(shè)定測(cè)序循環(huán)數(shù)。

1.2.10 JF-16的cDNA序列分析 根據(jù)JF-16 Edman降解測(cè)定的氨基酸序列和EST編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)，找到JF-16的cDNA序列。應(yīng)用在線分析軟件SignalP 4.1程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行JF-16 前體信號(hào)肽預(yù)測(cè)。根據(jù)Von等[16]的方法確定JF-16前體肽酶切割位點(diǎn)。根據(jù)在線分析軟件(http://web.expasy.org/protparam/)計(jì)算JF-16成熟肽序列的理論等電點(diǎn)和理論分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取與分析

Trizol提取的家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè), 測(cè)得總RNA 的OD260/OD280=1.87，比值在 1.8～2.0，說(shuō)明家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺總RNA純度較好。總RNA 濃度為0.49 μg/μl?？俁NA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后顯示出28S、18S和5S 3個(gè)條帶(圖1)。從圖譜中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，表明家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺總RNA提取成功。

M：Marker。圖1 家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of total RNA from venom glands of Selenocosmia jiafu

2.2 雙鏈cDNA的合成和片段大小的選取

取1.0 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，再以第一鏈產(chǎn)物為模板通過(guò)長(zhǎng)距離PCR合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，條帶分布在 300～3 000 bp，且在 400～750 bp區(qū)域形成亮帶 (圖2)。雙鏈cDNA經(jīng)蛋白酶K和SfiI酶切消化，再通過(guò)CHROMASPIN-400柱分離并收集液滴，最后從每1管中取出適量樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，保留 400～750 bp (短片段部分，主要是毒素基因)和 750～2 000 bp(長(zhǎng)片段部分，主要是細(xì)胞蛋白基因)兩部分(圖3)。保留這兩部分片段是基于下列考慮：研究發(fā)現(xiàn)蜘蛛毒素主要是由 20～65個(gè)氨基酸殘基組成的多肽類(lèi)毒素。根據(jù)毒素氨基酸殘基數(shù)目大致估計(jì)其前體肽的大小，再加上5′端非編碼區(qū)和3′端非編碼區(qū)部分，最終估算家福捕鳥(niǎo)蛛毒素cDNA片段大小大致在400～750 bp。另外，蜘蛛毒腺完成毒液的合成和分泌等生命活動(dòng)需要很多相關(guān)蛋白質(zhì)參與。因此，保留長(zhǎng)片段部分是為了得到相關(guān)蛋白質(zhì)的信息，以期對(duì)蜘蛛毒腺分泌毒液的機(jī)理有初步的了解。

M：Marker。圖2 家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺雙鏈cDNA電泳圖Fig.2 Electrophoresis of double-stranded cDNA from venom glands of S. jiafu

M：Marker；a：400～750 bp；b：750～2 000 bp。圖3 家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺雙鏈cDNA柱分離后電泳圖Fig.3 Electrophoresis of double-stranded cDNA from venom glands of S. jiafu by column separation

2.3 文庫(kù)庫(kù)容和插入片段大小分析

將家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺cDNA進(jìn)行放大培養(yǎng)檢測(cè)，結(jié)果顯示短片段部分cDNA文庫(kù)的初級(jí)文庫(kù)滴度為 2.0×107CFU/ml，長(zhǎng)片段部分cDNA文庫(kù)的初級(jí)文庫(kù)滴度為 1.4×106CFU/ml，均符合cDNA文庫(kù)構(gòu)建的要求(一般要求文庫(kù)滴度在 1.0×105CFU/ml以上即為有效庫(kù)容)。長(zhǎng)片段和短片段各隨機(jī)抽取16個(gè)克隆進(jìn)行插入片段大小檢測(cè)。圖4為插入片段電泳檢測(cè)圖，從圖中可知短片段長(zhǎng)度為 400～750 bp，平均長(zhǎng)度約500 bp，長(zhǎng)片段長(zhǎng)度為 750～2 000 bp，平均長(zhǎng)度為1 500 bp。

A:400～750 bp 插入片段電泳圖;B:750～2 000 bp 插入片段電泳圖。圖4 家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺cDNA文庫(kù)插入片段電泳圖Fig.4 Electrophoresis of the inserted fragments of cDNA library from venom glands of S. jiafu

2.4 EST序列分析和功能預(yù)測(cè)

選取899個(gè)短片段菌落和400個(gè)長(zhǎng)片段菌落送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，最后獲得高質(zhì)量的EST序列752條。752條EST經(jīng)聚類(lèi)分析得到257個(gè)唯一序列(Unique sequence)，其中61個(gè)重疊群(Contigs)和196個(gè)單一序列(Singletons)。61個(gè)重疊群中，2個(gè)重疊群包含50條以上的ESTs，4個(gè)重疊群包含 20～49條ESTs，9個(gè)重疊群包含 10～19條ESTs，46個(gè)重疊群包含 2～9條ESTs。752條EST序列中毒素序列438條(毒素序列必須同時(shí)滿足2個(gè)條件：序列含有信號(hào)肽和含有4個(gè)或4個(gè)以上半胱氨酸)，普通蛋白序列220條，另外有94條序列沒(méi)有匹配到相似的序列。

EST序列的豐度能反映該轉(zhuǎn)錄組的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。因此，按EST序列重復(fù)數(shù)高低將EST序列的豐度分成5個(gè)區(qū)段。(1)≥50 ESTs：包含2個(gè)重疊群，每個(gè)重疊群含50條以上的EST序列，這是家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺轉(zhuǎn)錄組中最豐富的部分，該2族占所有族的比例為0.78%(2/257)，而所包含的EST序列占整個(gè)EST序列的比例卻高達(dá)21.94% (165/752)，這2個(gè)重疊群全部是毒素基因。(2) 20～49 ESTs：包含4個(gè)重疊群，該4族占所有族的比例為1.56%(4/257)，而所包含的EST序列占整個(gè)EST序列的比例為16.62% (125/752)，這4個(gè)重疊群全部是毒素基因。(3)10～19 ESTs：包含9個(gè)重疊群，該9族占所有族的比例為3.50%(9/257)，而所包含的EST序列占整個(gè)EST序列的比例為15.03% (113/752)，這9個(gè)重疊群中有7個(gè)重疊群是毒素基因， 2個(gè)重疊群是普通細(xì)胞蛋白基因。(4)2～9 ESTs：包含46個(gè)重疊群，該46族占所有族的比例為17.90%(46/257)，而所包含的EST序列占整個(gè)EST序列的比例為20.35% (153/752)，這46個(gè)重疊群中有11個(gè)重疊群是毒素基因，另外35個(gè)重疊群為普通細(xì)胞蛋白基因。(5)1 EST：196個(gè)單拷貝序列，其所占族的比例為76.26%(196/257)，而所包含的EST序列占整個(gè)EST序列的比例為26.06% (196/752)，這196個(gè)單一序列中有9個(gè)是毒素基因，另外187個(gè)是普通細(xì)胞蛋白基因。因此，家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺轉(zhuǎn)錄組中絕大部分的單一序列基因?yàn)榉嵌舅鼗颉?/p>

2.5 JF-16的分離純化、分子量和活性鑒定

圖5為家福捕鳥(niǎo)蛛粗毒反相高效液相色譜圖。粗毒經(jīng)RP-HPLC后得到40多個(gè)色譜峰，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)將各個(gè)色譜峰進(jìn)行TTX-R通道活性篩選。發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為29.81 min的標(biāo)注為16的色譜峰(命名JF-16)經(jīng)全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)，對(duì)DRG細(xì)胞TTX-R通道電流具有抑制作用。JF-16膜片鉗活性鑒定時(shí)，先往細(xì)胞外液中加入200 nmol/L TTX，將DRG細(xì)胞上記錄的河豚毒素敏感性(Tetrodotoxin-sensitivity, TTX-S)鈉電流阻斷。選取小直徑(<10 μm)的DRG細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗試驗(yàn)，將膜電位控制在-80 mV，給予脈沖寬度為50 ms，以10 mV步幅遞增的去極化電壓刺激引出DRG細(xì)胞TTX-R電流，再加入JF-16進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗TTX-R通道活性的測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)JF-16對(duì)DRG細(xì)胞上TTX-R通道具有抑制作用。濃度為400 nmol/L 的JF-16大約抑制 36.17%±3.2% (n=5) TTX-R鈉通道電流，當(dāng)JF-16濃度增到1 μmol/L時(shí)大約能抑制 49.89%±4.70% (n=5)的TTX-R鈉通道電流(圖6A)。JF-16經(jīng)MALDI-TOF鑒定分子量為3 954.616(圖6B)。

圖5 JF-16反相高效液相色譜圖Fig.5 Reversed phase-HPLC of JF-16

圖6 JF-16對(duì)大鼠DRG細(xì)胞TTX-R鈉電流的影響(A)及其質(zhì)譜分析圖譜(B)Fig.6 Effects of JF-16 on TTX-R sodium currents in rat dorsal root ganglion neurons (A) and MALDI-TOF mass analysis (B)

眾所周知，DRG細(xì)胞表達(dá)的TTX-R鈉電流為Nav1.8和Nav1.9電流，其中以Nav1.8為主。這2類(lèi)鈉通道電流也是目前研究的熱點(diǎn)。Nav1.8被認(rèn)為和神經(jīng)性疼痛相關(guān)[10]，而Nav1.9通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性從而與炎癥反應(yīng)和疼痛調(diào)節(jié)緊密相關(guān)[17]。Nav1.8主要在小直徑和中等直徑感覺(jué)神經(jīng)元上高表達(dá)，可被閾上電位激活，且呈現(xiàn)緩慢激活,緩慢失活及快速去失活的動(dòng)力學(xué)特征，從而介導(dǎo)大量鈉離子內(nèi)流引起細(xì)胞膜快速去極化，因此是動(dòng)作電位上升相的主要電流成分[18]。大量研究結(jié)果表明Nav1.8在機(jī)體炎癥、神經(jīng)病理性以及多種傷害性刺激誘發(fā)的疼痛中具有重要作用，因此靶向Nav1.8已成為新型鎮(zhèn)痛藥研發(fā)的新策略和熱點(diǎn)[19-20]。由于JF-16能夠抑制DRG細(xì)胞TTX-R鈉通道電流，因此，JF-16是一個(gè)潛在的可能具有鎮(zhèn)痛活性的毒素分子。

2.6 JF-16的序列測(cè)序與分析

通過(guò)Edman降解法進(jìn)行全序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)JF-16是1個(gè)由35個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，全序列為：H2N-ECTKLLGGCTKSSECCPHLGCRRKWPYHCGWDGTF-COOH，序列中包含有6個(gè)Cys。根據(jù)在線分析軟件計(jì)算得到該序列的理論分子量為3 960.5,這與質(zhì)譜鑒定所測(cè)定的值相差約6.0，表明該多肽分子的6個(gè)半胱氨酸殘基形成了3對(duì)二硫鍵。該序列中包含3個(gè)極性帶負(fù)電荷的酸性氨基酸(1Asp+2 Glu)和5個(gè)極性帶正電荷的堿性氨基酸(2Arg+3Lys)，堿性氨基酸數(shù)大于酸性氨基酸數(shù)使得整個(gè)多肽分子偏堿性，這與在線分析軟件計(jì)算出的該序列理論等電點(diǎn)為8.35相符。

2.7 JF-16的cDNA序列分析

根據(jù)JF-16 Edman降解測(cè)定的氨基酸序列和EST編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)，找到編碼JF-16的cDNA序列。研究發(fā)現(xiàn)JF-16的全長(zhǎng)cDNA為518 bp，其中開(kāi)放閱讀框ORF長(zhǎng)261 bp，編碼87個(gè)氨基酸(前體肽)。5′-端非翻譯區(qū)(5′-UTR)長(zhǎng)116 bp, 3′-端非翻譯區(qū)(3′-UTR)長(zhǎng)141 bp, 具有典型的polyA 尾結(jié)構(gòu)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在前體肽N末端含有1個(gè)21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列, 切割位點(diǎn)位于21位A和22位A之間。起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA。前體肽具有典型的“EER”蛋白酶水解位點(diǎn)(48～50)和酰胺化標(biāo)記殘基“GF”(86、87)。毒素前體被蛋白水解酶在“EER”位點(diǎn)水解為成熟肽儲(chǔ)存于毒囊中，尾部的2個(gè)酰胺化標(biāo)記氨基酸殘基“GF”也會(huì)切割。最終形成由35個(gè)氨基酸組成的成熟肽，與Edman降解法測(cè)定的序列完全吻合。JF-16的cDNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列見(jiàn)圖7。

灰色部分表示信號(hào)肽序列(1～21)；下劃線表示蛋白水解酶位點(diǎn)(EER)；▲表示保守的半胱氨酸殘基；*表示終止密碼子。圖7 JF-16 cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.7 Deduced amino acid sequence and cDNA sequence of JF-16

3 討 論

cDNA文庫(kù)構(gòu)建是研究基因功能和發(fā)現(xiàn)新基因的主要技術(shù)方法，而高質(zhì)量的RNA 是cDNA文庫(kù)構(gòu)建成功的必要條件。本試驗(yàn)采用Trizol法提取家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺總RNA，所提取的毒腺總RNA經(jīng)電泳檢測(cè)未見(jiàn)明顯的降解，純度和含量都符合要求，表明家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺總RNA提取成功。影響文庫(kù)質(zhì)量的另一個(gè)因素是構(gòu)建方法的選擇。本試驗(yàn)采用SMART 法構(gòu)建了家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺cDNA文庫(kù)。SMART 法是Clontech公司發(fā)明的一種全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)[21]：(1)文庫(kù)構(gòu)建時(shí)所需mRNA量少，一般只需要 0.5～1.0 μg；(2)文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中mRNA 不會(huì)損耗和降解；(3)試驗(yàn)快速和簡(jiǎn)便。cDNA文庫(kù)構(gòu)建后進(jìn)行了文庫(kù)滴度和cDNA片段大小的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的文庫(kù)滴度和獲得的插入片段大小均符合文庫(kù)構(gòu)建的要求，表明家福捕鳥(niǎo)蛛毒腺cDNA文庫(kù)構(gòu)建成功。

BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)JF-16與敬釗纓毛蛛部分毒素[22]及一種生活在澳大利亞的捕鳥(niǎo)蛛Phlogiussp.毒素分子μ-TRTX-Phlo1a、μ-TRTX-Phlo1b相似性很高[23]。這些毒素分子的Cys不但高度保守且位置也基本相同，為第2、第9、第15、第16、第21、第29位，第15和第16位Cys緊密相鄰。其他很多氨基酸殘基也高度保守，如第7位的Gly，第18、第19位的His、Leu，第24、第25位的Lys、Trp，第26位的Pro，第31、第32位的Trp、Asp。BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)JF-16與JZTX-9有高達(dá)94%的序列相似性[24]。JZTX-9是一個(gè)含有6個(gè)半胱氨酸，由35個(gè)氨基酸殘基組成的C端酰胺化的多肽分子。與JZTX-9相比，JF-16的第12位由極性帶負(fù)電荷的酸性氨基酸Asp變成極性不帶電荷的中性氨基酸Ser，第21位由極性帶正電荷的堿性氨基酸Lys變成Arg。因此，JF-16的理論等電點(diǎn)會(huì)高于JZTX-9。JZTX-9空間結(jié)構(gòu)屬于典型的抑制型胱氨酸結(jié)構(gòu) (Inhibitor cystine knot，ICK) 模體，由于JF-16與JZTX-9序列相似性很高，推斷JF-16的空間結(jié)構(gòu)也很有可能屬于ICK模體。

由于JF-16 對(duì)DRG細(xì)胞上TTX-R鈉通道電流具有抑制作用，因此，可以將JF-16作為一個(gè)潛在的鎮(zhèn)痛藥物開(kāi)展相關(guān)研究。當(dāng)然，JF-16 對(duì)DRG細(xì)胞上TTX-R鈉電流具有抑制作用并不意味著JF-16就能夠成為鎮(zhèn)痛藥物。首先，JF-16開(kāi)發(fā)成為鎮(zhèn)痛藥物分子需要其具有高度的專(zhuān)一性。近十年來(lái)，在靶向Nav1.8鎮(zhèn)痛新藥研發(fā)領(lǐng)域， 國(guó)際上主要集中在專(zhuān)一性抑制劑的發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制研究。雖然取得一些進(jìn)展[25-26]，但是國(guó)際上該研究領(lǐng)域進(jìn)展緩慢，具有應(yīng)用前景的Nav1.8 專(zhuān)一性抑制劑很少。其次，JF-16必須具有高效低毒性的特性。另外，本研究只開(kāi)展了JF-16 對(duì)DRG細(xì)胞上TTX-R鈉通道活性的初步檢測(cè)，未開(kāi)展通道的分子水平作用機(jī)理研究，后續(xù)可以開(kāi)展這方面的研究。

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