吳海燕，郭萌萌，鄭關(guān)超，彭吉星，翟毓秀，譚志軍

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266071)

赤潮災(zāi)害是中國近海四大主要自然災(zāi)害之一[1]。近幾年，中國貝類毒素呈現(xiàn)出常態(tài)性和普遍性的多毒素復(fù)合污染現(xiàn)狀[2-5]，且多次造成重大突發(fā)性中毒事件?，F(xiàn)有八大類毒素中，氮雜螺環(huán)酸毒素(azaspiracids，AZAs)是在中國海域最新發(fā)現(xiàn)的毒性強(qiáng)、殘留高且代謝慢的一類脂溶性貝類毒素[6-8]，其具有以下特點(diǎn)：1)毒性強(qiáng)，對人類觀察到的最小效應(yīng)劑量(LOAEL)為0.4 μg/kg，遠(yuǎn)低于麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)2.0 μg/kg的水平[6]；2)殘留高，多種貝類對AZAs的富集能力均極強(qiáng)，現(xiàn)有觀察到的最高含量達(dá)到限量標(biāo)準(zhǔn)的56倍之多[9]；3)代謝慢，AZAs在貝類中消除半衰期則長達(dá)11 d，自然條件下可長時間存在于貝類中[10]。目前，部分發(fā)達(dá)國家或國際組織將AZAs設(shè)定安全限量為0.16 mg/kg (以AZA1計)，限定對象為AZA1、AZA2和AZA3。然而，中國仍未系統(tǒng)開展該毒素的科學(xué)研究，且未設(shè)定安全限量，對中國水產(chǎn)品國際貿(mào)易與質(zhì)量安全存在潛在不利影響。近幾年，多位中國學(xué)者相繼開展中國海域貝類毒素污染現(xiàn)狀調(diào)查，研究對象主要是腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish toxins，DSTs)和麻痹性貝類毒素[3,5,11-13]，對于AZAs的研究多局限于關(guān)注AZA1[4-5]。研究表明，AZAs產(chǎn)毒藻腹孔環(huán)胺藻(Azadiniumpoporum)廣泛分布于中國近海海域，超過86%的藻株均可產(chǎn)生AZAs[14-15]，甚至雙殼貝類中的AZAs也多次檢出[4,16]。產(chǎn)毒藻與市售貝類中毒素的先后發(fā)現(xiàn)表明AZAs已對中國近海生態(tài)和食用安全帶來嚴(yán)重的潛在威脅。鑒于AZAs的高風(fēng)險性，開展中國AZAs風(fēng)險評估，設(shè)定合理限量以確保食品安全已迫在眉睫。因此，本文總結(jié)了AZAs的理化性質(zhì)、分布現(xiàn)狀與檢測方法的進(jìn)展，并分析了該毒素的分布規(guī)律與風(fēng)險形成機(jī)制，以期為科學(xué)開展相關(guān)風(fēng)險評估研究提供背景資料和參考依據(jù)。

1 氮雜螺環(huán)酸毒素概況

1.1 理化性質(zhì)

AZAs是一類具有獨(dú)特聚醚類螺環(huán)結(jié)構(gòu)的脂溶性海洋生物毒素，含雜環(huán)胺(哌啶)和羧酸結(jié)構(gòu)(圖1)，分子質(zhì)量為716～902 Da。2008年李愛峰等[17]首次將原多甲藻多產(chǎn)的Azaspiracid毒素，翻譯為“原多甲藻酸”，后經(jīng)證實(shí)該毒素是由環(huán)胺藻屬的甲藻產(chǎn)生的，故現(xiàn)遵循其毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，更正為“氮雜螺環(huán)酸”。AZAs目前已分離鑒定40余種，其中產(chǎn)毒藻中主要產(chǎn)生AZA1～3中的一種或者兩種[10]，另有30余種AZAs產(chǎn)毒藻被海洋生物攝食后經(jīng)過復(fù)雜的代謝轉(zhuǎn)化反應(yīng)形成的AZA代謝產(chǎn)物[18]。AZAs在生物基質(zhì)中主要發(fā)生兩種形式的Ⅰ相代謝轉(zhuǎn)化反應(yīng)：1)C3和C23位點(diǎn)的羥基化(圖1)； 2)C8和C22位點(diǎn)的甲基化以及羧基化[19]。而AZAs II相代謝過程的相關(guān)研究較少，僅見關(guān)于AZA1的葡萄糖醛酸復(fù)合型代謝產(chǎn)物[20]和AZAs谷胱甘肽型代謝產(chǎn)物[21]的報道。AZA毒素具有熱穩(wěn)定性，受毒素結(jié)構(gòu)差異影響，耐受溫度從90～130 ℃不等，因此常規(guī)的加熱方式不能破壞其毒性。常規(guī)烹調(diào)也會造成AZA代謝產(chǎn)物之間的轉(zhuǎn)換[22-23]，如C22位點(diǎn)去甲基化代謝物(AZA3，AZA4，AZA6和AZA9)即為加熱條件下生成的產(chǎn)物。AZAs雖被劃分為脂溶性貝類毒素，但其兼具水溶性和脂溶性，主要溶解于甲醇、乙腈或丙酮，不溶于正己烷，可以溶解于中性海水和產(chǎn)毒藻培養(yǎng)液中[24]。AZAs在甲醇溶液中易發(fā)生甲基化反應(yīng)，低溫條件下反應(yīng)較慢，而高溫堿性或者酸性條件下反應(yīng)迅速。因此，單獨(dú)檢測AZAs的方法中應(yīng)避免使用甲醇，改用丙酮或乙腈水溶液。

圖1 AZAs的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of AZAs

1.2 致毒機(jī)理

AZAs與腹瀉性貝毒DSTs的臨床癥狀相似，主要作用靶器官為腸道，中毒癥狀包括惡心、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和胃腸部痙攣等，通常在食后12～24 h后發(fā)作，持續(xù)時間為1～5 d，尚未發(fā)現(xiàn)致死案例。AZAs比其他含氮類生物毒素毒性更強(qiáng)、更穩(wěn)定，急性致毒的參考劑量ARfD值為0.2 AZA1 μg/kg b.w.，低于其他貝類毒素(okadaic acid,OA)ARfD值(0.33 μg/kg b.w.)[25]。目前為止，世界3個主要風(fēng)險評估機(jī)構(gòu)(FAO，ICO/WHO和EFSA)已對AZAs開展風(fēng)險評估研究[26-28]，其中FAO和EFSA強(qiáng)烈建議將目前的限量(0.16 mg/kg，以AZA1計)大幅度降低(至30 μg/kg，以AZA1計)。研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)的烹飪和加工處理無法降低AZAs毒性，迄今尚未找到有效的治療方法和治療藥物。雖然AZAs與氫氧化鈉溶液在76 ℃下反應(yīng)10 min后可顯著降低其毒性，但因該方法對貝類品質(zhì)和可食用性造成的顯著性破壞，從而未被實(shí)際采用。

AZAs毒性作用機(jī)制非常獨(dú)特，目前仍未得到充分證實(shí)。雖然AZAs的細(xì)胞毒性作用可通過抑制鉀離子和鈉離子通道實(shí)現(xiàn)，但AZAs并不具有蛋白磷酸酶、激酶、G蛋白偶聯(lián)受體以及肌動蛋白聚合/解聚合抑制作用[29]，因此其致毒機(jī)理與其他貝類毒素不同。研究發(fā)現(xiàn)，乳豬注射高劑量AZA毒素純品時，沒有出現(xiàn)典型的AZA毒素中毒癥狀[30]，而含AZAs的貝類組織粗提物卻表現(xiàn)出了強(qiáng)毒性。為了解釋這一異?，F(xiàn)象，Chevallier等[31]應(yīng)用代謝組學(xué)方法首次證實(shí)了貝類基質(zhì)中的戊二酸是重要的AZAs毒性作用催化劑，能顯著提高50%以上的鈉離子通道阻斷率，且在實(shí)際陽性AZAs樣品中也檢出了戊二酸。由此可見，AZAs是與特定物質(zhì)通過協(xié)同作用從而發(fā)揮毒性作用。

1.3 細(xì)胞毒性與協(xié)同作用

AZAs具有顯著的組織、細(xì)胞和基因毒性，且毒性大小與時間、濃度以及其結(jié)構(gòu)有顯著的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，AZAs依靠自身特有的ABCDE和FGHI環(huán)結(jié)構(gòu)基團(tuán)(圖1)，與人神經(jīng)母細(xì)胞瘤作用靶點(diǎn)結(jié)合，使得纖維肌動蛋白發(fā)生重排，從而改變細(xì)胞骨架。并且這一過程不受天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)系的細(xì)胞凋亡調(diào)控，與DSTs相比可明顯提高人淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和胞液內(nèi)Ca2+濃度。由此看來，AZAs的細(xì)胞毒性作用機(jī)制與OA是不同的，是通過特殊的結(jié)構(gòu)基團(tuán)與細(xì)胞結(jié)合，具有特定的細(xì)胞作用靶點(diǎn)。另外，毒素的基因毒性研究表明，AZA1～3對細(xì)胞DNA片段存在顯著的時間-劑量依賴關(guān)系。AZA1～3三種成分對于細(xì)胞毒素毒性靈敏度為CaCo-2

自然海域中，無論是正常情況還是赤潮爆發(fā)時，往往是多種產(chǎn)毒藻并存，從而造成雙殼貝類中多毒素復(fù)合污染的現(xiàn)象。由于各種毒素致毒機(jī)理上的差異，多種毒素的復(fù)合污染可能會出現(xiàn)毒素間的協(xié)同或抑制作用。AZAs與DSTs均作用于胃腸道上皮細(xì)胞，因此可能存在毒性的協(xié)同作用，從而給機(jī)體造成更大的損害。研究表明，小鼠同時口服暴露OA和AZA1(相當(dāng)于LD10劑量570 μg/kg)，毒素的吸收率顯著降低[33]。在研究OA、 YTX和AZA1對Caco-2和HIEC(human intestinal epithelial crypt-like cells)的復(fù)合毒性時，發(fā)現(xiàn)AZA1與YTX的毒性具有協(xié)同作用[34]。目前關(guān)于復(fù)合毒素污染之間的毒性協(xié)同作用研究尚處于起步階段，因此仍有大量的研究工作急需開展。

2 氮雜螺環(huán)酸毒素檢測技術(shù)

2.1 生物檢測方法

AZAs檢測的生物檢測方法主要包括小鼠腹腔注射法、大鼠口服法以及酶聯(lián)免疫檢測方法。由于AZAs與DSTs均是作用于消化系統(tǒng)且具有急性毒性的毒素，自2002年歐盟設(shè)定AZAs限量后，即暫定采用DSTs毒素的小鼠生物法進(jìn)行檢測。但該方法僅能提供DSTs和AZAs的有無及總量大小，不能區(qū)分毒素類型及含量。

酶聯(lián)免疫法是利用抗原與抗體反應(yīng)，微孔板包被有針對各類毒素抗體的捕捉抗體，加入酶標(biāo)記物，游離的酶標(biāo)記物與毒素抗體競爭連接捕捉抗體，通過對特定吸收波長的吸收強(qiáng)度比對，對毒素進(jìn)行定性定量的檢測。此方法具有專一性強(qiáng)、使用方便、檢測時間短等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用ELISA免疫檢測方法[35]，可同時檢測AZA1～10等10余種同系物，檢出限為57 μg/kg。

2.2 液相色譜檢測方法

AZAs在波長大于210 nm的范圍缺少特征吸收峰，不能用常規(guī)液相色譜方法檢測。通過使用9-蒽基重氮甲烷(9-anthryldiazomethane，ADAM)對AZAs結(jié)構(gòu)上的羧酸基團(tuán)進(jìn)行衍生化，可應(yīng)用LC-FLD進(jìn)行檢測。由于該方法操作復(fù)雜，目前應(yīng)用較少。AZAs屬于脂溶性貝類毒素，自2015年歐盟全面廢止小鼠生物檢測方法，已改用了包括3種AZAs的脂溶性貝類毒素目標(biāo)物篩查方法[36]——液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法[23, 37-38]。該方法已全面應(yīng)用于貝類毒素的日常監(jiān)測工作，與小鼠生物法檢測結(jié)果一致性約為93%，滿足常規(guī)檢測要求。方法靈敏度高，檢出限為40 μg/kg(以AZA1計)，遠(yuǎn)低于限量值。貝類樣品經(jīng)過兩次甲醇提取定容后，直接進(jìn)樣測定，基質(zhì)曲線外標(biāo)法定量。

串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法在實(shí)際應(yīng)用過程中，主要存在的不足包括：貝類海產(chǎn)品及其制品基質(zhì)較為復(fù)雜，易出現(xiàn)干擾或者假陽性現(xiàn)象；甲醇提取過程中，AZAs部分發(fā)生的甲基化反應(yīng)，給檢測結(jié)果造成一定偏差；質(zhì)譜目標(biāo)物篩查方法，僅監(jiān)控3種目標(biāo)物(AZA1～3)，種類較少。另因其方法局限性、標(biāo)準(zhǔn)品缺失、毒性當(dāng)量因子換算引入的誤差[39]等問題的存在，致使目前的貝類毒素安全監(jiān)控很大程度上未能切實(shí)保證消費(fèi)者的食用安全。目前針對前處理過程的方法研究包括QuECHERS[40]、固相萃取柱凈化[38]等方法，可有效降低貝類基質(zhì)中的干擾物質(zhì)，顯著提高方法的靈敏度和穩(wěn)定性。而貝類中AZAs的危害程度和風(fēng)險大小整體取決于全部AZA代謝產(chǎn)物的殘留程度與毒性強(qiáng)度，而貝類毒素的復(fù)合污染情況也愈加嚴(yán)重，因此生物毒素高通量多因子及其代謝產(chǎn)物檢測方法尤為重要。

高分辨串聯(lián)質(zhì)譜如線性離子阱、靜電場軌道阱以及飛行時間高分辨質(zhì)譜[41]，在多毒素篩查、標(biāo)準(zhǔn)品的制備[42]、代謝產(chǎn)物的發(fā)掘和結(jié)構(gòu)鑒定等方面均有廣泛應(yīng)用。2008年，Rehmann等[19]使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法確定了AZA12～32的結(jié)構(gòu)。近年來，質(zhì)譜檢測與核磁檢測聯(lián)合應(yīng)用于多種新型結(jié)構(gòu)鑒定?；诤舜殴舱駲z測技術(shù)與高分辨串聯(lián)質(zhì)譜同時鑒定新型毒素AZA36和AZA37[43]結(jié)構(gòu)，且兩種毒素的T細(xì)胞毒性測試顯示其毒性僅比AZA1分別低約6和3倍。多種質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合(包括線性離子阱質(zhì)譜、飛行時間質(zhì)譜和靜電場軌道阱組合)分析定性產(chǎn)毒藻中新型AZAs[37]，包括AZA54至AZA58等。

3 氮雜螺環(huán)酸毒素的分布現(xiàn)狀

3.1 全球化分布趨勢

AZAs是由海洋微藻產(chǎn)生的一類藻毒素(phyctoxins)，主要的產(chǎn)毒藻屬為環(huán)胺藻Azadiniumspp.(約為11 ～20 μm)和Amphidomaspp.(未定中文名)。AZAs產(chǎn)毒藻細(xì)胞非常小，在普通的光學(xué)顯微鏡下極易被忽略，并且不是常規(guī)分子監(jiān)控手段的目標(biāo)物，直至1996年才首次確認(rèn)并鑒別出AZAs產(chǎn)毒藻。目前，Azadiniumspp.的分離鑒別技術(shù)較為完善，多種新型檢測與赤潮監(jiān)測技術(shù)已被多方采用。如應(yīng)用基因探針技術(shù)，結(jié)合qPCR(quantitative polymerase chain reaction)與FISH(fluorescence in situ hybridization)可定向檢測Azadiniumspp.[44]，方法精準(zhǔn)可靠且適用性強(qiáng)。但這一新型檢測技術(shù)還不能區(qū)分產(chǎn)毒/無毒藻種，僅用于藻種鑒別與定量分析。在過去的五年間，全球范圍內(nèi)又有多達(dá)十余種新型AZAs產(chǎn)毒藻被發(fā)現(xiàn)[45]。這一現(xiàn)象即表明AZAs的全球化發(fā)展趨勢，同時由于產(chǎn)毒藻的多樣性尚有待完善，因此目前AZAs的全球分布情況仍不十分清晰。

目前，已鑒別出AZAs主要產(chǎn)毒藻株包括A.spinosum，A.obesum，A.poporum，A.polongum，A.caudatum，A.dexteroporum[46]以及Amphidomalanguida[47-48]7大類(圖2)。不同產(chǎn)毒藻株間產(chǎn)毒性狀具有顯著差異，依據(jù)產(chǎn)毒藻的基因序列和核酸類型分為核糖A、B和C共3種。其中，歐洲和新西蘭海域的產(chǎn)毒藻A.spinosum屬于核糖A型，而來源于韓國、美國和阿根廷海域產(chǎn)毒藻A.poporum屬于核糖B或者C型，比較而言，A.poporum分布更為廣泛。除了不同藻株間的產(chǎn)毒性狀差異，產(chǎn)毒藻的產(chǎn)毒情況還受環(huán)境條件的影響。A.spinosum對環(huán)境和營養(yǎng)條件中的溫度最為敏感，最適溫度為18～22 ℃。低溫條件下藻細(xì)胞產(chǎn)毒能力更強(qiáng)，如10 ℃時產(chǎn)毒為220 fg/cell[49]，為18～26 ℃時產(chǎn)毒能力的20余倍。分離自中國南海海域的A.poporum[50]優(yōu)勢株AZDY06，主要產(chǎn)毒為AZA2，受溫度條件影響單細(xì)胞最高產(chǎn)毒達(dá)40 fg/cell，其他營養(yǎng)條件如培養(yǎng)介質(zhì)、氮源等對生長與產(chǎn)毒性狀不存在顯著影響。

圖2 AZAs產(chǎn)毒藻光學(xué)顯微鏡(上層)和電學(xué)顯微鏡(下層)結(jié)構(gòu)圖(比例尺=5 μm)[45-46]Fig.2 Light microscopy (upper panel) and electron microscopy (lower panel) micrographs of species of Azadinium and Amphidoma languida (Scale bars=5μm)[45-46]

3.2 時空分布規(guī)律與監(jiān)控手段

赤潮的爆發(fā)以及貝類毒素的產(chǎn)生，具有一定的時間性和地域性分布規(guī)律。其中，溫度是海洋浮游植物現(xiàn)存量和群落結(jié)構(gòu)最重要的影響因素，可以在不同時空間尺度上調(diào)控赤潮爆發(fā)與生物演替[51]。除了適宜的海水溫度，近海岸帶的作用和內(nèi)部洋流涌動頻繁是藻類赤潮爆發(fā)和生物體毒素蓄積的主要影響因素。歐洲的愛爾蘭地區(qū)為主要的具刺環(huán)胺藻A.spinosum赤潮爆發(fā)地區(qū)，2012年曾爆發(fā)目前國際上可觀測到最大規(guī)模、最大范圍的赤潮[44]。據(jù)該地區(qū)過去11年的具刺環(huán)胺藻監(jiān)控數(shù)據(jù)顯示，其赤潮爆發(fā)期多集中在秋冬季節(jié)，且冬季雙殼貝類中AZAs的積累量[52]更高。地域上，愛爾蘭南部城市的毒素富集水平、頻率以及維持時間都較其他區(qū)域長(圖3)。由此可見，溫度是影響AZAs產(chǎn)毒藻生長的首要因素，低溫環(huán)境更適宜具刺環(huán)胺藻的生長，且分布呈現(xiàn)明顯的地域性特點(diǎn)。

全球多個國家已相繼制定AZAs的限量并開展日常監(jiān)控。主要采用的手段是定期采集貝類和產(chǎn)毒藻樣品，以分析產(chǎn)毒藻密度，設(shè)定分級預(yù)警方案，并以貝類基質(zhì)中的AZAs含量控制貝類的市場準(zhǔn)入。而AZAs的監(jiān)控中產(chǎn)毒藻和貝類毒素的監(jiān)控主要存在以下不足：首先，貝類累積的毒性水平與產(chǎn)毒藻的毒性大小、密度和攝食周期有直接關(guān)系，故僅以產(chǎn)毒藻的細(xì)胞密度作為安全等級評判指標(biāo)是不合理的；其次，以產(chǎn)毒藻密度為風(fēng)險等級評價指標(biāo)，而AZAs產(chǎn)毒藻的多樣性尚有待完善[45]，導(dǎo)致整體風(fēng)險性被遠(yuǎn)遠(yuǎn)低估；再次，目前監(jiān)控方式從采樣到出具檢測結(jié)果至少需要一周時間，時效性較差。為了更有效地監(jiān)控AZAs及其產(chǎn)毒藻，結(jié)合時間、空間因素，制定合理的監(jiān)控計劃是保障消費(fèi)者食用安全的有效前提。同時，需加快多種新型毒素監(jiān)控手段的研究和應(yīng)用，以應(yīng)對多種毒素產(chǎn)毒藻復(fù)合爆發(fā)和毒素伴生的污染現(xiàn)狀。

圖3 2002—2012年度愛爾蘭海域貽貝(Mytilus sp.)中AZAs(μg·g-1，以AZA1計)的地域與含量分布[29]Fig.3 Distribution and concentration of AZA toxins (μg·g-1，AZA1-eq.) in Irish mussels (Mytilus sp.) between 2002—2012[29]

3.3 生物體中蓄積代謝規(guī)律

AZAs在多種海洋生物如雙殼貝類、龍蝦以及魚體內(nèi)均可蓄積，沒有明顯的種屬趨向性。但有毒藻密度、毒性大小和暴露時間總體決定生物體內(nèi)毒素的蓄積水平。由于雙殼貝類的濾食特性，使產(chǎn)毒藻中的毒素蓄積入內(nèi)臟[18]等組織器官，也可以通過鰓將水體中溶解的毒素富集[52]，因此雙殼貝類中蓄積的毒素含量較其他水生生物更高，整體危害性更強(qiáng)。雙殼貝類對具刺環(huán)胺藻的蓄積代謝動力學(xué)研究的結(jié)果表明，貝類對于AZAs的響應(yīng)機(jī)制非常迅速，產(chǎn)毒藻暴露3 h后即檢出高比例后代謝產(chǎn)物，包括AZA17[53]、AZA19和AZA7～10，暴露6 h后貽貝體內(nèi)的毒素蓄積含量即超過限量值，最高達(dá)200 μg/kg[10]。AZAs在貝類體內(nèi)代謝速率較慢，一般在30 d的代謝周期，可產(chǎn)生多達(dá)30余種AZA反應(yīng)性代謝產(chǎn)物[10,23](圖4)，最高達(dá)毒素總量的50%，且其他代謝物(如AZA17和AZA19)的殘留程度與毒性強(qiáng)度[53]均強(qiáng)于AZA1。研究表明，不同貝類對AZAs的蓄積敏感性存在明顯差異[54]，主要表現(xiàn)為AZAs在紫貽貝中的蓄積能力最強(qiáng)，扇貝次之，而在牡蠣、蛤蜊中蓄積含量較低[14]。

圖4 貽貝中AZA代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化路徑[23]Fig.4 Transformation pathway of AZA metabolites in M.edulis[23]

不同于DSTs與PSTs具有組織差異性的特點(diǎn)[55]，AZAs在雙殼貝類各組織器官中的分布相對平均，除了常規(guī)在內(nèi)臟團(tuán)中的蓄積，在其他組織中也均有較高濃度的分布。如貽貝中AZAs在各組織間的分布為內(nèi)臟(60.6%)，鰓(12.0%)和其他可食組織(27.4%)[56]。AZAs在貽貝(M.edulis)與扇貝中的蓄積差異性主要表現(xiàn)為蓄積毒素的種類和各組織間的毒素分布不同。同一生長條件下，貽貝內(nèi)臟中蓄積的毒素為AZA1，而扇貝中主要為AZA2，僅有少量AZA1分布；貽貝其他組織中檢出20%～30%比例的毒素含量，包括AZA2、AZA3和AZA6，而扇貝其他組織中AZAs含量較低。雙殼貝類對產(chǎn)毒藻中毒素的蓄積和代謝能力受多方面因素影響，其中清濾率和濾過率[51]為主要影響因素。當(dāng)貝類體內(nèi)蓄積毒素超過限量后，貝類即通過降低濾食率和提高代謝速率的方式，以降低體內(nèi)的毒素含量。通常代謝產(chǎn)物的毒性顯著降低，但部分代謝產(chǎn)物(如AZA6、AZA17和AZA19[29])毒性較高，影響AZAs整體毒性水平[25]。

4 結(jié)語

目前，AZAs在貝類體內(nèi)的傳遞途徑、代謝動力學(xué)以及蓄積過程研究尚處于起步階段。一般來說，貝類毒素危害形成及風(fēng)險程度主要受兩個過程的影響。其一是外源過程，指的是貝類毒素由產(chǎn)毒藻經(jīng)食物鏈傳遞到生物組織過程，主要影響因素包括產(chǎn)毒藻(種類、密度和毒素含量)和生物品種(攝食選擇性、攝食能力等)，如同等條件下，貽貝對貝類毒素的蓄積能力遠(yuǎn)高于其他貝類。其二是內(nèi)源過程，貝類毒素作為一種外源性有毒物質(zhì)，刺激生物體的自我保護(hù)反應(yīng)，主要通過轉(zhuǎn)化、絡(luò)合及排出3個過程，將貝類毒素代謝成低毒或無毒化學(xué)結(jié)構(gòu)，完成生物的代謝解毒過程。目前多種AZAs被分離鑒定，但其毒力當(dāng)量因子仍未知[39]。因此，貝類毒素的危害程度和風(fēng)險大小總體取決于各種代謝產(chǎn)物的殘留能力、毒性大小、靶器官等，這也是國際社會對限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行制修訂中需重點(diǎn)參考的因素。

作為世界最大的貝類生產(chǎn)國家，貝類毒素污染已成為影響中國貝類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要問題，因此加強(qiáng)貝類毒素的監(jiān)控與監(jiān)管，將貝類毒素風(fēng)險控制在生產(chǎn)前端變得刻不容緩。隨著監(jiān)控與檢測技術(shù)的發(fā)展，AZAs產(chǎn)毒藻鑒別與AZAs代謝產(chǎn)物甄別方法已取得一定進(jìn)展。而貝類中的AZAs最高富集含量與產(chǎn)毒藻之間的時間空間分布關(guān)系仍不清楚，這也是目前單一產(chǎn)毒藻監(jiān)測方式不足以有效管控該毒素的關(guān)鍵。使用遙感監(jiān)測大規(guī)模的赤潮藻[21]；應(yīng)用新型分子探測技術(shù)分離鑒別產(chǎn)毒藻；優(yōu)化檢測更多藻毒素并且擁有更低的檢測限的最新ELISA試劑盒，逐步完善野外檢測用的快速篩選工具和傳感器設(shè)備，是提升中國貝類毒素研究能力和技術(shù)水平，確保貝類產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的根本保障。

[1] 周名江, 于仁成, 雷坤. 我國近海的富營養(yǎng)化及其生態(tài)環(huán)境問題: 中國海洋可持續(xù)發(fā)展的生態(tài)環(huán)境問題與政策研究[C]// 北京：中國環(huán)境與發(fā)展國際合作委員會， 2010.

[2] Li A, Ma J, Cao J, et al. Toxins in mussels (Mytilusgalloprovincialis) associated with diarrhetic shellfish poisoning episodes in China[J]. Toxicon, 2012, 60(3):420-425.

[3] Li A, Sun G, Qiu J, et al. Lipophilic shellfish toxins inDinophysiscaudatapicked cells and in shellfish from the East China Sea[J]. Environ Sci Pollut R, 2015, 22(4):3116-3126.

[4] Wu H, Yao J, Guo M, et al. Distribution of marine lipophilic toxins in shellfish products collected from the Chinese market[J]. Mar Drugs,2015,13(7):4281-4295.

[5] 劉仁沿, 梁玉波, 劉磊，等. 液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜方法研究中國沿海貝類中脂溶性藻毒素的種類結(jié)構(gòu)和分布規(guī)律[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2014, 23(8):1320-1326.

[6] EFSA. Opinion of the scientific panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on marine biotoxins in shellfish-azaspiracids[J]. EFSA J, 2008, 723:1-52.

[7] Furey A, O’Doherty S, O’Callaghan K, et al. Azaspiracid poisoning (AZP) toxins in shellfish: toxicological and health considerations[J]. Toxicon, 2010, 56(2):173-190.

[8] 譚志軍, 吳海燕, 郭萌萌，等. 脂溶性貝類毒素安全評價與檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2013, 20 (2):467-479.

[9] Salas R, Tillmann U, John U, et al. The role ofAzadiniumspinosum(Dinophyceae) in the production of azaspiracid shellfish poisoning in mussels[J]. Harmful Algae, 2011, 10(6):774-783.

[10] Jauffrais T, Marcaillou C, Herrenknecht C, et al. Azaspiracid accumulation, detoxification and biotransformation in blue mussels (Mytilusedulis) experimentally fedAzadiniumspinosum[J]. Toxicon, 2012, 60(4):582-595.

[11] Jiang T, Xu Y, Li Y, et al.Dinophysiscaudatagenerated lipophilic shellfish toxins in bivalves from the Nanji Islands, East China Sea[J]. Chin J Oceanol Limn, 2014, 32(1):130-139.

[12] Li X, Li Z, Chen J, et al. Detection, occurrence and monthly variations of typical lipophilic marine toxins associated with diarrhetic shellfish poisoning in the coastal seawater of Qingdao City, China[J]. Chemosphere, 2014, 111:560-567.

[13] Lin C, Liu Z, Tan C, et al. Contamination of commercially available seafood by key diarrhetic shellfish poisons along the coast of China[J]. Environ Sci Pollut R, 2015, 22(2):1545-1553.

[14] Krock B, Tillmann U, Witt M, et al. Azaspiracid variability ofAzadiniumpoporum(Dinophyceae) from the China Sea[J]. Harmful Algae, 2014, 36:22-28.

[15] Gu H, Luo Z, Krock B, et al. Morphology, phylogeny and azaspiracid profile ofAzadiniumpoporum(Dinophyceae) from the China Sea[J]. Harmful Algae, 2013, 21/22:64-75.

[16] 姚建華, 譚志軍, 周德慶，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測貝類產(chǎn)品中的原多甲藻酸貝類毒素[J]. 色譜, 2010, 28(4):363-367.

[17] 李愛峰, 韓剛, 于仁成. 原多甲藻酸貝類毒素的研究進(jìn)展[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2008, 15 (1):183-187.

[18] Jauffrais T, Kilcoyne J, Herrenknecht C, et al. Dissolved azaspiracids are absorbed and metabolized by blue mussels (Mytilusedulis)[J]. Toxicon, 2013, 65:81-89.

[19] Rehmann N, Hess P, Quilliam M A. Discovery of new analogs of the marine biotoxin azaspiracid in blue mussels (Mytilusedulis) by ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2008, 22(4):549-558.

[20] Kittler K, Preiss-Weigert A, These A. Identification strategy using combined mass spectrometric techniques for elucidation of Phase I and Phase IIinvitrometabolites of lipophilic marine biotoxins[J]. Anal Chem, 2010, 82(22):9329-9335.

[21] 吳海燕, 郭萌萌, 趙春霞，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法篩查原多甲藻酸毒素及其代謝產(chǎn)物[J]. 色譜, 2016, 34(4):401-406.

[22] Mccarron P, Kilcoyne J, Miles C O, et al. Formation of azaspiracids-3, -4, -6, and -9 via decarboxylation of carboxyazaspiracid metabolites from shellfish.[J]. J Agric Food Chem, 2009, 57(1):160-169.

[23] Kilcoyne J, McCarron P, Hess P, et al. Effects of heating on proportions of azaspiracids 1-10 in mussels (Mytilusedulis) and identification of carboxylated precursors for azaspiracids 5, 10, 13, and 15[J]. J Agric Food Chem, 2015, 63(51):10980-10987.

[24] Jauffrais T, Kilcoyne J, Séchet V, et al. Production and isolation of Azaspiracid-1 and -2 fromAzadiniumspinosumculture in pilot scale photobioreactors[J]. Mar Drugs, 2012,10(12):1360-1382.

[25] Toyofuku H. Joint FAO/WHO/IOC activities to provide scientific advice on marine biotoxins[J].Mar Pollut Bull, 2006,52(12):1735-1745.

[26] EFSA. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the european commission on marine biotoxins in shellfish-summary on regulated marine biotoxins[J]. EFSA J,2009,1306:1-23.

[27] FSAI. Risk assessment of azaspiracids in shellfish. A report of the scientific comittee of the food safety authority of Ireland(FSAI)[M]. Dublin, Ireland: Food Safety Authority of Ireland, 2006.

[28] FAO. Report of the Joint FAO/IOC/WHO ad hoc expert consultation on biotoxins in molluscan bivalves[R]. Rome, Italy: Food and Agriculture Organization, 2005.

[29] Hess P, Twiner M J, Kilcoyne J, et al. Azaspiracid Toxins: toxicological profile[M]//Gopalakrishnakone P, Haddad V, Tubaro A, et al. Marine and freshwater toxins. Berlin:Springer Netherlands, 2016:169-191.

[30] Pelin M, Sosa S, Brovedani V, et al. In vitro effects of three azaspiracid analogues on hepatocytes[J]. Toxicon, 2016, 116:85-86.

[31] Chevallier O P, Graham S F, Alonso E, et al. New insights into the causes of human illness due to consumption of azaspiracid contaminated shellfish[J]. Sci Rep(UK),2015,5:9818-9826.

[32] Doerr B, O’Halloran J, O’Brien N, et al. Investigation of the genotoxic potential of the marine biotoxins azaspiracid 1-3[J]. Toxicon, 2016, 121:61-69.

[33] Aune T, Espenes A, Aasen J A, et al. Study of possible combined toxic effects of azaspiracid-1 and okadaic acid in mice via the oral route[J]. Toxicon, 2012, 60(5):895-906.

[34] Ferron P J, Dumazeau K, Beaulieu J F, et al. Combined effects of lipophilic phycotoxins (okadaic Acid, azapsiracid-1 and yessotoxin) on human intestinal cells models[J]. Toxins (Basel), 2016, 8(2):50-63.

[35] Samdal I A, Lovberg K E, Briggs L R, et al. Development of an ELISA for the detection of azaspiracids[J]. J Agric Food Chem, 2015, 63(35):7855-7861.

[36] European Reference Laboratory for Marine Biotoxins. Work Programme for the European Reference Laboratory for Marine Biotoxins[R]. Spain: European Union Reference Laboratory for Marine Biotoxins, 2015.

[37] Rossi R, Dell Aversano C, Krock B, et al. MediterraneanAzadiniumdexteroporum(Dinophyceae) produces six novel azaspiracids and azaspiracid-35: a structural study by a multi-platform mass spectrometry approach[J]. Anal Bioanal Chem, 2017, 409(4):1121-1134.

[38] Wu H, Guo M, Tan Z, et al. Liquid chromatography quadrupole linear ion trap mass spectrometry for multiclass screening and identification of lipophilic marine biotoxins in bivalve mollusks[J]. J Chromatogr A, 2014, 1358:172-180.

[39] Botana L M, Hess P, Munday R, et al. Derivation of toxicity equivalency factors for marine biotoxins associated with bivalve molluscs[J]. Trends Food Sci Tech, 2017, 59:15-24.

[40] 方蘭云, 姚潯平, 王立，等. 固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雙殼貝類中扇貝毒素和原多甲藻酸[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2014, 24 (16):2316-2320.

[41] 韓深, 劉鑫, 李建輝，等. 超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證食用貝類中多種原多甲藻酸貝類毒素[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(4):116-121.

[42] Canas I R, O’Callaghan K, Moroney C, et al. The development of a rapid method for the isolation of four azaspiracids for use as reference materials for quantitative LC-MS-MS methods[J]. Anal Bioanal Chem, 2010, 398(3):1477-1491.

[43] Krock B, Tillmann U, Potvin é, et al. Structure elucidation and in vitro toxicity of new azaspiracids isolated from the marine dinoflagellateAzadiniumpoporum[J]. Mar Drugs, 2015, 13(11):6687-6702.

[44] Toebe K, Joshi A, Messtorff P, et al. Molecular discrimination of taxa within the dinoflagellate genusAzadinium, the source of azaspiracid toxins[J]. J Plankton Res, 2013, 35(1):225-230.

[45] Luo Z, Krock B, Mertens K N, et al. Morphology, molecular phylogeny and azaspiracid profile ofAzadiniumpoporum(Dinophyceae) from the Gulf of Mexico[J]. Harmful Algae, 2016, 55:56-65.

[46] Urban T, Salas R, Jauffrais T, et al. AZA: the producing organisms-biology and trophic transfer[M]//Botana L M. Seafood and freshwater toxins: pharmacology, physiology, and detection. Boca Raton:CRC Press, 2014:773-798.

[47] Tillmann U, Gottschling M, Nézan E, et al. First record ofAzadiniumdexteroporumandAmphidomalanguida(Amphidomataceae, Dinophyceae) from the Irminger Sea off Iceland[J]. Mar Biodivers Rec,2015,8(e142):1-10.

[48] Tillmann U, Jaén D, Fernández L, et al.Amphidomalanguida(Amphidomatacea, Dinophyceae) with a novel azaspiracid toxin profile identified as the cause of molluscan[J]. Harmful Algae, 2017, 62:113-126.

[49] Jauffrais T, Séchet V, Herrenknecht C, et al. Effect of environmental and nutritional factors on growth and azaspiracid production of the dinoflagellate Azadinium spinosum[J]. Harmful Algae, 2013, 27:138-148.

[50] Li A, Jiang B, Chen H, et al. Growth and toxin production ofAzadiniumpoporumstrains in batch cultures under different nutrient conditions[J]. Ecotox Environ Safe, 2016, 127:117-126.

[51] 竇勇, 高金偉, 時曉婷，等. 2000—2013年中國南部近海赤潮發(fā)生規(guī)律及影響因素研究[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 2015, 36(3):31-37.

[52] Jauffrais T, Kilcoyne J, Herrenknecht C, et al. Dissolved azaspiracids are absorbed and metabolized by blue mussels (Mytilusedulis)[J]. Toxicon, 2013, 65:81-89.

[53] Jauffrais T, Contreras A, Herrenknecht C, et al. Effect ofAzadiniumspinosumon the feeding behaviour and azaspiracid accumulation ofMytilusedulis[J]. Aquat Toxicol, 2012, 124-125:179-187.

[54] Lopez-Rivera A, O’Callaghan K, Moriarty M, et al. First evidence of azaspiracids (AZAs): a family of lipophilic polyether marine toxins in scallops (Argopectenpurpuratus) and mussels (Mytiluschilensis) collected in two regions of Chile[J]. Toxicon, 2010, 55(4):692-701.

[55] Blanco J, Franco J M. PSP detoxification kinetics in the mussel Mytilus galloprovincialis. One- and two-compartment models and the effect of some environmental variables[J]. Mar Ecol Prog Ser, 1997, 158 (1):165-175.

[56] O’Driscoll D, Skrabakova Z, James K J. Confirmation of extensive natural distribution of azaspiracids in the tissue compartments of mussels (Mytilusedulis)[J]. Toxicon, 2014, 92 (92):123-128.