梁晶晶，徐瀟穎，丁宇琦，陳萬勤，劉 柱，羅金文

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310052)

喹諾酮類藥物是一種具有4-喹諾酮共同基本母核的人工合成抗菌藥，可通過直接作用于細(xì)菌的核，抑制其DNA旋轉(zhuǎn)酶，破壞其代謝和繁殖，從而迅速殺滅細(xì)菌，具有抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人類的多種感染性疾病的預(yù)防和治療[1]。但該類藥物對(duì)消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、骨骼等有一定毒性且易產(chǎn)生耐藥性[2-3]，如對(duì)動(dòng)物長期使用，會(huì)造成動(dòng)物性食品中喹諾酮藥物殘留，同時(shí)對(duì)食用者的健康造成危害。近年來，部分水產(chǎn)品養(yǎng)殖戶為提高產(chǎn)量，常在養(yǎng)殖過程中亂用、濫用此類藥物，以致水產(chǎn)品安全事件頻發(fā)。為確保消費(fèi)者的安全，我國及歐盟等組織均對(duì)水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的使用情況及殘留限量做了嚴(yán)格規(guī)定。如我國規(guī)定牛、雞、豬、羊、兔等動(dòng)物的肌肉、脂肪、肝、腎中達(dá)氟沙星、二氟沙星、 恩諾沙星(環(huán)丙沙星與恩諾沙星之和)、沙拉沙星等喹諾酮類獸藥的最高殘留限量為0.01～1.9 mg/kg[4]。

喹諾酮類藥物殘留問題已越來越引起人們的重視，其檢測(cè)方法主要有微生物法[5]、酶聯(lián)免疫法[6-7]、液相色譜法[8-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[10-12]。但微生物法的檢測(cè)限過高，特異性不強(qiáng)；酶聯(lián)免疫法屬于半定量篩查方法，易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象；液相色譜法靈敏度低，抗干擾能力弱,定性效果差，且不適合多殘留同時(shí)分析。近年來，液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)由于兼具液相色譜的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性特點(diǎn)，正逐漸成為獸藥殘留分析的有效手段。但由于水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，通常含有較多的蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂，在樣品預(yù)處理過程中，采用沉淀和離心去除蛋白的同時(shí)，脂肪和磷脂也被共提取出?，F(xiàn)有的前處理方法通常采用正己烷脫脂、SPE固相萃取柱、離子交換柱或用其他反向吸附劑(如硅膠、C18等)從組織提取物中去除脂肪，以消除樣品基質(zhì)的干擾。但這些前處理方法普遍存在步驟繁瑣、測(cè)定時(shí)間長等缺點(diǎn)，且無法去除磷脂。

PRiME HLB是一種最新型的固相萃取柱，是基于“N-乙烯吡咯烷酮二乙烯基苯聚合物”填料的反相復(fù)合填料，對(duì)動(dòng)物源性食品中的蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂等物質(zhì)具有特異性的吸附能力，且無需活化與平衡，樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取后，可直接上樣，操作極其簡便，不會(huì)出現(xiàn)堵柱情況。而目前常用的SPE凈化方式(HLB、WAX等)均需經(jīng)活化、平衡、上樣、淋洗和洗脫等多個(gè)步驟，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。PRiME HLB采用最簡單的過濾式凈化方式，可將凈化速度提高40%，只需3個(gè)步驟即可完成整個(gè)樣品制備過程，操作簡單、省時(shí)快速，凈化后可以去除動(dòng)物源性食品中蛋白、脂肪和磷脂等95%以上的基質(zhì)干擾物，確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。目前國內(nèi)外僅有少量將此技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品中磺胺類和青霉素類藥物殘留檢測(cè)的報(bào)道[13-14]，但未見其用于水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。本研究以明蝦和鱸魚為研究對(duì)象，采用PRiME HLB樣品凈化技術(shù)，以超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)為分析手段，同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中19種喹諾酮類藥物的殘留量。該方法簡便快速，易于操作，為水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留的測(cè)定提供了新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XevoTMTQ-S液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；氮?dú)獯蹈蓛x(Biotage公司)；渦旋混合器(上海琪特公司)；Multiduge X1臺(tái)式離心機(jī)(美國Thermo公司)；Ks 4000 Ic低溫?fù)u床(德國IKA公司)；超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Fluka公司)；乙酸銨(質(zhì)譜純，美國Sigma公司)；Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL，美國Waters公司)。

實(shí)驗(yàn)所用19種獸藥的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH，喹諾酮內(nèi)標(biāo)混合液購自北京振翔科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液分別精密稱取19種喹諾酮類藥物10 mg(精確至0.01 mg)，用乙腈溶解并定容至20 mL，配成500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃下存放。

1.2.2混合對(duì)照品中間液精密移取0.2 mL各對(duì)照品儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容，精密移取1.0 mL至50 mL容量瓶中，用乙腈定容，即得200 μg/L的混合對(duì)照品中間液，于4 ℃下保存。

1.2.3同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液直接購買10 mg/L的混合同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(諾氟沙星-D5、萘啶酸-D5、培氟沙星-D5、恩諾沙星-D5、雙氟沙星-D3)。

1.2.4混合同位素內(nèi)標(biāo)中間液精密移取0.1 mL混合同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈定容至5.0 mL，即得200 μg/L的混合同位素內(nèi)標(biāo)中間液，于4 ℃下避光保存。

1.2.5混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密移取混合對(duì)照品中間溶液和混合同位素內(nèi)標(biāo)中間液適量(標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物濃度應(yīng)與樣品待測(cè)液中一致)，用空白樣品基質(zhì)溶液配成0.2～20 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取樣品2.0 g于50 mL離心管中，精確加入同位素內(nèi)標(biāo)混合液0.2 mL。加入9.8 mL 80%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)，振蕩30 min，再以20 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液加至PRiME HLB 固相萃取柱，保持1滴/s的流速，待過完后加入2 mL提取液沖洗小柱，收集所有流出液于45 ℃下氮吹至小于0.7 mL，殘留液用純水定容至1.00 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待上機(jī)測(cè)試。

空白樣品基質(zhì)溶液的制備：取不含喹諾酮類藥物的空白樣品，除不加內(nèi)標(biāo)工作液外，同上處理，制得空白樣品基質(zhì)溶液。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)(A)和甲醇(B)。梯度洗脫程序：0～0.25 min，2%B；0.25～11.25 min，2%～100%B；11.25～13.00 min，100%B；13.00～13.10 min，100%～2%B；13.10～17.00 min，2%B。

1.4.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；源電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h；19種待測(cè)化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM監(jiān)測(cè)模式下19種藥物及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜條件Table 1 Mass conditions of 19 drugs and internal standard under MRM mode

*quantitation ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇柱效高、穩(wěn)定性好、保留能力強(qiáng)的Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)，比較了乙腈-水和甲醇-水兩種流動(dòng)相對(duì)19種待測(cè)物的分離效果。結(jié)果表明，以甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，分離度和靈敏度明顯優(yōu)于乙腈-水流動(dòng)相。為進(jìn)一步提高待測(cè)化合物的離子化效率，增加靈敏度，結(jié)合相關(guān)報(bào)道[15],在流動(dòng)相中添加對(duì)正離子有增強(qiáng)作用的甲酸和乙酸銨，通過比較不同甲酸濃度和乙酸銨濃度對(duì)靈敏度及峰形的影響，最終確定流動(dòng)相為甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)；再優(yōu)化流動(dòng)相比例，最終選擇線性梯度洗脫。 上述優(yōu)化條件下目標(biāo)物分離度較好、保留時(shí)間適中。

通過一級(jí)質(zhì)譜掃描分析0.5 mg/L的19種喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)溶液和同位素內(nèi)標(biāo)液，得到各目標(biāo)物的分子離子，并對(duì)分子離子進(jìn)行裂解，得到二級(jí)碎片信息，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)，使各化合物的響應(yīng)最大化。優(yōu)化后的質(zhì)譜監(jiān)測(cè)參數(shù)見表1。在選定的色譜和質(zhì)譜條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的定量離子色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的定量離子色譜圖Fig.1 Quantitative ion chromatograms of mixed standards

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

常用的抗生素提取溶劑有乙腈、乙腈-水、甲醇和甲醇-水等，水產(chǎn)品中含有較多的蛋白質(zhì)和脂類等大分子物質(zhì)，采用甲醇或甲醇-水溶液提取，提取液較混濁，樣品凈化困難，且回收率偏低。乙腈具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，并且其帶出的弱極性成分少，質(zhì)譜響應(yīng)高、基質(zhì)干擾小，因而選用乙腈作為主要提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)首先考察了60%乙腈水、70%乙腈水、80%乙腈水和90%乙腈水4種不同配比提取劑的提取效果，結(jié)果表明，用80%乙腈水作為提取劑時(shí)各化合物的回收率較高。分析原因，經(jīng)60%乙腈水和70%乙腈水提取后的提取液較混濁，基質(zhì)效應(yīng)大，經(jīng)80%乙腈水和90%乙腈水提取后的提取液較澄清，蛋白基本沉淀，但90%乙腈水中乙腈比例過高，使蛋白質(zhì)快速凝結(jié)成團(tuán)，而凝結(jié)的蛋白質(zhì)阻礙了提取液進(jìn)入內(nèi)部發(fā)生作用，添加一定比例的水可起到分散作用。

由于喹諾酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和叔胺基，具有酸堿兩性，易溶于酸性或堿性溶液，在有機(jī)溶劑中添加一定比例的酸或堿提取可顯著提高回收率[16-17]。考察了80%乙腈水和80%乙腈水(含0.1%甲酸)2種提取劑對(duì)回收率的影響，結(jié)果顯示酸性提取劑可獲得更優(yōu)的回收率。因此，最終確定提取溶劑為80%乙腈水(含0.1%甲酸)。

2.3 離心條件的優(yōu)化

樣品經(jīng)提取劑提取后，需進(jìn)行離心分離得到澄清的上清液，以便進(jìn)行后續(xù)的凈化處理。本實(shí)驗(yàn)對(duì)離心條件進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，經(jīng)普通離心機(jī)(<5 000 r/min)作用后，提取液仍渾濁，不利于凈化，隨著離心力的加大，提取液逐漸澄清，經(jīng)15 000～20 000 r/min離心分離后，上清液基本澄清，過PRiME HLB時(shí)較通暢。水產(chǎn)品中含有較多的蛋白質(zhì)和脂肪，低速離心只能分離普通的固體懸浮顆粒，而高速離心能夠加快液體中顆粒的沉降速度，高速分離懸浮介質(zhì)中較小的顆粒物質(zhì)，從而達(dá)到理想的分離效果。本研究確定的離心速率為20 000 r/min，離心時(shí)間為5 min。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，考察了Oasis PRiME HLB(200 mg，6 mL)的柱容量，比較了不同上樣體積的樣品凈化程度。結(jié)果表明，上樣液中樣品量≤0.5 g時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)小，凈化效果明顯，而樣品量為0.5～1.0 g時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)逐漸增加，說明樣品量為0.5 g時(shí)該柱對(duì)雜質(zhì)的吸附能力接近飽和，過多的上樣體積會(huì)造成部分雜質(zhì)無法吸附，隨目標(biāo)化合物共流出，導(dǎo)致凈化效果不理想。因此，本實(shí)驗(yàn)確定上樣體積為2 mL(含0.4 g樣品量)。

2.5 線性關(guān)系、檢出限、定量下限與加標(biāo)回收率

對(duì)陰性魚肉樣品和蝦肉樣品分別進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量為5、10、20 μg/kg，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行，分別計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，并根據(jù)信噪比，以及質(zhì)譜本身的穩(wěn)定性、不同儀器間的差異和方法的適用性，確定本方法的檢出限(LOD)與定量下限(LOQ)，結(jié)果見表2～3。結(jié)果表明，魚肉中各目標(biāo)化合物的回收率為83.4%～119.9%，RSD為 2.6%～14.9%，檢出限為0.5 μg/kg；蝦肉中各目標(biāo)化合物的回收率為72.1%～118.3%，RSD為2.4%～15.6%，檢出限為0.5 μg/kg。該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可以滿足水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的檢測(cè)要求。

表2 魚肉中喹諾酮類藥物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率和精密度Table 2 Linear equations,correlation coefficient(r),limit of detection,limit of quantitation，recovery and precision of quinolone antibacterials in fish

表3 蝦肉中喹諾酮類藥物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率和精密度Table 3 Linear equations,correlation coefficient(r) ,limit of detection,limit of quantitation，recovery and precision of quinolone antibacterials in shrimp meat

2.6 實(shí)際樣品的分析

采用本方法對(duì)30份市售水產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在1批黑魚中檢出氧氟沙星(含量93.8 μg/kg)，1批黃鱔中檢出諾氟沙星(含量260 μg/kg)，陽性樣品的TIC色譜圖見圖2。根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告第2292號(hào)，我國將停止在食用性動(dòng)物中使用氧氟沙星和諾氟沙星等獸藥，本結(jié)果說明在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中亂用獸藥現(xiàn)象依然嚴(yán)重，值得引起有關(guān)部門的重視。

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用PRiME HLB凈化技術(shù)，以超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法建立了水產(chǎn)品中19種喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)方法。通過對(duì)水產(chǎn)品中的魚肉和蝦肉進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，證明各組分在1～20 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為72.1%～119.9%，RSD為2.4%～15.6%。本方法適用于水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)，具有準(zhǔn)確、快速、簡便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

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