，，，，

(1.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 ?？?570206； 2.國(guó)家羅非魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系?？诰C合試驗(yàn)站，海南 ?？?70100)

海南省羅非魚養(yǎng)殖開(kāi)始于1956年，是國(guó)內(nèi)極早開(kāi)始養(yǎng)殖羅非魚的省份之一，養(yǎng)殖品種從最初的莫桑比克羅非魚到20世紀(jì)90年代的奧尼羅非魚、奧利亞羅非魚，再到現(xiàn)在的雜交品種吉富羅非魚等，尤其進(jìn)入2000年以后，海南省羅非魚產(chǎn)業(yè)得到飛速發(fā)展，產(chǎn)量從1999年的5.8×104t增加到2010年的27×104t，而后，每年產(chǎn)量基本維持穩(wěn)定[1]。

微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度多態(tài)性、符合孟德?tīng)栠z傳、在基因組中廣泛分布等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物種質(zhì)鑒定和遺傳結(jié)構(gòu)多樣性分析[2-6]。

近年來(lái)，多位學(xué)者已將微生物標(biāo)記應(yīng)用于許多與羅非魚相關(guān)的研究中，如Boris 等[7]利用微生物標(biāo)記分析了6個(gè)紅羅非魚群體的遺傳變異，評(píng)估了紅羅非魚的育種計(jì)劃；強(qiáng)俊等[8]研究吉富羅非魚與奧利亞羅非魚自繁與雜交 F1代的遺傳特性與抗病力，發(fā)現(xiàn)雜交后代的抗病力明顯提高；李建林等[9]發(fā)現(xiàn) 2個(gè)吉富羅非魚群體的遺傳多樣性水平較高，存在雜合子過(guò)剩現(xiàn)象，且具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，選育空間大。本研究擬通過(guò)篩選羅非魚微衛(wèi)星標(biāo)記，獲得海南省6個(gè)養(yǎng)殖羅非魚[尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)、莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambica)、紅羅非魚(Red tilapia，Oreochromisniloticus×O.mossambica)、泰奧羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)、吉富羅非魚(GIFT strain ofOreochromisniloticus)]群體的等位基因，并用軟件Popgen3.2對(duì)每一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因的遺傳參數(shù)進(jìn)行分析；此外根據(jù)各群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離，采用MEGA3.0鄰接法(NJ)構(gòu)建6個(gè)羅非魚群體的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以分析群體間的親緣關(guān)系。加之現(xiàn)在羅非魚種質(zhì)資源退化嚴(yán)重，造成魚苗成活率下降，極大影響了產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因此，研究羅非魚群體遺傳差異勢(shì)在必行，亦可為選育優(yōu)良的羅非魚品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海南省6個(gè)羅非魚(尼羅羅非魚、奧尼羅非魚、莫桑比克羅非魚、紅羅非魚、泰奧羅非魚、吉富羅非魚)群體采集自海南省?？谑泻臀牟袃蓚€(gè)地區(qū)，其中尼羅羅非魚、奧尼羅非魚等5個(gè)群體采集的規(guī)格約500 g，莫桑比克羅非魚采集規(guī)格為50～100 g，每個(gè)群體隨機(jī)抽取30尾，分別采集其尾鰭樣品，保存于無(wú)水乙醇中。

1.2 基因組DNA的提取

采用基因組DNA提取試劑盒(天根生物有限公司)提取尾鰭基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提DNA的質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星引物的篩選

在美國(guó)漢普郡大學(xué)Hubbard基因研究中心網(wǎng)站數(shù)據(jù)(http：//hcgs.unh.edu/)和Carleton等報(bào)道的羅非魚微衛(wèi)星引物序列中選取20對(duì)微衛(wèi)星引物，對(duì)海南養(yǎng)殖的6個(gè)羅非魚群體(尼羅羅非魚、奧尼羅非魚、莫桑比克羅非魚、紅羅非魚、泰奧羅非魚、吉富羅非魚)的DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列由艾基生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 微衛(wèi)星擴(kuò)增引物序列

續(xù)表1

1.4 PCR擴(kuò)增體系及程序

反應(yīng)總體積為20μL，其中10×PCR buffer 2.0 μL；MgCl2(25 mmol·L-1)0.8 μL；dNTP(10 mmol·L-1each)0.3 μL；Taq Polymerase(5 U·μL-1)0.2 μL；上下游引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL；DNA模板(40～100 ng·μL-1)0.3 μL；滅菌雙蒸水14.4 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；50～60℃退火30 s；72℃延伸45 s；共25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。根據(jù)擴(kuò)增效果調(diào)節(jié)MgCl2濃度和退火溫度，MgCl2濃度為0.8～1.2 mmol·L-1。

1.5 電泳和銀染檢測(cè)

利用濃度為10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(每100 mL中ddH2O 35.0 mL；30% Acylamide/Bis 4.0 mL；10×TBE 9.33 mL；20% AP 3.27 mL；TEMED 117 μL)對(duì)微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，PCR產(chǎn)物上樣量均為4 μL，DNA Marker上樣量為0.5 μL， 200 V電泳2 h左右。然后進(jìn)行銀染3 min，洗滌后進(jìn)行顯色，記錄電泳結(jié)果。

1.6 等位基因統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

對(duì)銀染后得到的譜帶進(jìn)行整理并用軟件Popgen3.2進(jìn)行分析，對(duì)每一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、Shannon’s 多態(tài)性指數(shù)等遺傳參數(shù)；此外根據(jù)各群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離，采用MEGA3.0鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建6個(gè)羅非魚群體的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，以分析群體間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星電泳及等位基因分析結(jié)果

20對(duì)微衛(wèi)星引物能夠在6個(gè)羅非魚群體樣本(尼羅羅非魚、奧尼羅非魚、莫桑比克羅非魚、紅羅非魚、泰奧羅非魚、吉富羅非魚)中穩(wěn)定重復(fù)地?cái)U(kuò)增出特異片段，非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳部分結(jié)果見(jiàn)圖1。20對(duì)微衛(wèi)星引物共擴(kuò)增出68個(gè)等位基因，各基因座的等位基因?yàn)?～5個(gè)，大小為100～300 bp，其中莫桑比克羅非魚平均有效等位基因數(shù)量最高(2.26)，奧尼羅非魚平均等位基因數(shù)量最低(1.99)，表2為微衛(wèi)星引物的擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

注：1～27為紅羅非魚；28～57為吉富羅非魚；58～85為莫桑比克羅非魚；86～112為泰奧羅非魚；113～141為尼羅羅非魚；142～170為奧尼羅非魚。

Notes：1～27 was red tilapia，Oreochromisniloticus×O.mossambica；28～57 was GIFT strain ofOreochromisniloticus；58～85 wasOreochromismossambica；86～112 was Thailand strain ofOreochromisniloticus×O.aureus；113～141 wasOreochromisniloticus；142～170 wasOreochromisniloticus×O.aureus.

表2 6個(gè)羅非魚群體微衛(wèi)星鑒定位點(diǎn)的等位基因數(shù)目

續(xù)表2

2.2 6個(gè)羅非魚群體的遺傳參數(shù)分析結(jié)果

表3為20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在6個(gè)羅非魚群體的遺傳參數(shù)分析結(jié)果，平均觀測(cè)雜合度在莫桑比克羅非魚中最高(0.75)，在尼羅羅非魚中最低(0.57)；平均期望雜合度和多態(tài)信息含量在莫桑比克羅非魚中最高(0.53，0.44)，在奧尼羅非魚中最低(0.47，0.38)。Shannon’s 多樣性指數(shù)在莫桑比克羅非魚中最高(0.85)，其次分別為泰奧羅非魚(0.83)、尼羅羅非魚(0.80)和吉富羅非魚(0.80)，而奧尼羅非魚(0.72)最低。

表3 20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在6個(gè)羅非魚群體的遺傳參數(shù)

2.3 6個(gè)羅非魚群體的遺傳距離

遺傳距離和遺傳相似度分析結(jié)果表明：尼羅羅非魚與泰奧羅非魚的遺傳距離最大(0.21)，遺傳相似系數(shù)最小(0.81)，說(shuō)明兩者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；吉富羅非魚和尼羅羅非魚的遺傳距離最小(0.08)，遺傳相似系數(shù)最大(0.93)，說(shuō)明兩者親緣關(guān)系最近(表4)。

表4 6個(gè)羅非魚群體間遺傳距離(左下部分)和遺傳相似度(右上部分)

注：1為奧尼羅非魚；2為尼羅羅非魚； 3為莫桑比克羅非魚； 4為紅羅非魚；5為泰奧羅非魚； 6為吉富羅非魚； *為缺省。

Notes：1 wasOreochromisniloticus×O.aureus；2 wasOreochromisniloticu；3 wasOreochromismossambica；4 was red tilapia，Oreochromisniloticus×O.mossambica；5 was Thailand strain ofOreochromisniloticus×O.aureus；6 was GIFT strain ofOreochromisniloticus；* was default.

利用群體間的遺傳距離矩陣，在MEGA3.0 軟件中采用UPGMA 法繪制6個(gè)羅非魚群體的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，吉富羅非魚是尼羅羅非魚中的一個(gè)品系，它們屬于同一種，并聚成一支；紅羅非魚和莫桑比克羅非魚聚為一支，再與吉富羅非魚和尼羅羅非魚聚為一大支，奧尼羅非魚和泰奧羅非魚聚為一支(圖2)。

3 討論

本研究應(yīng)用的微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)是較理想的品種鑒定方法，不僅可準(zhǔn)確鑒定同一群體中親本之間、親本與雜交種之間的不同種，也可鑒別不同雜交組合的雜種子代，目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于研究物種分類、進(jìn)化及遺傳結(jié)構(gòu)，其中Ho、He和PIC等是衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo)。

Ho是衡量種群遺傳變異程度的重要參數(shù)，與群體遺傳結(jié)構(gòu)變異程度呈正相關(guān)，且Ho越高，遺傳多樣性越豐富[10]。本研究中，6個(gè)羅非魚群體的Ho分別為0.62、0.57、0.75、0.70、0.61和0.59，略高于Dewoody的研究結(jié)果[11]，研究結(jié)果表明，6個(gè)養(yǎng)殖羅非魚群體的遺傳多樣性為中等水平，其中奧尼羅非魚和紅羅非遺傳多樣性指數(shù)較低，說(shuō)明其存在種質(zhì)退化現(xiàn)象。紅羅非魚雖由尼羅羅非魚和莫桑比克羅非魚雜交選育而來(lái)，但多態(tài)性指數(shù)卻低于莫桑比克羅非魚群體，因此可根據(jù)本文的研究結(jié)果，對(duì)其親本家系進(jìn)行擴(kuò)充，擴(kuò)大繁殖群體規(guī)模，提高品種遺傳多樣性，進(jìn)而提高該羅非魚品種的種質(zhì)質(zhì)量。泰奧羅非魚與奧尼羅非魚都為尼羅羅非魚與奧利亞羅非魚的雜交種，但其遺傳多樣性差異較大，這可能主要源于親本中本地尼羅羅非魚與泰國(guó)品系的尼羅羅非魚遺傳多樣性的差異。

PIC是衡量微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性水平的重要指標(biāo)。一般情況，當(dāng)PIC<0.25時(shí)微衛(wèi)星位點(diǎn)低度多態(tài)性，當(dāng)0.250.50時(shí)微衛(wèi)星位點(diǎn)高度多態(tài)性[12]。本研究利用20對(duì)微衛(wèi)星對(duì)6個(gè)羅非魚群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析，6個(gè)群體的平均PIC為0.41，其中莫桑比克羅非魚(0.44)最高，其次為泰奧羅非魚(0.43)、吉富羅非魚(0.42)和尼羅羅非魚(0.41)，而奧尼羅非魚(0.38)最低。魯雙慶等[13]得出我國(guó)4個(gè)鯽魚養(yǎng)殖群體的平均PIC為0.584，認(rèn)為4個(gè)鯽魚群體的遺傳多樣性較高。梁利群等[14]得出烏蘇里江野生哲羅魚平均PIC為0.41，認(rèn)為烏蘇里江哲羅魚的遺傳多樣性程度處于中等偏下水平。張庭等[15]得出4個(gè)奧利亞羅非魚群體平均PIC為0.28，認(rèn)為4個(gè)奧利亞羅非魚群體的遺傳多樣性程度處于中等偏下水平。本次試驗(yàn)6個(gè)羅非魚群體PIC值與上述報(bào)道相近，說(shuō)明6個(gè)羅非魚群體的遺傳多樣性處于中等偏下水平。

根據(jù)微衛(wèi)星分析結(jié)果建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示吉富羅非魚和尼羅羅非魚的親緣關(guān)系最近，其次是與莫桑比克羅非魚和紅羅非魚，而與泰奧羅非魚和奧尼羅非魚親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。此結(jié)果與群體的來(lái)源和種屬關(guān)系相符，也說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所選用的微衛(wèi)星位點(diǎn)可用于分析6個(gè)羅非魚群體間的親緣關(guān)系。

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