王 巍 馬海蘭

(廣西桂平市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，桂平市 537200)

【提要】 人類輔助生殖技術(shù)在臨床的成功應(yīng)用給越來越多的不孕癥夫婦帶來福音。然而，在體外受精聯(lián)合胚胎移植輔助技術(shù)治療過程中仍有50%左右治療周期出現(xiàn)反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure，RIF)，原因與子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)。如何改善子宮內(nèi)膜容受性，提高人類輔助生殖技術(shù)的有效性是目前研究的熱點(diǎn)。近年有研究表明：血小板富集血漿(platelet-rich plasma，PRP)宮腔灌注治療具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖，改善薄型子宮內(nèi)膜患者臨床妊娠結(jié)局的作用，可作為提高RIF患者臨床妊娠率的一種安全、經(jīng)濟(jì)、有效方法。

不孕癥正成為一種能夠造成全球性影響的人類生殖健康問題。在全世界育齡婦女中，不孕癥的發(fā)病率達(dá)8.0%～10.0%，并呈逐年上升趨勢[1]。隨著輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，體外受精/胞質(zhì)內(nèi)單精子注射-胚胎移植術(shù)(IVF/ICSI-ET)已成為治療不孕癥的重要助孕方式，但胚胎反復(fù)種植失敗(RIF)的問題也非常嚴(yán)峻。借助適當(dāng)?shù)呐R床干預(yù)，改善、提升RIF患者的臨床妊娠率，是現(xiàn)代生殖醫(yī)學(xué)研究工作的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。有研究報(bào)告[2-3]顯示，在IVF/ICSI-ET種植失敗患者中，其宮腔組織及子宮內(nèi)膜組織的病理性異常發(fā)生率為84.38%，包括子宮內(nèi)膜發(fā)育不良、宮腔粘連、宮腔畸形等。將胚胎植入到具備良好形態(tài)特征和穩(wěn)定生理狀態(tài)的宮腔內(nèi)，是一個(gè)同時(shí)涉及局部生物活性因子因素、免疫因素、解剖因素以及生化因素等的復(fù)雜過程。研究發(fā)現(xiàn)，血小板富集血漿(PRP)的血小板含量平均為全血的4～5倍，激活后的血小板可分泌多種生長因子，這些生長因子可有效改善子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床妊娠率[4]。本文對自體PRP宮腔灌注治療在RIF患者中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 RIF與子宮內(nèi)膜容受性

RIF是指經(jīng)過反復(fù)胚胎移植而卻未能達(dá)到臨床妊娠。Meta分析建議將RIF定義為連續(xù)2個(gè)IVF/ICSI或FET周期移植卵裂期胚胎累計(jì)數(shù)≥4或囊胚數(shù)≥2而未獲得臨床妊娠，而且所有移植胚胎均有較好的質(zhì)量及適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段[5]。RIF受多種因素的影響，包括子宮內(nèi)膜容受性、超促排卵藥物方案、胚胎發(fā)育異?；蛉旧w異常以及移植技術(shù)等。RIF的發(fā)生尚未得到明確的闡述，特別是對于移植了優(yōu)質(zhì)胚胎而出現(xiàn)反復(fù)植入失敗更令人不解。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜組織處于一種能夠支持受精胚胎完成黏附、侵入、定植等生理過程，且能夠因子宮內(nèi)膜組織間質(zhì)改變，而支持胚胎順利實(shí)現(xiàn)著床的狀態(tài)，與子宮內(nèi)膜厚度、血流情況、內(nèi)膜微環(huán)境以及種植窗胞飲突的數(shù)量等相關(guān)。子宮內(nèi)膜組織作為胚胎著床和發(fā)育過程中需要依賴的基本“土壤”，是支持和保證人類胚胎種植成功的關(guān)鍵因素。因此容受性良好的子宮內(nèi)膜組織是胚胎種植成功的重要因素。胚胎植入失敗，在很大程度上受子宮內(nèi)膜容受性影響所致。

2 改善子宮內(nèi)膜容受性現(xiàn)狀

Raziel等[6]報(bào)道機(jī)械性搔刮子宮內(nèi)膜組織，能夠促進(jìn)患者的子宮內(nèi)膜組織蛻膜化，提高子宮內(nèi)膜容受性，但是這一操作通常在盲視條件下進(jìn)行，存在較高的風(fēng)險(xiǎn)性。近期也有研究[7]揭示宮腔鏡微創(chuàng)手術(shù)的臨床應(yīng)用，可有效改善患者的子宮內(nèi)膜容受性，為胚胎的順利著床創(chuàng)造條件，提升臨床妊娠成功率，但該法存在機(jī)械性損傷，需要抗感染治療及長時(shí)間恢復(fù)。王巍等[8]在皮下組織注射適量的來自配偶或第三方的外周血淋巴細(xì)胞，以此為患者開展主動(dòng)免疫治療干預(yù)，能夠顯著提升臨床妊娠率和新生兒活產(chǎn)率，但該法存在注射部位持續(xù)疼痛、需要反復(fù)多次注射、引發(fā)血源性病毒交叉感染，以及誘導(dǎo)發(fā)生母胎變態(tài)反應(yīng)等副作用。2006年Yoshioka等[9]在新鮮周期采用自體外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)宮腔灌注能顯著提高RIF患者的胚胎著床率及臨床妊娠率，該法的提出為提高RIF患者胚胎著床提供了有效途徑。高明霞等[10-15]研究表明， RIF患者在凍融胚胎移植前宮腔灌注人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、絨毛膜促性腺激素(HCG)、自體外周血單個(gè)核細(xì)胞、自體淋巴細(xì)胞等，可改善子宮內(nèi)膜容受性，有效提高臨床妊娠率，但此類方法仍存在療效不確定等問題。常亞杰等[4]認(rèn)為，自體PRP宮腔灌注具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖，改善薄型子宮內(nèi)膜患者臨床妊娠結(jié)局的臨床療效，可作為提高RIF患者臨床妊娠率的一種安全、經(jīng)濟(jì)、有效的方法。

3 PRP成分及相關(guān)作用機(jī)制

3.1 PRP成分 PRP為自體外周血經(jīng)細(xì)胞分離，采用人外周血血小板分離液和密度梯度離心法分離提取得到的濃縮血小板血漿。PRP中血小板含量為全血的4～5倍[4]。PRP主要包含血小板和血漿蛋白質(zhì)(PBPP)兩種成分。血小板含有多種糖蛋白，其中血小板衍生生長因子(PDGF)是一種堿性糖蛋白，存在于血小板細(xì)胞器的α顆粒中。一方面，在凝血酶作用下，PDGF從血小板釋放，刺激成纖維細(xì)胞核肌細(xì)胞的生長和分裂；另一方面，PDGF與肝素結(jié)合，刺激DNA合成和細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞生長，促進(jìn)單核細(xì)胞的化學(xué)趨化[16]。PBPP的主要作用：①對組織蛋白起修補(bǔ)作用，如白蛋白和前蛋白；②組成體液免疫對組織細(xì)胞構(gòu)成防御系統(tǒng)，如免疫球蛋白和補(bǔ)體；③對組織細(xì)胞具有代謝調(diào)節(jié)作用的生長激素和蛋白酶抑制物，如α1-抗胰蛋白酶、α1-抗糜蛋白酶、α-巨球蛋白等。其中白蛋白，是血漿含量最豐富的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白的57%～68%，是由585個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，是最重要的血漿營養(yǎng)蛋白和重要的血漿載體蛋白質(zhì)。白蛋白由胞飲作用進(jìn)入組織細(xì)胞后分解氨基酸用于合成組織蛋白，對組織細(xì)胞起到補(bǔ)充和修復(fù)作用[17]。

3.2 PRP促子宮內(nèi)膜組織生長的機(jī)制 血小板的α顆粒含有大量無活性的、合成的生長因子，在血小板激活狀態(tài)下可釋放并發(fā)揮其促組織生長作用。Marx[18]認(rèn)為，采用凝血酶和CaCl2作為PRP激活劑，可以最大限度地激活血小板。血小板被激活后，α顆粒中所包含的PDGF、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等，通過脫顆粒方式經(jīng)血小板胞膜釋放出來，并通過跨膜受體結(jié)合到細(xì)胞膜表面，促進(jìn)子宮內(nèi)膜組織生長。

3.3 PRP促子宮內(nèi)膜增殖的機(jī)制 PRP促增殖作用依賴于多種生長因子的協(xié)同作用，激活PDGF受體蘇氨酸蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶、絲氨酸、核因子κB信號通路，參與血管內(nèi)皮的再生和修復(fù)，提高旁分泌水平，使細(xì)胞耐受不良環(huán)境的能力更強(qiáng)，減緩細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[19]。與單一的顆粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、VEGF等生長因子宮腔灌注治療相比，PRP具有明顯優(yōu)勢：①發(fā)揮多種生長因子的協(xié)同效應(yīng)。Amable等[20]研究發(fā)現(xiàn)，單一的生長因子不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖與修復(fù)，只有多種因子結(jié)合在一起時(shí)才能發(fā)揮其增殖、修復(fù)作用。②能較長時(shí)間發(fā)揮功效：PRP是天然的生長因子緩釋系統(tǒng)，儲(chǔ)存在血小板的多種生長因子緩慢釋放，可以使作用于靶細(xì)胞的時(shí)間延長，比常規(guī)的一次性給藥更合理有效。③除生長因子外，PRP還富含蛋白質(zhì)、纖維蛋白、纖維結(jié)合蛋白等，形成纖維網(wǎng)絡(luò)，起到承接促進(jìn)細(xì)胞黏附、組織修復(fù)細(xì)胞、防止細(xì)胞流失的支架作用。

3.4 PRP促子宮內(nèi)膜生長 成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)PRP所分泌生長因子的胞膜受體，受體活化內(nèi)在信號蛋白，促進(jìn)細(xì)胞增殖、膠原合成、基質(zhì)合成等一系列基因的表達(dá)?；谝陨侠碚摶A(chǔ)，Intini的研究[21]也證實(shí)了PRP具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長、改善薄型子宮內(nèi)膜容受性、有效提高臨床妊娠率的作用，為臨床治療提供了新的方法和思路。

4 自體PRP宮腔灌注主要技術(shù)流程

4.1 RIF患者病因篩查 對行IVF/ICSI-ET助孕治療，移植失敗2次或以上，要求行FET治療的患者進(jìn)行病因篩查。納入標(biāo)準(zhǔn)：①已移植卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎2次或以上；既往周期胚胎移植(ET)前日子宮內(nèi)膜Salle評分≥13分；②基礎(chǔ)血清促卵泡激素(FSH)<15 U/L；③夫婦雙方染色體核型正常，無子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥等盆腔器質(zhì)性病變；④抗心磷脂抗體陰性，NK細(xì)胞活性正常。針對患者全面系統(tǒng)地講解，告知開展自體PRP宮腔灌注治療的必要性，還要告知患者該種技術(shù)干預(yù)過程中可能發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)事件，以及需要支付的經(jīng)濟(jì)費(fèi)用；預(yù)先確認(rèn)和排除患者是否存在治療的禁忌證，遵循臨床規(guī)范為患者實(shí)施PRP宮腔灌注治療。

4.2 自體PRP的制備 所有操作均在超凈工作臺中進(jìn)行，嚴(yán)格無菌操作。治療日上午抽取患者空腹靜脈血15 mL，用細(xì)胞分離專用抗凝劑充分抗凝，在梯度離心管(Falcon2099)中，要嚴(yán)格遵循1 ∶2的數(shù)量比例將抗凝血樣本加到標(biāo)準(zhǔn)制備的人外周血血小板分離液的液面空間結(jié)構(gòu)上，以400 g離心20.0 min。離心管中的細(xì)胞由上至下可被劃分為四層：第一層為血小板血漿層，第二層為環(huán)狀乳白色細(xì)胞層，第三層為透明分離液層，第四層為紅細(xì)胞層。選取標(biāo)準(zhǔn)制備的無菌巴氏吸管吸取第一層至14 mL試管待用。

4.3 宮腔灌注 患者于月經(jīng)第三天開始人工周期，5 d后于子宮內(nèi)膜黃體轉(zhuǎn)化日前3 d接受自體PRP宮腔灌注治療。取膀胱截石位，以0.1%碘伏沖洗外陰及陰道后，腹部B 超監(jiān)測下觀察到內(nèi)膜，用5 mL注射器抽取5 mL制備好的PRP，連接到人工授精管后，在腹部B超監(jiān)測下，緩慢推注入宮腔內(nèi)停留15 s，取出人工授精管，囑患者臥床10～20 min。

4.4 臨床妊娠結(jié)局的判定 接受移植后28 d，經(jīng)陰道B超檢查，確認(rèn)患者宮腔內(nèi)存在孕囊，且能夠檢測出原始胎心搏動(dòng)，可診斷為臨床妊娠。

5 PRP宮腔灌注治療的安全性

PRP由患者自體外周靜脈血分離提取獲得，無變態(tài)反應(yīng)及無血源性病毒交叉感染，同時(shí)其分泌的多種生長因子還具有抗炎、止血的潛在作用，因此不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等相關(guān)問題。一項(xiàng)對口腔下頜骨術(shù)后應(yīng)用自體PRP治療的隨訪研究[22]顯示，PRP治療并不增加臨床感染等相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。García-Martínez等[23]研究將人的成骨細(xì)胞和自體PRP共培養(yǎng)后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期沒有發(fā)生改變，而且PRP促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用隨時(shí)間延長慢慢消失，不會(huì)引起細(xì)胞的無序增殖，說明PRP不會(huì)改變細(xì)胞的性狀、不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性變。上述報(bào)道均驗(yàn)證了自體PRP臨床應(yīng)用的安全性。

6 展 望

IVF/ICSI-ET及其相關(guān)輔助生殖技術(shù)的臨床妊娠成功率與患者的年齡、胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜容受性及宮腔內(nèi)基礎(chǔ)生理環(huán)境等因素有關(guān)。自體PRP宮腔灌注治療具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖、改善薄型子宮內(nèi)膜患者臨床妊娠結(jié)局的臨床療效。如何更好地應(yīng)用自體PRP宮腔灌注改善子宮內(nèi)膜容受性，使子宮內(nèi)膜的分化與胚胎發(fā)育同步，有效提高RIF患者臨床妊娠率，目前臨床及實(shí)驗(yàn)室處理方法仍處在摸索中，還需要進(jìn)一步深入研究，而且應(yīng)該將評價(jià)與治療緊密相結(jié)合，實(shí)施個(gè)體化治療，才能得出合理的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并提供更好的臨床治療方案。