王慶軍，馬 麗，郝兆祥，羅 華，畢潤霞，趙麗娜，侯樂峰，*

(1.棗莊市石榴研究中心，山東 棗莊 277300；2.棗莊學(xué)院，山東 棗莊 277160)

石榴(PunicagranatumL.)為石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)伊朗、阿富汗等地，在長期傳播和栽培過程中形成了許多的變異資源，極大地豐富了遺傳多樣性[1-2]。石榴分類通常依據(jù)花瓣數(shù)量、花朵顏色、結(jié)實性、果色等為品種形態(tài)特征，品種名稱多以當(dāng)?shù)氐牧?xí)慣稱謂命名，品種間的親緣關(guān)系模糊不清，同物異名、同名異物的現(xiàn)象時常出現(xiàn)[3-4]。目前，不少學(xué)者已開始采用DNA分子標(biāo)記等方法對石榴進(jìn)行品種分類及親緣關(guān)系探索，比如，張四普等[5]用SRAP標(biāo)記對江蘇等地23個石榴品種，苑兆和等[6]利用熒光AFLP標(biāo)記技術(shù)對山東省25個石榴品種，趙麗華等[7-8]利用AFLP和ISSR標(biāo)記技術(shù)對川滇等石榴品種進(jìn)行了親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，均表明中國多個產(chǎn)區(qū)的石榴都具有比較豐富的遺傳多樣性。Rania等[9]利用AFLP標(biāo)記、Ghobadi等[10]利用ISSR標(biāo)記、Noormohammadi等[11]采用RAPD、ISSR和SSR標(biāo)記技術(shù)分析表明，突尼斯和伊朗石榴品種的遺傳多樣性更加豐富。這些研究為揭示石榴品種間親緣關(guān)系及科學(xué)分類提供了非常有價值的信息，但它們的研究對象主要是食用石榴及少數(shù)賞食兼用的石榴資源，至今尚未見到專門針對觀賞石榴品種的DNA分子標(biāo)記研究。

觀賞石榴(PunicaL.)是從普通石榴(PunicagranatumL.)中選出的觀賞變種，具有花期長、花朵艷麗、花瓣姿色優(yōu)美等多種特點，是園林綠化、庭院綠化、景區(qū)綠化最受歡迎的樹種之一[12]。ISSR是一種簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，它結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點，具有成本低、使用方便和結(jié)果重現(xiàn)性較高等特點[13]。山東棗莊是中國著名的石榴產(chǎn)區(qū)之一，近年來選育和引進(jìn)了大批觀賞性石榴品種，本實驗擬利用ISSR標(biāo)記對35個不同形態(tài)的觀賞石榴品種的遺傳多樣性與親緣關(guān)系進(jìn)行分析，以期為觀賞石榴種質(zhì)資源的分類、保存、有效利用和新品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試的35個觀賞石榴品種采自“棗莊市石榴國家林木種質(zhì)資源庫”內(nèi)(表1)。采集后用冰壺運(yùn)回，于-70 ℃冰箱保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 石榴基因組DNA的提取與檢測

參考Huang等[14]CTAB法從石榴幼葉中提取基因組DNA。用0.8%(m/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，用德國IMPLEN P300核酸蛋白超微量紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度，將DNA用TE稀釋至終濃度為50 ng·μL-1，放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 引物篩選及ISSR- PCR擴(kuò)增

ISSR隨機(jī)引物中篩選多態(tài)性好，擴(kuò)增穩(wěn)定的多態(tài)性引物，選擇品種間多態(tài)性好，譜帶清晰，重復(fù)穩(wěn)定的引物用于觀賞石榴的遺傳關(guān)系研究。用上海桑尼生物科技有限公司合成的8條ISSR隨機(jī)引物(表2)對35個觀賞石榴品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker等試驗藥品采購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，25 μL的PCR反應(yīng)體系包含：ddH2O 10.5 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL 、10 μmol·L-1引物1 μL和50 ng·μL-1模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)在美國BIO- RAD生產(chǎn)的梯度PCR儀(C1000)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，45 s，退火(Tm-5) ℃，30 s(Tm見表2)，延伸72 ℃，2 min，35個循環(huán)；再延伸72 ℃，10 min；最后4 ℃保存，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物拍照保存。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

通過Alphaview SA軟件對電泳結(jié)果讀取譜帶分子量，以DL2000 DNA Marker譜帶分子量為標(biāo)準(zhǔn)，由軟件分析得到各條譜帶分子量的大小。電泳圖譜中每一個條帶均代表了ISSR引物與石榴模板DNA互補(bǔ)結(jié)合的位點，同一引物在相同遷移率位置譜帶清晰可辨的記為“1”，模糊或缺失的記為“0”[15]。統(tǒng)計所有ISSR引物擴(kuò)增的結(jié)果，建立“0，1”原始矩陣。采用POPGENE1.32 軟件，在假定種群處于Hardy- Weinberg 平衡狀態(tài)下進(jìn)行遺傳參數(shù)分析，分別計算多態(tài)位點比率(PPB)、平均Shannon信息多樣性指數(shù)(I)、平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(He)、平均觀察等位基因數(shù)(Na)和平均有效等位基因數(shù)(Ne)。用NTSYS2.10軟件計算35個品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)，根據(jù)GS值按以不加權(quán)成對群算術(shù)平均法(UPGMA)構(gòu)建35個品種的親緣關(guān)系聚類圖。

表1供試觀賞石榴品種的編號、名稱、來源及特性

Table1The codes，names，origins and characters of tested ornamental pomegranate cultivars

編號Code名稱Name產(chǎn)地Origin花色Flowercolor花型Flowerform果皮顏色Pericarpcolor1嶧城青皮月季Yichengqingpiyueji山東Shandong紅色Red單瓣Single青綠色Cyan-green2嶧城重瓣粉紅月季Yichengchongbanfenhongyueji山東Shandong粉色Pink重瓣Double白色White3嶧城重瓣粉紅白皮甜Yichengchongbanfenhongbaipitian山東Shandong粉色Pink重瓣Double白色White4嶧城紅皮月季(大果)Yichenghongpiyueji(daguo)山東Shandong紅色Red單瓣Single紅色Red5嶧城重瓣紅月季Yichengchongbanhongyueji山東Shandong紅色Red重瓣Double未結(jié)果Nofruit6嶧城單瓣粉紅白皮酸Yichengdanbanfenhongbaipisuan山東Shandong粉色Pink單瓣Single白色White7嶧城紅皮月季(小果)Yichenghongpiyueji(xiaoguo)山東Shandong紅色Red單瓣Single紅色Red8嶧城單瓣瑪瑙Yichengdanbanmanao山東Shandong瑪瑙色Agatecolor單瓣Single未結(jié)果Nofruit9嶧城紅牡丹石榴Yichenghongmudan山東Shandong紅色Red重瓣Double紅色Red10嶧城重瓣白皮酸Yichengchongbanbaipisuan山東Shandong白色White重瓣Double白色White11嶧城小紅牡丹Yichengxiaohongmudan山東Shandong紅色Red重瓣Double青綠色Cyan-green12嶧城抗寒砧木1號Yichengkanghanzhenmu1山東Shandong紅色Red單瓣Single紅色Red13嶧城重瓣白花酸Yichengchongbanbaihuasuan山東Shandong白色White重瓣Double白色White14超青Yichengchaoqing山東Shandong紅色Red單瓣Single青綠色Cyan-green15嶧城重瓣紅皮酸Yichengchongbanhongpisuan山東Shandong紅色Red重瓣Double紅色Red16嶧城單瓣粉紅青皮酸Yichengdanbanfenhongsuan山東Shandong粉色Pink單瓣Single青綠色Cyan-green17嶧城紅花重瓣紫皮酸Yichenghonghuachongbanzipisuan山東Shandong紅色Red重瓣Double紫紅色Purplishred18嶧城紅花重瓣青皮酸Yichenghonghuachongbanqingpi-suan山東Shandong紅色Red重瓣Double青綠色Cyan-green19嶧城粉紅重瓣白皮甜Yichengfenhongchongbanbaipitian山東Shandong粉色Pink重瓣Double白色White20嶧城瑪瑙石榴Yichengmanao山東Shandong瑪瑙色Agatecolor重瓣Double紅色Red21寧津單瓣瑪瑙Ningjindanbanmanao山東Shandong瑪瑙色Agatecolor單瓣Single未結(jié)果Nofruit22寧津紅皮酸Ningjinhongpisuan山東Shandong紅色Red單瓣Single紅色Red23泰山紅牡丹Taishanhongmudan山東Shandong紅色Red重瓣Double紅色Red24白珍珠Baizhenzhu山東Shandong白色White單瓣Single白色White25墨石榴Moshiliu山東Shandong紅色Red單瓣Single紫紅色Purplishred26月季石榴Yuejishiliu山東Shandong紅色Red單瓣Single紅色Red27日本看石榴JapanKanshiliu山東Shandong紅色Red單瓣Single紅色Red28繡球牡丹Xiuqiumudan山東Shandong紅色Red重瓣Double紅色Red29皖黑1號Wanhei1安徽Anhui紅色Red單瓣Single紫紅色Purplishred30邳州重瓣三白甜Pizhouchongbansanbaitian江蘇Jiangsu白色White重瓣Double白色White31美國瑪瑙AmericaManao美國America瑪瑙色Agatecolor重瓣Double未結(jié)果Nofruit32喜愛Xiai美國America紅色Red單瓣Single紅色Red33美國粉紅重瓣AmericaFenhongchongban美國America粉色Pink重瓣Double紅色Red34Ambrosia美國America紅色Red單瓣Single未結(jié)果Nofruit35玲瓏牡丹Linglongmudan陜西Shaanxi紅色Red重瓣Double未結(jié)果Nofruit

表2ISSR- PCR擴(kuò)增的引物及擴(kuò)增結(jié)果

Table2ISSR primers used for ISSR- PCR amplification and their amplification results

引物名稱Primername序列Sequence(5'-3')退火溫度Tm/℃擴(kuò)增譜帶數(shù)Numberofbands多態(tài)性譜帶數(shù)Numberofpolymorphicbands多態(tài)性比率Ratioofpolymor-phisms/%UBC808(AG)8C52212095.24UBC809(AG)8G52222195.45UBC841(GA)8YC53242395.83UBC811(GA)8C52232086.96UBC842(GA)8YG53201995.00UBC816(CA)8T501616100.00UBC835(AG)8YC53242291.67UBC827(AC)8G52181794.44總計Total168158平均Average2119.7594.05

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR- PCR引物擴(kuò)增多態(tài)性結(jié)果

篩選出的8條引物(表2)在35個觀賞石榴品種中共檢測到168個DNA位點，平均每條引物擴(kuò)增出21個DNA位點，其中有158個多態(tài)性位點，多態(tài)性位點比率(PPB)為94.05%。8條ISSR引物擴(kuò)增的DNA位點數(shù)(表2)在16～24個，多態(tài)性位點比率在86.96%～100%，其中8條引物在35個品種中多態(tài)性比率表現(xiàn)最低為引物UBC811是86.96%，而UBC816擴(kuò)增出的DNA位點為16，位點數(shù)最少，但多態(tài)性位點比率最高，達(dá)100%。表明8條引物具有較好的多態(tài)性，35個石榴品種的遺傳多樣性比較豐富。每條引物擴(kuò)增平均產(chǎn)生21個DNA位點和19.75個多態(tài)性位點，擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段長度在101～2 000 bp。結(jié)果表明，采用不同的ISSR引物對觀賞石榴品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的位點數(shù)差異較大，但多態(tài)性位點的比例差異不大(表2)。

2.2 觀賞石榴品種的遺傳多樣性分析

通過Popgene1.32軟件對35個觀賞石榴品種的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明平均觀察等位基因數(shù)(Na)為1.940 5，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.678 5，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)為0.379 9，平均Shannon信息指數(shù)(I)為0.553 0。結(jié)果表明，35個觀賞石榴品種間的遺傳變異較大，品種資源間存在比較豐富的遺傳多樣性。

M, DL 2 000 marker; 數(shù)字編號對應(yīng)品種名稱與表1相同。M, DL 2 000 marker; The number is the same as Table 1.圖2 引物UBC835對35個品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification result of 35 ornamental pomegranate cultivars using UBC835 primer

2.3 觀賞石榴品種的遺傳關(guān)系聚類分析

由8條引物對35個觀賞石榴品種進(jìn)行ISSR- PCR擴(kuò)增獲得的168個位點數(shù)據(jù)，計算品種間遺傳相似系數(shù)，35個觀賞石榴品種遺傳相似系數(shù)在0.416 7～0.922 6。其中9號與26號遺傳相似系數(shù)最小，說明這2個品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；28號與30號遺傳相似系數(shù)最大，說明這2個品種親緣關(guān)系最近。

利用NTSYS2.10軟件，計算35個品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)，根據(jù)GS值構(gòu)建35個品種的UPGMA親緣關(guān)系聚類圖(圖3)。從圖3可以看出，8條ISSR引物能將35個觀賞石榴品種區(qū)分開。以遺傳相似性系數(shù)(GS)0.668為閾值，供試的35個觀賞石榴品種可分為6類：第Ⅰ類包含23個觀賞石榴品種且分為2個亞類，第一亞類中包含22個觀賞石榴品種且又分為2個小類，第一小類中包含12個石榴品種分別為1號、4號、7號、6號、5號、2號、9號、10號、3號、8號、12號、15號，均來自山東，第二小類中包含10個觀賞石榴品種分別為21號、25號、24號、27號、28號、30號、29號、33號、35號、34號；第二亞類中僅包含1個觀賞石榴品種為32號，來自美國，具有花朵紅色、花型單瓣、果皮紅色等特性。第Ⅱ類僅包含1個觀賞石榴品種為16號，來自山東，具有花朵粉色、花型單瓣、果皮青綠色等特性。第Ⅲ類包含6個觀賞石榴品種且分為2個亞類，第一亞類中僅包含1個觀賞石榴品種為13號，來自山東，具有花朵白色、花型重瓣、果皮白色等特性；第二亞類中包含5個觀賞石榴品種且又分為2個小類，第一小類中僅包含1個觀賞石榴品種為14號，來自山東，具有花朵紅色、花型單瓣、果皮青綠色等特性，第二小類中包含的4個觀賞石榴品種分別為17號、19號、18號、20號，均來自山東，且花型相同，均為重瓣。第Ⅳ類包含2個觀賞石榴品種，分別是11號、26號，均來自山東，且花色相同，均為紅色。第Ⅴ類僅包含1個觀賞石榴品種為31號，來自美國，具有花朵瑪瑙色、花型重瓣等特性。第Ⅵ類包含2個觀賞石榴品種，分別是22號、23號，均來自山東，且花色、果色相同，均為紅色。

1～35:品種名稱與表1相同。The cultivar name of 1-35 is the same as Table 1.圖3 35個觀賞石榴品種的UPGMA親緣關(guān)系聚類圖Fig.3 The UPGMA genetic relationship clustering map of 35 ornamental pomegranate cultivars

3 討論

用NTSYS2.10軟件計算35個觀賞石榴品種間遺傳相似系數(shù)，從分子水平來說9號與26號遺傳相似系數(shù)最小，表明品種的遺傳分化越大，遺傳多樣性越高，遺傳背景越復(fù)雜，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且物種存在歷史長遠(yuǎn)[16]，但是兩者均來自山東，且花色同為紅色，表明與形態(tài)分類和按照地域分布分類的結(jié)果相差較遠(yuǎn)。28號與30號從分子角度看遺傳相似系數(shù)最大，表明這兩個觀賞品種親緣關(guān)系最近，28號來自山東，花色、果色均為紅色、花型為重瓣，30號來自江蘇花色、果色為白色、花型為重瓣，表明與形態(tài)分類和按照地域分布分類的結(jié)果不一致。利用UPGMA法構(gòu)建分子樹狀圖，以遺傳相似性系數(shù)(GS)0.668為閾值，將35個石榴品種分為6個類群，31號、32號、33號、34號均來自美國，31號聚為第Ⅴ類，32號、33號、34號雖聚為第Ⅰ類但第Ⅰ類包含2個亞類，在第一亞類中33號、34號被聚為第二小類，32號被聚為第二亞類，這表明品種間親緣關(guān)系與地理環(huán)境有一定相關(guān)性，但不是絕對性的，這與Maryam等[17]、Rania等[9]得出的突尼斯和伊朗石榴的聚類結(jié)果與地理分布劃分結(jié)果不一致的研究結(jié)論基本相同。

鞏雪梅[18]利用50個石榴品種材料進(jìn)行資源遺傳變異分子標(biāo)記研究，表明不應(yīng)當(dāng)以花的重瓣、單瓣性狀作為觀賞石榴變種劃分的依據(jù)。盧龍斗等[19]利用RAPD對55個石榴栽培品種進(jìn)行分析，將55個石榴品種分為4個類群，分類結(jié)果與形態(tài)上的分類存在著一定的差異，即與根據(jù)花色和果味進(jìn)行的分類沒有相關(guān)性，而與按瓣型進(jìn)行的分類有一定的相關(guān)性。本研究以遺傳相似性系數(shù)(GS)0.668為閾值，供試的35個觀賞石榴品種可分為6類，其中第Ⅰ類包含的23個觀賞石榴品種中花色為紅色且花型為單瓣的有1號、4號、7號、12號、25號、27號、29號和34號；花色為粉色且花型為重瓣的有2號、3號和33號，也說明不應(yīng)當(dāng)以花的花色和花型重瓣、單瓣性狀作為觀賞石榴變種劃分的依據(jù)。

ISSR分子標(biāo)記是從分子水平上對遺傳物質(zhì)差異的直接反映，而形態(tài)分類是從傳統(tǒng)水平上對遺傳物質(zhì)差異的間接反映，且易受到環(huán)境作用的影響，因而應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)對觀賞石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究分析，能更好地為觀賞石榴種質(zhì)資源保存、利用及品種改良等提供科學(xué)寶貴的依據(jù)[20]。建議在地域和表型特征的基礎(chǔ)上結(jié)合多種分子標(biāo)記技術(shù)等其他分類學(xué)方法，制定科學(xué)合理的分類體系，才能為觀賞石榴品種的開發(fā)和利用尤其是品種選育雜交提供科學(xué)的依據(jù)。

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