文/韋 艷 李傳慰 祭仲石

本文以2016年本地區(qū)的一個生產(chǎn)周期為例，本實(shí)驗(yàn)室分離到的氣單胞菌為實(shí)驗(yàn)對象，選擇本地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常用的復(fù)合碘、苯扎溴銨、戊二醛和二硫氰基甲烷四種消毒劑為實(shí)驗(yàn)用消毒劑，采用二倍稀釋法，檢驗(yàn)各消毒劑的體外抑菌殺菌效果。結(jié)果表明，幾種消毒劑中，抑菌殺菌效果依次為：二硫氰基甲烷＞苯扎溴銨＞ 復(fù)合碘＞戊二醛。通過本文的研究，以期為本地區(qū)淡水養(yǎng)殖找到合理高效的消毒劑提供依據(jù)。筆者就2016年度4種消毒劑對氣單胞菌的體外抑菌殺菌效果研究的情況介紹如下，供大家參考。

氣單胞菌屬于γ－變形菌綱、氣單胞菌目、氣單胞菌科、氣單胞菌屬（Aeromonas），包括嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）、溫和氣單胞菌（A.sobria）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）、維氏氣單胞菌（A.veronii）等20種。很多種氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中多種疾病的病原菌，在自然水體與養(yǎng)殖水體中廣泛存在，在池塘水質(zhì)惡化和養(yǎng)殖對象體質(zhì)下降時，往往會加重疾病的誘發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來重大損失。氣單胞菌是一種重要的淡水養(yǎng)殖病原菌，可感染許多種水產(chǎn)動物，其中最嚴(yán)重的是以細(xì)菌性敗血癥為主，該病爆發(fā)迅速，一旦爆發(fā)往往造成巨大的損失。目前魚類的細(xì)菌性疾病的治療還是依靠內(nèi)服抗生素，但是，抗生素的大量使用容易產(chǎn)生耐藥菌株，同時抗生素在魚體內(nèi)殘留也導(dǎo)致了食品安全問題。而化學(xué)類消毒劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用，可以有效的消滅病原微生物，起到了防治細(xì)菌性疾病的效果，且通常不會產(chǎn)生殘留問題，因此尋找廣譜、高效的外用消毒藥物顯得迫在眉睫，市場上消毒劑種類繁多，良莠不齊，選擇合理的消毒劑可以有效減少盲目用藥帶來的損失，增加經(jīng)濟(jì)收益。

一、材料與方法

（一）材料

實(shí)驗(yàn)用消毒劑購自當(dāng)?shù)厥袌觯慌囵B(yǎng)基為腦心浸液培養(yǎng)基，p H（7.4±0.2），采購自O(shè)XOID；實(shí)驗(yàn)用氣單胞菌菌株BY-1分離自當(dāng)?shù)鼗疾■~。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)菌的分離與純化

按無菌操作方法，分別取患病鳊魚的肝臟、腎臟部位劃線分離到腦心浸液培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，挑取優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化，劃線接種于腦心浸液培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h。

2.細(xì)菌懸濁液的制備

將分離到的致病菌接種于腦心浸液培養(yǎng)基上，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后挑選優(yōu)勢菌落純化培養(yǎng)，然后經(jīng)純化培養(yǎng)后接種于斜面培養(yǎng)基，再次置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后用0.7%的生理鹽水洗下菌苔，制成細(xì)菌懸濁液為0.5麥?zhǔn)蠁挝粋溆谩?/p>

3.4種消毒劑對氣單胞菌最小抑菌濃度（MIC）測定

試驗(yàn)步驟：將4種消毒劑分別用蒸餾水稀釋為1000mg/L的母液，然后用濾菌器將4種消毒劑濾菌，采用二倍稀釋法，使液體培養(yǎng)基中4種消毒劑含量分別達(dá)到512mg/L、256mg/L、128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L。再分別接種100μL菌液濃度約為108CFU/mL的細(xì)菌懸濁液作為試驗(yàn)組；陽性對照將菌接種于不含4種消毒劑的腦心浸液液體培養(yǎng)基的試管中，陰性對照不加菌液。30℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。通過細(xì)菌的是否生長，確定4種消毒劑抑制受試菌生長的最低濃度。

評定方法：當(dāng)陽性對照管有細(xì)菌生長（渾濁），陰性對照管無細(xì)菌生長（澄清），試驗(yàn)組中無菌生長的最低4種消毒劑的濃度即為4種消毒劑對該供試菌株的MIC。

4.4種消毒劑對氣單胞菌最小殺菌濃度（MBC）測定

試驗(yàn)步驟：根據(jù)最小抑菌濃度結(jié)果，分別選擇高于MIC5個稀釋度的試管中的培養(yǎng)液，取100μL菌液接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，同時添加陽性對照和陰性對照，30℃恒溫條件下培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。

評定方法：當(dāng)陽性對照管中有細(xì)菌生長（渾濁），陰性對照組無細(xì)菌生長（澄清），試驗(yàn)組無菌生長的最低稀釋度所對應(yīng)的消毒劑濃度為該樣品對受試菌的MBC。

二、結(jié)果分析

（一）幾種消毒劑的最小抑菌濃度（MIC）

肉眼觀察無致病菌生長試管中的最低藥物濃度，即為該供試藥物的MIC。各菌株在含有不同濃度消毒劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，結(jié)果見表1。由表1中可以看出，陽性對照試管內(nèi)出現(xiàn)渾濁，表示細(xì)菌增殖良好，陰性對照試管內(nèi)澄清，表示沒有細(xì)菌生長。實(shí)驗(yàn)組各試管出現(xiàn)渾濁和澄清現(xiàn)象，表明不同的消毒劑可以在不同濃度下抑制氣單胞菌的生長。

從表1中可以得知各消毒劑對氣單胞菌的最小抑菌濃度（MIC），其中二硫氰基甲烷在1mg/L時出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，表示在該濃度下不能抑制細(xì)菌生長，而在濃度2mg/L及以上濃度時出現(xiàn)透澄清現(xiàn)象，表明該濃度下細(xì)菌的生長被抑制，表明二硫氰基甲烷的最小抑菌濃度（MIC）是2mg/L。戊二醛在64mg/L及該濃度以下時均出現(xiàn)渾濁，表明在該濃度以及該濃度以下不能抑制細(xì)菌生長，而在濃度為128mg/L時及該濃度以上時均出現(xiàn)澄清現(xiàn)象，表明該濃度下細(xì)菌的生長被抑制，由此可得知，戊二醛的最小抑菌濃度（MIC）是128mg/L。同理可得出復(fù)合碘的最小抑菌濃度（MIC）是64mg/L，苯扎溴銨的最小抑菌濃度（MIC）是4mg/L。

以上幾種消毒劑的MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：二硫氰基甲烷在較低濃度下就可以有效抑制氣單胞菌的生長，由此說明在養(yǎng)殖過程中，使用二硫氰基甲烷類消毒劑可以有效抑制致病菌的生長繁殖。

表1 4種消毒劑對氣單胞菌的抑制作用

（二）幾種消毒劑的最小殺菌濃度（MBC）

MBC即為供試藥物殺滅99.9%或以上受試致病菌所需要的最低濃度。具體操作步驟是：在各消毒劑最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行測定，分別選擇高于各消毒劑最小抑菌濃度的5個稀釋度試管中的培養(yǎng)液，各取100μL菌液接種于對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫條件下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。表2表明，各陽性對照菌出現(xiàn)渾濁，說明細(xì)菌可以生長繁殖；陰性對照出現(xiàn)澄清現(xiàn)象，說明陰性對照試管中沒有細(xì)菌增殖；實(shí)驗(yàn)組各組試管中出現(xiàn)不同程度的渾濁或澄清。氣單胞菌在二硫氰基甲烷濃度8mg/L以下時出現(xiàn)渾濁，說明二硫氰基甲烷在2mg/L～8mg/L時只抑制了氣單胞菌的增殖，沒有殺滅氣單胞菌；氣單胞菌在苯扎溴銨濃度32mg/L以下時出現(xiàn)渾濁，說明二苯扎溴銨在4mg/L～32mg/L時只抑制了氣單胞菌的增殖，沒有殺滅氣單胞菌；氣單胞菌在戊二醛512mg/L以下時出現(xiàn)渾濁，說明戊二醛在128mg/L～512mg/L時只抑制了氣單胞菌的增殖，沒有殺滅氣單胞菌；氣單胞菌在復(fù)合碘濃度512mg/L以下時出現(xiàn)渾濁，說明復(fù)合碘在64mg/L～512mg/L時只抑制了氣單胞菌的增殖，沒有殺滅氣單胞菌。

嗜水氣單胞菌

表2 4種消毒劑對氣單胞菌的抑制作用

三、討論

氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病原菌，是淡水養(yǎng)殖中細(xì)菌性敗血癥的主要病菌，快速準(zhǔn)確的對其進(jìn)行鑒定、篩選高效的消毒劑，對及時采取措施控制病情，指導(dǎo)養(yǎng)殖業(yè)科學(xué)用藥，對實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖、保障食品安全具有重要意義。篩選高效的消毒劑，可以有效控制細(xì)菌性疾病，減少大量死亡帶來的損失，增加養(yǎng)殖收入。本實(shí)驗(yàn)選擇了4種常用的消毒劑進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明：4種消毒劑效果依次為：二硫氰基甲烷>苯扎溴銨>復(fù)合碘>戊二醛。二硫氰基甲烷對氣單胞菌的抑菌效果最好，MIC為2mg/L，MBC為8mg/L，而戊二醛和復(fù)合碘效果相對較差。譚鳳霞等研究表明，戊二醛在濃度為7.8mg/L 時對氣單胞菌有有較好的抑菌效果，在相對高濃度的125mg/L的濃度下，對氣單胞菌具有殺滅作用。譚鳳霞等還研究表明，聚維酮碘對氣單胞菌的MIC在125.00mg/L～250.00mg/L，MBC在4.00g/L～8.00g/L。本文結(jié)果表明，戊二醛MIC和MBC分別為128mg/L和大于512mg/L；復(fù)合碘MIC和MBC分別為64mg/L和大于512mg/L。本文結(jié)果與其他研究有些許不同，可能由于不同養(yǎng)殖區(qū)域慣用的消毒劑和環(huán)境不同，導(dǎo)致氣單胞菌的耐藥性不同，從而導(dǎo)致了不同地區(qū)氣單胞菌的耐藥性有所不同。

本文結(jié)果表明，二硫氰基甲烷在較低濃度下可以有效抑制和殺滅嗜水氣單胞菌，其效果明顯優(yōu)于戊二醛、聚維酮碘等消毒劑。但不同地區(qū)的細(xì)致病菌存在不同的耐藥性，且市場上消毒劑種類繁多，質(zhì)量良莠不齊，選擇合理的消毒劑可以有效減少盲目用藥帶來的損失，在今后的工作中，還要再進(jìn)行同種類型消毒劑的橫向比較，挑選最優(yōu)藥物。希望本文結(jié)果可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用消毒劑提供一定的參考。